衣康酸和衣康酸甲酯生产的制作方法
【专利说明】衣康酸和衣康酸甲酯生产 发明领域
[0001] 本发明涉及能够生产衣康酸和/或衣康酸甲酯的重组微生物，和利用这种细胞生 产衣康酸和/或衣康酸甲酯的方法。本发明还涉及发酵液，其包含通过这种方法能够获得 的衣康酸和/或衣康酸甲酯。
[0002] 发明背景
[0003] 衣康酸是多种产品（例如，丙烯酸纤维、橡胶、人造钻石和镜头）的必须前体，其在 化学工业中需求很高。通常，衣康酸分离自丝状真菌Aspergillus terreus。此外，衣康酸 酯可以是商品和专用化学品二者的重要中间体。在这方面，衣康酸单甲酯（即，4-甲基衣康 酸酯和1-甲基衣康酸酯）尤其令人关注。
[0004] 在近期，已通过过表达顺-乌头酸脱羧酶（CAD)和/或推定的衣康酸转运体 来遗传修饰 Aspergillus niger 以产生衣康酸（W02009014437、W02009104958)。然而， Aspergilli不太适合衣康酸的工业生产，因为其丝状形态导致大规模生物反应器中的氧传 递问题。
[0005] 还已通过过表达CAD联合降低的异柠檬酸脱氢酶（I⑶）活性来遗传修饰E. coli 以产生衣康酸（US2010285546)。然而，这种方法是有问题的，因为E. coli和通常的原核生 物不耐受低pH。在高pH发酵（例如约pH7,这对E. coli是最佳的）中，需要滴定以保持pH 恒定，这导致衣康酸盐而非衣康酸的形成。这继而导致增加的DSP成本，因为相较于低pH 发酵方法（其中可通过结晶从发酵液中直接回收酸），从盐中回收酸更加复杂。
[0006] 在更近期，非丝状酵母Yarrowia Iipolytica已被遗传修饰以基于甘油生产衣康 酸（US20110053232)。然而，经修饰的Y. Iipolytica基于糖（可最常获得的可再生原料之 一）不产生显著量的衣康酸。
[0007] 因此，需要进一步改进基于在低pH下由糖发酵的衣康酸生产方法，从而可在工业 生物反应器中实现经济上可行的大规模生产。
[0008] 发明概沐
[0009] 本发明基于出乎意料的重组细胞（即遗传修饰的细胞）的鉴定，所述细胞可产生 衣康酸和/或衣康酸的酯。这些细胞可以是酵母细胞。酵母的优点为：它耐受低PH并且不 是丝状的，这允许以最佳方法条件产生衣康酸和/或衣康酸甲酯。
[0010] 因此，本发明涉及重组细胞，其能够产生4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣康酸酯的一 种或多种。
[0011] 本发明还涉及重组酵母细胞，其能够产生衣康酸并且其过表达：
[0012] -编码具有顺乌头酸脱羧酶活性的多肽的核酸；和
[0013] -编码催化朝向乙酰CoA的反应的多肽的核酸。
[0014] 本发明的重组细胞可被用于生产衣康酸和/或衣康酸的酯的方法中。因此，本发 明提供：
[0015] -用于生产4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣康酸酯的方法，所述方法包括：在合适的 发酵培养基中发酵根据本发明的重组细胞，其中4-甲基衣康酸酯或1-甲基衣康酸酯被生 产；
[0016] -用于生产衣康酸或衣康酸的酯的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中 发酵根据本发明的酵母细胞，其中衣康酸或衣康酸的酯被生产。
[0017] 衣康酸或衣康酸的酯可被进一步转化成药品、化妆品、食品、饲料或化学产品。
[0018] 此外，本发明提供发酵液，其包含通过本发明的方法能够获得的衣康酸和/或衣 康酸的酯。
[0019] 附图简沐
[0020] 图la-d展示了允许衣康酸生产的代谢途径。编号的反应展示了如下的可被过表 达的酶。反应（1):丙酮酸羧化酶。细胞溶胶丙酮酸（pyruvate)和碳酸氢醋/盐转化为草 酰乙酸（oxaloacetate)。反应（2):线粒体草酰乙酸转运体。细胞溶胶草酰乙酸转运至线 粒体草酰乙酸。反应（3):线粒体膜柠檬酸转运体。线粒体柠檬酸（citrate)转运至细胞溶 胶柠檬酸以及反之。反应（4):乌头酸酶。柠檬酸转化为乌头酸（aconitate)。反应（5):顺 乌头酸脱羧酶。顺乌头酸转化为衣康酸（itaconate)。反应(6):衣康酸转运体。细胞溶胶 衣康酸转运至胞外衣康酸。反应（7):柠檬酸合酶。细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为 朽 1 檬酸。反应（8):乙酰化乙醛脱氢酶（acetylating acetaldehyde dehydrogenase)。细 胞溶胶乙醛、NAD和辅酶A转化为乙酰辅酶A和NADH。反应（9):磷酸酮醇酶。木酮糖5-磷 酸转化为乙酰磷酸（acetyl phosphate)、甘油醛3-磷酸和水；或者果糖6-磷酸转化为乙 酰磷酸、赤藓糖4-磷酸和水。反应（10):磷酸乙酰转移酶。辅酶A和乙酰磷酸转化为乙酰 辅酶A和磷酸（phosphate)。反应（11) :ATP:乙酸磷酸转移酶。乙酸（acetate)和ATP转 化为乙酰磷酸和ADP。通过较粗箭头强调的反应是预期与从葡萄糖向衣康酸和/或衣康酸 转化相关的反应。
[0021] 图2展示了允许衣康酸的酯生产的代谢途径。
[0022] 序列表描沐
[0023] 序列描述展不于表4、5和6中。可参考序列表或参考同样在表4、5和6中展不的 数据库登录号来定义本文中所述序列。
[0024] 发明详沐
[0025] 贯穿本说明书和所附权利要求，词语"包含"、"包括"和"具有"以及它们的变体应 被解释为包含性的。换言之，当语境允许时，这些词语旨在表达可能包含未明确列举的其它 要素或整体。
[0026] 本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种（即，一个/种或至 少一个/种）语法对象。例如，"要素"可表示一个/种要素或多于一个/种要素。
[0027] 在Aspergillus terreus中，从顺-乌头酸（三羧酸循环的中间体）合成衣康酸。 负责将顺-乌头酸转化为衣康酸的酶是顺-乌头酸脱羧酶。我们已经展示了 ：可在重组细 胞中过表达这种酶以使通常不产生衣康酸的细胞可产生衣康酸。过表达一种或多种催化向 乙酰-CoA的反应的酶可以进一步提高衣康酸产物的量。此外，这种重组细胞可通过过表达 一种或多种导致产生衣康酸的酯的酶而产生这种酯。
[0028] 在本发明的语境中，过表达表示：给定的核酸序列和/或氨基酸序列在本发明的 重组细胞中比在参照细胞中更高程度地表达，其中所述参照细胞典型地可为相应的野生型 细胞（即，相同物种的野生型细胞）。核酸和/或多肽可以是过表达的，在这种意义上，在参 照细胞中表达的核酸和/或多肽在本发明的重组细胞中更高程度地表达（参照细胞可根本 不表达核酸和/或多肽）。过表达可例如通过对参照细胞内源的（或同源的）核酸和/或 多肽的过表达发生。过表达可例如通过对参照细胞外源的（或异源的）核酸和/或多肽的 过表达发生。换言之，过表达可例如通过天然存在于参照细胞中的核酸和/或多肽的过表 达发生。过表达可例如通过参照细胞中根本不存在或不表达的核酸和/或多肽的过表达发 生。
[0029] 本发明的重组细胞可过表达至少一种外源核酸和/或多肽以及过表达至少一种 内源核酸和/或多肽。
[0030] 除非另外说明，本文中提到羧酸或羧酸酯（例如衣康酸/衣康酸酯）应被理解为 包括质子化的羧酸（游离酸）、相应的羧酸根（其共轭碱）及其盐。
[0031] 因此，根据本发明，提供重组酵母，其包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序 列编码（或者，任选地过表达）：
[0032] 具有顺-乌头酸脱羧酶活性的多肽；和
[0033] 导致向乙酰-CoA的流增加的遗传修饰。
[0034] 根据本发明，通过增加产生一种或多种前体（包括顺乌头酸、柠檬酸、草酰乙酸、 乙酰辅酶A和乙酰磷酸）的多种代谢反应速率的组合来实现水平提高的衣康酸和衣康酸甲 酯生产。换言之，编码进行这些反应的多肽的核酸序列可被过表达。
[0035] 因此，可将两个或更多个下述反应的组合组织成一个或多个代谢途径（下述编号 遵循图la-d中所示的）：
[0036] 反应（1):丙酮酸羧化酶。细胞溶胶丙酮酸和碳酸氢酯/盐转化为草酰乙酸。
[0037] 反应⑵：线粒体草酰乙酸转运体。细胞溶胶草酰乙酸转运至线粒体草酰乙酸。
[0038] 反应（3):线粒体膜柠檬酸转运体。线粒体柠檬酸转运至细胞溶胶柠檬酸以及反 之。
[0039] 反应（4):乌头酸酶。柠檬酸转化为乌头酸。
[0040] 反应（5):顺乌头酸脱羧酶。顺乌头酸转化为衣康酸。
[0041] 反应（6):衣康酸转运体。细胞溶胶衣康酸转运至胞外衣康酸。
[0042] 反应（7):梓檬酸合酶。细胞溶胶草酰乙酸和乙酰辅酶A转化为柠檬酸。
[0043] 反应（8):乙酰化乙醛脱氢酶。细胞溶胶乙醛、NAD和辅酶A转化为乙酰辅酶A和 NADH。
[0044] 反应（9):磷酸酮醇酶。木酮糖5-磷酸转化为乙酰磷酸、甘油醛3-磷酸和水；或 者果糖6-磷酸转化为乙酰磷酸、赤藓糖4-磷酸和水。
[0045] 反应（10):磷酸乙酰转移酶。辅酶A和乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A和磷酸。这种 酶可被称为乙酰-CoA:Pi乙酰转移酶或乙酰-CoA:磷酸乙酰转移酶。
[0046] 反应（11) :ATP:乙酸磷酸转移酶。乙酸和ATP转化为乙酰磷酸和ADP。
[0047] 一些优选的组合为：
[0048] A :反应（1)、（2)、（3)、（4)、（5)和（6)_ 参见图 la。
[0049] B :反应（1)、（8)、（7)、（4)、（5)和（6)_ 参见图 lb。
[0050] C :反应（1)、（9)、（10)、（7)、（4)、（5)和（6)-参见图 lc。
[0051] D :反应（I)、（11)、（10)、（7)、（4)、（5)和（6)-参见图 Id。
[0052] 编码进行所述反应的多肽的任何合适核酸序列均可被用于本发明中。一些实例包 括：
[0053] 反应（I) :SEQ ID N0:25或与其序列同一性为至少50% (或与其序列同一性为至 少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 % )的 序列。
[0054] 反应⑵：SEQ ID N0:23或与其序列同一性为至少50% (或与其序列同一性为至 少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 % )的 序列。
[0055] 反应（3) :SEQ ID NO: 21或47或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少 50% (或与其序列同一性为至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98 %或至少99%)的序列。
[0056] 反应（4) :SEQ ID NO: 15、17或19或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至 少50% (或与其序列同一性为至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98 %或至少99%)的序列。
[0057] 反应（5) :SEQ ID N0:7、9、ll或13或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至 少50% (或与其序列同一性为至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98 %或至少99%)的序列。
[0058] 反应（6) :SEQ ID NO: 1、3或5或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少 50% (或与其序列同一性为至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98 %或至少99%)的序列。
[0059] 反应（7) :SEQ ID N0:27、29或31或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至 少50% (或与其序列同一性为至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98 %或至少99%)的序列。
[0060] 反应⑶：SEQ ID N0:33或与其序列同一性为至少50% (或与其序列同一性为至 少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 % )的 序列。
[0061] 反应（9) :SEQ ID NO:35或37或与所述序列中的任何一种的序列同一性为至少 50% (或与其序列同一性为至少60%、至少70%、至少7