除草剂耐受性基因及其使用方法与流程

本申请要求2014年10月15日提交的美国临时申请No.62/064,343的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

序列表的并入

118,364字节(在MS-WINDOWS中测量)且在2015年9月25日创建的包括于命名为“MONS378WO_ST25”的文件中的序列表通过电子提交方式与此一起提交且以引用的方式并入本文。

发明背景

发明领域

本发明总体上涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及编码降解除草剂的酶的重组DNA分子。本发明还涉及含有重组DNA分子的转基因植物、部分、种子、细胞和植物部分，以及使用它们的方法。

相关技术描述

农作物生产通常利用使用生物技术方法产生的转基因性状。将异源基因(也称为转基因)引入植物中以产生转基因性状。转基因在植物中的表达赋予植物以期望的性状，如除草剂耐受性。转基因除草剂耐受性性状的实例包括草甘膦耐受性、草铵膦耐受性和麦草畏耐受性。随着对最常用的除草剂有抗性的杂草物种的增加，在所述领域中需要新的除草剂耐受性性状。特别感兴趣的除草剂是芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂提供对一系列抗草甘膦杂草的控制，从而产生赋予这些除草剂耐受性的特别用于与其他除草剂耐受性性状组合的作物系统中的性状。

从2,4-滴丙酸(dichloroprop)降解土壤样品分离的食除草剂鞘脂菌(Sphingobium herbicidovorans)菌株MH被鉴定为能够裂解各种苯氧基烷酸(phyenoxyalkanoic acid)除草剂的醚键，从而利用此作为其生长的唯一碳源和能量来源(HPE Kohler,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology(1999)23:336-340)。除草剂的分解代谢通过两种不同的对映选择性α-酮戊二酸依赖性双加氧酶RdpA(R-2,4-滴丙酸双加氧酶)和SdpA(S-2,4-滴丙酸双加氧酶)进行。(A Westendorf,等人,Microbiological Research(2002)157:317-322；Westendorf,等人,Acta Biotechnologica(2003)23(1):3-17)。RdpA已自食除草剂鞘脂菌(GenBank登录AF516752(DNA)和AAM90965(蛋白质))和食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)(GenBank登录NG_036924(DNA)和YP_009083283(蛋白质))(TA Mueller,等人,Applied and Environmental Microbiology(2004)70(10):6066-6075。)RdpA和SdpA基因已经用于植物转化以赋予作物以除草剂耐受性(TR Wright,等人,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,(2010)107(47):20240-5)。使用蛋白质工程化技术改进RdpA酶的活性以产生用于转基因植物的蛋白质将允许更高的除草剂施加率，从而改进转基因作物安全性和杂草控制措施。

发明概述

本发明提供一种多肽，所述多肽与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一个实施方案中，所述多肽对至少一种选自由以下组成的组的除草剂具有加氧酶活性：AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。

本发明提供一种重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一个实施方案中，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:2、3、5、6、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45和53-59。在另一个实施方案中，所述重组DNA分子编码对至少一种选自由以下组成的组的除草剂具有加氧酶活性的多肽：AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。在另一个实施方案中，所述重组DNA分子可操作地连接至在植物细胞中有功能的异源启动子。在另一个实施方案中，所述重组DNA分子可操作地连接至编码叶绿体转运肽的DNA分子，所述叶绿体转运肽用于将可操作地连接的多肽定位在细胞内。

本发明提供一种DNA构建体，所述DNA构建体包含在植物细胞中有功能的异源启动子，所述异源启动子可操作地连接至重组DNA分子，所述重组DNA分子包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一个实施方案中，所述重组DNA分子可操作地连接至编码叶绿体转运肽的DNA分子，所述叶绿体转运肽用于将可操作地连接的多肽定位在细胞内。在另一个实施方案中，所述重组DNA分子编码具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52，并且所述多肽在转基因植物中的表达赋予植物除草剂耐受性。在另一个实施方案中，所述DNA构建体存在于转基因植物的基因组中。

本发明提供一种包含重组DNA分子的转基因植物、种子、细胞或植物部分，所述重组DNA分子包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。在一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含对至少一种选自由以下组成的组的除草剂的耐受性的转基因性状：AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。在另一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含本发明的DNA构建体。在另一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含本发明的多肽。

本发明提供一种用于赋予植物、种子、细胞或植物部分除草剂耐受性的方法，所述方法包括在所述植物、种子、细胞或植物部分中表达本发明的多肽。在一个实施方案中，所述用于赋予除草剂耐受性的方法与包含含有本发明的重组DNA分子的转基因性状的转基因植物、种子、细胞或植物部分一起使用。在一个实施方案中，所述用于赋予除草剂耐受性的方法与选自由以下组成的组的除草剂一起使用：AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。

本发明提供一种植物转化方法，所述方法包括将本发明的DNA构建体引入植物细胞中并且从其再生包含所述DNA构建体并且对至少一种选自由以下组成的组的除草剂耐受的植物：AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。在一个实施方案中，所述植物转化方法包括使所述再生的植物与其本身或与第二植物杂交并且从所述杂交收集种子。

本发明提供一种用于通过使包含本发明的转基因植物或种子的植物生长区与至少一种选自由以下组成的组的除草剂接触来控制植物生长区中的杂草的方法：AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂，其中所述转基因植物或种子对所述除草剂具有耐受性。

附图简述

图1.精喹禾灵处理后的对照和MON-HT55(SEQ ID NO:11)转基因玉米植物。图1A示出未处理或用1X精喹禾灵(0.08lb ai/英亩)处理的对照和转基因玉米植物。图1B示出F1杂交对照玉米植物，并且图1C示出F1杂交MON-HT55转基因玉米植物。植物在(1)20℃/20℃，(2)28℃/20℃，或(3)38℃/30℃的白天/夜间温度下生长，然后用2X精喹禾灵喷洒。

图2.示出工程化蛋白质的温度依赖性活性的图。图2A示出当用精喹禾灵作为底物测试时，MON-HT55(SEQ ID NO:11)和野生型RdpA酶的活性。图2B示出当用精喹禾灵作为底物测试时，MON-HT1(SEQ ID NO:14)、MON-HT2(SEQ ID NO:18)、MON-HT7(SEQ ID NO:34)、MON-HT8(SEQ ID NO:37)和野生型RdpA的活性。图2C示出当用2,4-D作为底物测试时，MON-HT1、MON-HT2、MON-HT7、MON-HT8和野生型RdpA的活性。将数据标准化为在25℃下每种蛋白质的活性。

图3.野生型RdpA(SEQ ID NO:60)的蛋白质序列，其中适用于蛋白质工程化的示例性氨基酸位置加框。

图4.在2X精喹禾灵(0.16lb ai/英亩)(4A、4B和4C)或4X 2,4-D(4lb ae/英亩)(4D和4E)施加至表达MON-HT55(SEQ ID NO:11)、MON-HT1(SEQ ID NO:14)、MON-HT2(SEQ ID NO:18)、MON-HT3(SEQ ID NO:22)、MON-HT4(SEQ ID NO:25)、MON-HT7(SEQ ID NO:34)的F1杂交玉米植物(表达MON-HT x MON89034近交体的纯合R1)或F1杂交体对照(NK603x MON89034)之后的平均损伤评级。在施加2X精喹禾灵(图4A)或4X 2,4-D(图4D)之前，来自在设定于20℃的白天和夜间温度(20℃/20℃)下适应的植物的数据；图4B示出来自在施加2X精喹禾灵之前在28℃的白天温度和20℃的夜间温度(28℃/20℃)下适应的植物的数据；图4C示出来自在施加2X精喹禾灵(图4C)或4X 2,4-D(图4E)之前在38℃的白天温度和30℃的夜间温度(38℃/30℃)下适应的植物的数据。

图5.图5A和5B：在有CTP或无CTP的情况下包含MON-HT2(SEQ ID NO:20，编码SEQ ID NO:18)的对照和转基因玉米植物，其中所述植物以16×速率(1.28lb ai/英亩)接受以V2、随后V4施加的喹禾灵，并且在精喹禾灵施加后10至14天拍摄照片。

图6A-图6E.来自食除草剂鞘脂菌的野生型RdpA(SEQ ID NO:60)和SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52的蛋白质序列的多序列比对，其中在图6A、6B、6C、6D、6E中每一个的底部提供共有序列(提供为SEQ ID NO:61)。

序列简述

SEQ ID NO:1-3是MON-HT51的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:4-6是MON-HT52的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:7-8是MON-HT53的氨基酸序列和细菌密码子多核苷酸序列。

SEQ ID NO:9-10是MON-HT54的氨基酸序列和细菌密码子多核苷酸序列。

SEQ ID NO:11-13是MON-HT55的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:14-17是MON-HT1的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列、单子叶密码子优化的多核苷酸序列和双子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:18-21是MON-HT2的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列、单子叶密码子优化的多核苷酸序列和双子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:22-24是MON-HT3的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:25-27是MON-HT4的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:28-30是MON-HT5的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:31-33是MON-HT6的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:34-36是MON-HT7的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:37-39是MON-HT8的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:40-42是MON-HT9的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:43-45是MON-HT10的氨基酸序列、细菌密码子多核苷酸序列和单子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:46-52是MON-HT11、MON-HT13、MON-HT14、MON-HT15、MON-HT16、MON-HT17和MON-HT18的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53-59是MON-HT11、MON-HT13、MON-HT14、MON-HT15、MON-HT16、MON-HT17和MON-HT18的双子叶密码子优化的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:60是来自食除草剂鞘脂菌的野生型RdpA的氨基酸序列。

SEQ ID NO:61是图6A-图6E的共有序列。

发明详述

提供以下定义和方法以更好地限定本发明并指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另外说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

本发明通过提供本文称为MON-HT蛋白的新颖工程化蛋白质和编码它们的重组DNA分子以及使用这些的组合物和方法来克服现有技术的局限性。MON-HT蛋白是能够使芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂失活的加氧酶。如本文所用，使除草剂失活意指使除草剂不再具有其针对植物的除草活性。MON-HT蛋白表现出新颖的底物选择性、有用的酶动力学和在高温下增加的酶稳定性。表达MON-HT蛋白的转基因植物表现出对AOPP、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂施加的改善的耐受性。

工程化蛋白质和重组DNA分子

本发明提供新颖的工程化蛋白质和编码它们的重组DNA分子。如本文所用，术语“工程化的”是指通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然DNA、蛋白质或生物体。“工程化蛋白质”是在实验室中使用一种或多种蛋白质工程化技术，如使用定点诱变的蛋白质设计和使用随机诱变和DNA改组的定向进化来设想和创建其多肽序列的蛋白质。例如，工程化蛋白质可相对于野生型蛋白质的编码序列具有一个或多个缺失、插入或取代，并且每个缺失、插入或取代可由一个或多个氨基酸组成。工程化蛋白质的实例在本文提供为SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。

本发明提供的工程化蛋白质是具有加氧酶活性的酶。如本文所用，术语“加氧酶活性”意指通过将氧从分子氧转移至底物、副产物或中间物来氧化底物的能力。本发明提供的工程化蛋白的加氧酶活性可使AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂中的一种或多种失活。

如本文所用，“野生型”意指天然存在的。如本文所用，“野生型DNA分子”、“野生型多肽”或“野生型蛋白质”是天然存在的DNA分子、多肽或蛋白质，即在自然界中预先存在的DNA分子、多肽或蛋白质。多肽、蛋白质或DNA分子的野生型型式可适用于与工程化蛋白质或基因进行比较。适用于与本发明提供的工程化蛋白质比较的野生型蛋白质的实例是来自食除草剂鞘脂菌菌株MH的RdpA酶。适用于与本发明提供的重组DNA分子比较的野生型DNA分子的实例是来自食除草剂鞘脂菌菌株MH的RdpA基因。蛋白质或DNA分子的野生型型式可适用作实验中的对照。

如本文所用，“对照”意指为比较目的而设计的实验对照。例如，转基因植物分析中的对照植物是与实验植物(即其待测试的植物)相同类型但不含实验植物的转基因插入片段、重组DNA分子或DNA构建体的植物。适用于与转基因玉米植物比较的对照植物的实例是非转基因LH244玉米(美国专利号6,252,148)并且适用于与转基因大豆植物比较的对照植物的实例是非转基因A3555大豆(美国专利No.7,700,846)。

如本文所用，术语“重组”是指为遗传工程化的结果并且因此通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然DNA、多肽或蛋白质。“重组DNA分子”是包含不天然存在的并且因此是人为干预的结果的DNA序列的DNA分子，例如编码工程化蛋白质的DNA分子。另一个实例是由至少两个彼此异源的DNA分子(如编码蛋白质的DNA分子和可操作地连接的异源启动子)的组合组成的DNA分子。重组DNA分子的实例是包含至少一个选自以下的序列的DNA分子：SEQ ID NO:2、3、5、6、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45和53-59。“重组多肽”或“重组蛋白质”是包含不天然存在的氨基酸序列并且因此是人为干预的结果的多肽或蛋白质，例如工程化蛋白质。

术语“转基因”是指作为人为干预(如通过植物转化方法)的结果人工并入生物体基因组中的DNA分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，“转基因性状”是指由并入植物基因组中的转基因的存在传递或赋予的特征或表型。作为这种基因组改变的结果，所述转基因植物是与相关的野生型植物明显不同的植物，并且转基因性状是未在野生型植物中天然发现的性状。本发明的转基因植物包含通过本发明提供的重组DNA分子和工程化蛋白质。

如本文所用，术语“异源”是指源自不同来源且因此在自然界中通常不相关的两种或更多种物质之间的关系。例如，编码蛋白质的重组DNA分子相对于可操作地连接的启动子是异源的，如果这种组合在自然界中通常不存在。此外，当特定重组DNA分子不天然存在于所述特定细胞或生物体中时，其可相对于其所插入的细胞或生物体是异源的。

如本文所用，术语“编码蛋白质的DNA分子”或“编码多肽的DNA分子”是指包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的DNA分子。“编码蛋白质的序列”或“编码多肽的序列”意指编码蛋白质或多肽的DNA序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的顺序排列。编码蛋白质的序列或编码多肽的序列的边界通常由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子决定。编码蛋白质的分子或编码多肽的分子可包含编码蛋白质或多肽序列的DNA序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”、“多肽表达”、“表达蛋白质”和“表达多肽”意指通过将DNA分子转录成信使RNA(mRNA)并且将mRNA翻译成多肽链(其可最终折叠成蛋白质)的过程产生蛋白质或多肽。编码蛋白质的DNA分子或编码多肽的DNA分子可以可操作地连接至DNA构建体中的异源启动子，以用于在用重组DNA分子转化的细胞中表达蛋白质或多肽。如本文所用，“可操作地连接”是指以使得一个DNA分子可影响另一个DNA分子的功能的方式连接的两个DNA分子。可操作连接的DNA分子可以是单个连续分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，启动子与DNA构建体中的编码蛋白质的DNA分子或编码多肽的DNA分子可操作地连接，其中两个DNA分子被排列成使得所述启动子可影响转基因的表达。

如本文所用，“DNA构建体”是包含两个或更多个异源DNA序列的重组DNA分子。DNA构建体适用于转基因表达，并且可包含在载体和质粒中。DNA构建体可出于转化(即将异源DNA引入宿主细胞中)的目的用于载体中以便产生转基因植物和细胞，并且因此也可包含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的质粒DNA或基因组DNA中。如本文所用，“载体”意指可用于植物转化目的的任何重组DNA分子。如序列表中所示的重组DNA分子可例如作为构建体的一部分插入载体中，所述构建体具有可操作地连接至启动子的重组DNA分子，所述启动子在植物中起作用以驱动由所述重组DNA分子编码的工程化蛋白质的表达。用于构建DNA构建体和载体的方法是本领域中熟知的。DNA构建体或包含DNA构建体的载体的组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：用于表达可操作地连接的DNA的合适启动子、可操作地连接的编码蛋白质非人DNA分子和3'非翻译区(3’-UTR)。适用于实践本发明的启动子包括在植物中起作用以表达可操作地连接的多核苷酸的启动子。此类启动子是多种多样的且是本领域中熟知的，并且包括诱导型的、病毒的、合成的、组成型、时间调控型的、空间调控型的和/或时空调控型的。另外的任选组分包括但不限于以下元件中的一个或多个：5'-UTR、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、叶绿体转运肽(CTP)和一个或多个选择性标记转基因。

本发明的DNA构建体可包含可操作地连接至本发明提供的编码蛋白质的DNA分子的CTP分子。适用于实践本发明的CTP包括用于促进工程化蛋白分子在细胞内定位的那些。通过促进细胞内的蛋白质定位，CTP可增加工程化蛋白质的积累，保护其免受蛋白水解降解，增强除草剂耐受性水平，并且由此降低除草剂施加后的损伤水平。用于本发明的CTP分子是本领域中已知的，包括但不限于拟南芥EPSPS CTP(Klee等人,1987)、矮牵牛EPSPS CTP(della-Cioppa等人,1986)、玉米cab-m7信号序列(Becker等人,1992；PCT WO 97/41228)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(Creissen等人,1991；PCT WO 97/41228)。

本发明的重组DNA分子可通过本领域中已知的方法完全或部分地合成和修饰，特别是在期望提供适用于DNA操作的序列(如限制性酶识别位点或重组-基因克隆位点)、植物优选序列(如植物密码子使用或Kozak共有序列)或适用于DNA构建体设计的序列(如间隔区或接头序列)的情况下。本发明包括重组DNA分子和工程化蛋白质，所述重组DNA分子和工程化蛋白质与本文提供的重组DNA分子或工程化蛋白质序列中的任一个，例如与包含选自由以下组成的组的序列的重组DNA分子具有至少约80％(百分比)序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性：SEQ ID NO:2、3、5、6、8、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45和53-59。如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“％序列同一性”是指在最佳比对两个序列时(在比较窗内具有总计少于参考序列的20％的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)，与测试(“主题”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中的相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域的技术人员所熟知的并且可由以下工具实施：如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，并且由这些算法的计算机化实现方式来实施，如使用默认参数的作为Wisconsin(Accelrys Inc.,San Diego,CA)、MEGAlign(DNAStar,Inc.,1228S.Park St.,Madison,Wis.53715)和MUSCLE(3.6版)(RC Edgar,Nucleic Acids Research(2004)32(5):1792-1797)的一部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同组分的数目除以参考序列片段中组分的总数，即整个参考序列或参考序列的较小限定部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个序列的比较可以是针对全长序列或其一部分，或针对更长的序列。

可通过改变(即修饰)野生型蛋白质以产生具有有用蛋白质特征(如改变的Vmax、Km、底物特异性、底物选择性和蛋白质稳定性)的新颖组合的新蛋白质来产生工程化蛋白质。修饰可在蛋白质中的特定氨基酸位置进行，并且可以是在自然界(即在野生型蛋白质中)中在所述位置发现的氨基酸被不同的氨基酸取代。相对于适用于蛋白质工程化的野生型蛋白质RdpA(SEQ ID NO:60)的蛋白质序列的示例性氨基酸位置示于图3中。图6A、6B、6C、6D、6E提供野生型RdpA蛋白质序列与工程化蛋白质序列SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52的多序列比对。可设计工程化蛋白质，所述工程化蛋白质与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52，并且包含这些氨基酸突变中的至少一种。因此，本发明提供的工程化蛋白质提供相对于在自然界中发现的野生型蛋白质具有一种或多种改变的蛋白质特征的新蛋白质。在本发明的一个实施方案中，与类似的野生型蛋白质或此类特征的任何组合相比，工程化蛋白质具有改变的蛋白质特征，如针对一种或多种除草剂的改进的或降低的活性或改进的蛋白质稳定性。在一个实施方案中，本发明提供工程化蛋白质和编码其的重组DNA分子，其与选自由以下组成的组的工程化蛋白质序列具有至少约80％序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性：SEQ ID NO:1、4、7、9、11、14、18、22、25、28、31、34、37、40、43和46-52。氨基酸突变可作为蛋白质中的单个氨基酸取代或与一种或多种其它突变(如一个或多个其它氨基酸取代、缺失或添加)的组合进行。可如本文所描述或通过本领域的技术人员已知的任何其它方法进行突变。

转基因植物

本发明的一个方面包括包含本发明提供的重组DNA分子和工程化蛋白的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子。包含重组DNA分子和工程化蛋白质的这些细胞、组织、植物和种子显示对芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂中的一种或多种的除草剂耐受性。

用于转化用于本发明的宿主植物细胞的合适方法实际上包括可将DNA引入细胞(例如，其中重组DNA构建体稳定整合至植物染色体中)的任何方法并且在本领域中是已知的。用于将重组DNA构建体引入植物中的示例性和广泛使用的方法是土壤杆菌属转化系统，其是本领域的技术人员熟知的。转基因植物可通过植物细胞培养的方法从转化的植物细胞再生。关于转基因纯合的转基因植物(即，转基因的两个等位基因拷贝)可通过将包含单个转基因等位基因的转基因植物与其自身(例如R0植物)自花授粉(自交)以产生R1种子。所产生的R1种子的四分之一对于转基因将是纯合的。通常使用SNP测定、DNA测序或允许杂合子与纯合子之间的区别的热扩增测定来测试从发芽的R1种子生长的植物的接合性，称为接合性测定。

本发明提供的植物、种子、植物部分、植物组织和细胞显示对AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂中的一种或多种的除草剂耐受性。AOPP除草剂靶向植物的乙酰基辅酶A羧化酶(ACCase)，其是脂肪酸生物合成途径的一部分。草植物对这些除草剂敏感，因为它们在其质体和细胞质中含有除草剂敏感的ACCase。AOPP除草剂是本领域中熟知的且可商购的。AOPP除草剂的实例包括但不限于，炔草酸(clodinafop)、氰氟草酯(cyhalofop)、禾草灵(diclofop)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P)、噻唑禾草灵(fenthiaprop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、异噁草醚(isoxapyrifop)、噁唑酰草胺(metamifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾灵、精喹禾灵和三氟禾草肟(trifop)。苯氧基酸和吡啶基氧基酸除草剂是类似于植物生长激素吲哚乙酸(IAA)的合成植物生长素。阔叶植物对这些除草剂敏感，其诱导快速、不受控制的生长，最终杀死植物。苯氧基酸除草剂的实例包括但不限于2,4-D；2,4-DB；稗草胺(clomeprop)；2,4-滴丙酸；涕丙酸；MCPA；MCPB和2-甲-4-氯丙酸(mecoprop)。吡啶基氧基酸除草剂的实例包括但不限于绿草定(triclopyr)；氟草烟(fluroxypyr)；氯氨吡啶酸(aminopyralid)；二氯吡啶酸(clopyralid)和毒莠定(picloram)。

除草剂可施加至包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域作为控制杂草的方法。本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状，且因此耐受一种或多种AOPP除草剂或苯氧基酸除草剂或吡啶基氧基酸除草剂的施加。除草剂施加可以是推荐的商业速率(1X)或其任何分数或倍数，如推荐商业速率的两倍(2X)。除草剂速率可表示为每磅每英亩的酸当量(lb ae/英亩)或磅活性成分每英亩(lb ai/英亩)。除草剂施加包含至少一种选自由以下组成的组的除草剂：AOPP除草剂和苯氧基酸除草剂和吡啶基氧基酸除草剂。在施加除草剂时，植物生长区可包括或可不包括杂草植物。用于在控制杂草的区域中使用的AOPP除草剂的除草有效剂量在生长季节中应该由约0.01lb ai/英亩至约16lb ai/英亩的范围组成。例如，精喹禾灵的1X速率将是0.08lb ai/英亩的速率。用于在控制杂草的区域中使用的苯氧基酸除草剂的除草有效剂量在生长季节中应该由约0.01lb ae/英亩至约16lb ae/英亩的范围组成。例如，2,4-D的1X速率将是约0.75lb ae/英亩至1.0lb ae/英亩的速率。用于在控制杂草的区域中使用的吡啶基氧基酸除草剂的除草有效剂量在生长季节中应该由约0.01lb ae/英亩至约16lb ae/英亩的范围组成。例如，氟草烟的1X速率将是约0.13至0.48lb ae/英亩的速率。

除草剂施加可依次与几种AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂、吡啶基氧基酸除草剂或任何其它相容性除草剂中的一种、两种或组合槽混。一种除草剂或两种或更多种除草剂组合或单独的多次施加可在生长季节内用于包含本发明的转基因植物的区域以用于控制广谱双子叶杂草、单子叶杂草或两者，例如，两次施加(如种植前施加和芽后施加或芽前施加和芽后施加)或三次施加(如种植前施加、芽前施加和芽后施加或芽前施加和两次芽后施加)。

如本文所用，“耐受性”或“除草剂耐受性”意指植物、种子、植物组织、植物部分或细胞抵抗一种或多种除草剂的毒性作用的能力。植物、种子、植物组织、植物部分或细胞的除草剂耐受性可通过将植物、种子、植物组织、植物部分或细胞与合适的对照进行比较来测量。例如，除草剂耐受性可通过将除草剂施加至包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组DNA分子的植物(测试植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组DNA分子的植物(对照植物)，且然后比较两种植物的植物损伤，其中测试植物的除草剂耐受性通过与对照植物的损伤率相比减少的损伤率指示。当与对照植物、种子、植物组织、植物部分或细胞相比时，除草剂耐受性植物、种子、植物组织、植物部分或细胞显示对除草剂的毒性作用的反应降低。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是与野生型植物或对照植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。

本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞和植物部分还可含有一种或多种另外的转基因性状。可通过使含有包含本发明提供的重组DNA分子的转基因的植物与含有另外的转基因性状的另一种植物杂交来引入另外的转基因性状。如本文所用，“杂交”意指培育两种单独的植物以产生子代植物。因此，两种转基因植物可杂交以产生含有转基因性状的子代。如本文所用，“子代”意指亲本植物的任何传代的后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一种亲本植物遗传的DNA构建体。或者，可通过用包含本发明提供的重组DNA分子的DNA构建体共转化所述另外的转基因性状的DNA构建体(例如，其中所有的DNA构建体呈现为用于植物转化的同一载体的部分)或通过将另外的性状插入包含本发明提供的DNA构建体的转基因植物中或反之亦然(例如，通过使用关于转基因植物或植物细胞的植物转化的任何方法)来引入另外的转基因性状。此类另外的转基因性状包括但不限于增加的昆虫抗性、增加的水利用效率、增加的产量性能、增加的抗旱性、增加的种子质量、改进的营养品质、杂交种种子生产和除草剂耐受性，其中性状是相对于野生型植物或对照植物测量的。此类另外的转基因性状是本领域的技术人员已知的；例如，美国农业部(USDA)动物和植物健康检查局(APHIS)提供了此类性状的列表，并且可在它们的网站www.aphis.usda.gov上找到。

含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可与本领域中通常已知的任何培育方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可在包含三种或更多种转基因性状的植物系中独立地分离、连接或两者的组合。还考虑与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的培育方法的描述是本领域的技术人员熟知的。为了证实转基因在特定植物或种子中的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如分子生物学测定，如DNA印迹和RNA印迹、PCR和DNA测序；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶或根测定；以及还有通过分析整株植物的表型。

作为回交转化过程的结果实现转基因性状向植物基因型的基因渗入。其中已经基因渗入转基因性状的植物基因型可称为回交转化的基因型、系、近交植物或杂交种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可称为未转化的基因型、系、近交植物或杂交种。

如本文所用，术语“包含”是指“包括但不限于”。

实施例

包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可用所获得的相同或相似的结果代替本文所述的试剂。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改被认为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。

实施例1：初始蛋白质工程化和酶分析

使用蛋白质工程化技术在实验室中构思和创建了新型工程化蛋白质和编码这些蛋白质的重组DNA分子。工程化蛋白质是具有加氧酶活性的酶，并且被工程化为具有改变的相对于野生型蛋白质使AOPP除草剂、苯氧基酸除草剂或两者失活的能力。

选择十六种具有加氧酶活性的已知蛋白质并用于产生共有同源序列比对。这与结构指导的分析组合使用以告知合理的设计策略。从这些分析中，选择各自长度为13至21个氨基酸的五个区域(在本文中被称为“岛”)用于诱变。使用本领域的技术人员已知的技术产生这些区域中的每一个中的突变，如丙氨酸扫描突变；同源性扫描突变；Pro/Gly扫描突变；区域互换或突变；以及这些各种技术的组合(参见，M Lehmann和M Wyss,Current Opinion in Biotechnology(2001)12(4):371-375；B Van den Burg和VGH Eijsink,Current Opinion in Biotechnology(2002)13(4):333-337；以及Weiss等人,Proc Natl Acad Sci U S A(2000)97(16):8950–8954)。使用这些方法，产生超过1,200种独特的工程化蛋白质和编码它们的重组DNA分子以用于进一步分析和表征。由于大量用于测试所产生的工程化蛋白质以及测试和比较每种蛋白质的酶活性的需要，开发了高通量细菌蛋白质表达和酶测定系统以用于使用粗细菌提取物进行快速分析。

通过合成编码每种工程化蛋白质的重组DNA分子并且将其克隆至具有可操作地连接至重组DNA分子的C-末端组氨酸标签(His-标签)的细菌表达载体中来实现高通量细菌蛋白质表达。将载体用于转化大肠埃希氏菌(Escherichia coli)(E.coli)，并且诱导工程化蛋白质的细菌表达。将过夜的大肠埃希氏菌培养物在96孔板中生长，并且将培养物离心以沉淀细菌。通过将100ul裂解主混合物(10ml细菌蛋白质提取试剂II(Pierce Biotechnology,Rockford,IL；目录号78260)；10ul溶菌酶(10ug/ml最终；Lysozyme American Bioanalytical,Natick,MA；目录号AB011780-00005)；和40ul核酸酶(100单位/ml最终，Novagen,Darmstadt,Germany；目录号71206-3)添加至每孔来裂解细菌团块。将所述板涡旋，随后在4℃下孵育30分钟。向每个孔中添加400ul的MOPS缓冲液(pH 6.57)，并且通过离心使碎片沉淀。小心地除去裂解物上清液并用作粗细菌提取物以用于随后的酶分析。

设计高通量除草剂降解酶测定以使用粗细菌提取物测定工程化蛋白质对各种除草剂的酶活性。通过终点比色测定利用通过测量来自4-氨基安替比林和铁氰化钾在510nm下的吸光度检测苯酚产物来测量工程化蛋白的加氧酶活性(即，其酶活性)。所述测定基于Fukomori和Hausinger，Journal of Biological Chemistry(1993)268(32):24311-24317中描述的测定。在96孔板中在150ul总体积中测定酶反应，所述总体积含有：20mM MOPS pH 6.75、50-200uM NH4FeSO4、50-200uM抗坏血酸钠、1mMα-酮戊二酸(aKG)、10ul含有表达的工程化蛋白质的大肠埃希氏菌细胞裂解物和底物(AOPP除草剂或苯氧基酸除草剂)。在与底物反应开始后，将板在各种温度下孵育不同时间，并且通过添加EDTA至6.25mM的终浓度或通过添加15ul pH 10缓冲液(50mM硼酸、50mM KCl)来猝灭(终止)，随后添加15ul 0.2％4-氨基安替比林和15ul0.8％铁氰化钾。在标准实验室光谱仪上进行吸光度测量。根据需要缩放测定以增强通量。使用纯化的蛋白质或产物标准品来产生标准曲线。

使用这种高通量细菌蛋白质表达和酶测定系统，相对于所选择的野生型蛋白质RdpA的活性，测量了大约1200种工程化蛋白质的活性。在96孔板测定中，存在3种对照(不含工程化蛋白质的粗细菌提取物)和3种阳性对照(具有野生型蛋白质的粗细菌提取物)。测量孔的吸光度，并且使用下式计算蛋白质活性：

其中，活性_i是样品的活性，吸光度_i是样品的吸光度，吸光度_WT是含有来自表达野生型酶的大肠埃希氏菌的提取物的孔的吸光度，并且吸光度_pET是含有来自无工程化蛋白质的大肠埃希氏菌的提取物的孔的吸光度。每种独特的工程化蛋白质的活性一式两份进行测量，并且报告为两次测量的平均值。

基于来自高通量酶测定系统的结果，选择大约545种独特的工程化蛋白质以用于使用纯化的工程化蛋白质的进一步分析。在纯化的工程化蛋白质制备测定中，根据制造商的方案使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen,Valencia,CA,目录号30230)来制备粗制细菌表达裂解物。

使用此实施例1中所描述的除草剂降解酶测定以AOPP除草剂喹禾灵作为底物来测定纯化的工程化蛋白质。纯化的工程化蛋白质测定的结果在很大程度上证实了来自高通量酶测定的结果。大约545种工程化蛋白质中的7种的测定结果显示在表1中，其中酶活性表示为样品的活性相对于野生型RdpA酶的活性(如在此实施例1中所描述来计算)。来自这些测定的这些数据产生出人意料的结果，即特异性突变的组合比其它突变的组合显著更好地进行，并且证明工程化蛋白质的酶活性可显著改变。

表1

使用从第一测定中获得的信息，然后如前所述进行蛋白质工程化以产生另外的工程化蛋白质，其如在此实施例1中所描述进行测试。使用精喹禾灵作为这些另外的工程化蛋白质中的5种的底物的高通量酶测定的结果提供在表2中。

表2

使用来自表2的5种工程化蛋白质进行进一步蛋白质表征，如Km、Vmax和晶体结构分析。对于此详细分析，如下制备纯化的蛋白质：将表达编码给定MON-HT蛋白的转基因的大肠埃希氏菌的2ml过夜培养物用于接种500ml肉汤，并且在37℃下生长4小时，然后在15℃下培养大约36小时。然后通过离心沉淀250ml的500ml细菌培养物，并且重新悬浮于25ml提取缓冲液(20mM Tris(pH 7.8)、300mM NaCl、5mMβ-巯基乙醇(BME)、20mM咪唑(Fluka/Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、125单位/ml的benzonase和10K单位/ml的溶菌酶(Novagen,Darmstadt,Germany)。将细胞浆液在20000psi下通过细胞破碎器一次，且然后通过在4℃下以35,000x g离心20分钟来澄清此细胞裂解物。含有可溶性His标记的蛋白质的上清液用于蛋白质纯化。对于此纯化，按照标准制造商的方案使用AKTaxpress^TM系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)将上清液施加至1ml HisTrap^TM FF柱(Nickel Sepharose)(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。洗涤缓冲液由以下组成：20mM Tris pH 7.8、300mM NaCl、20mM咪唑和5mM BME。洗脱缓冲液的组成与洗涤缓冲液相同，除了使用500mM咪唑。根据制造商的方案，将来自镍柱的洗脱液在Quick Spin Protein Sephadex G-25细柱(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)上脱盐。洗脱的蛋白质在由以下组成的缓冲液中：20mM Tris pH 7.8、50mM NaCl和5mM BME。通过SDS-PAGE分析评估蛋白质提取物纯度。通过Bradford测定使用Bio-Rad蛋白质测定染料试剂(Biorad,Hercules,CA,目录号500-0006)来测定蛋白质浓度。

使用此实施例1中所述的酶测定，但使用四种不同的AOPP除草剂作为底物来分析五种工程化蛋白质的纯化蛋白质：精喹禾灵、吡氟氯禾灵、噁唑禾草灵和吡氟禾草灵。使用2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)产生标准曲线，其用于产生一般的酚标准曲线。基于此标准曲线计算在测定中由工程化蛋白质产生的苯酚的量。对照是纯化的野生型酶、没有酶且没有底物。使用0、20、40、80、160、320、640或1280μM的精喹禾灵、吡氟氯禾灵、噁唑禾草灵或吡氟禾草灵除草剂进行五种工程化蛋白质的酶动力学测量。表3示出对于具有四种AOPP除草剂底物的五种蛋白质测量的Km和Vmax(表示为相对值)。具有四种AOPP除草剂中的每种作为底物的这五种工程化蛋白质的蛋白质特征证明，可通过蛋白质工程化显著改变工程化蛋白质的酶活性，即Km和Vmax。

表3

实施例2：玉米中工程化蛋白质的表达

构建植物转化载体，每个载体包含编码具有针对单子叶植物表达优化的蛋白质编码序列的三种工程化蛋白质(MON-HT51(SEQ ID NO:3)、MON-HT52(SEQ ID NO:6)和MON-HT55(SEQ ID NO:13))中的一种的重组DNA分子。使用启动子、前导序列、内含子和3'UTR以及有和无可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP的不同组合产生载体。载体中还包含第二DNA盒，所述DNA盒包含待在转基因植物中用于草甘膦耐受性的cp4-EPSPS编码序列。使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用这些载体转化未成熟玉米(LH244)胚。使再生的R0转基因小植物在温室中生长，并且在大约V2-V4生长阶段用0.04或0.08lb ai/英亩精喹禾灵(Assure^TMII,E.I.DuPont)喷洒，分别代表0.5X和1X速率。叶片样品用于鉴定具有单拷贝的转基因DNA插入片段(即，单事件植物)的转基因植物。使仅含有单拷贝并通过0.5X或1X精喹禾灵喷洒测试的R0植物自交以产生R1种子。用含有MON-HT52的构建体没有获得事件。从含有具有CTP的MON-HT51的构建体和从含有不含CTP的MON-HT51的构建体再生仅一个事件。转化两对含有MON-HT55的载体，每对仅在含有CTP或不含有CTP方面不同。

表达有或无可操作地连接的CTP的MON-HT55的R1植物在温室中生长，并且在V2生长阶段以0.08lb ae/英亩(1X)的速率施加精喹禾灵除草剂。处理后11天评价植物的损伤。将R1植物以典型的孟德尔比率(Mendelian ratio)分离性状，并且观察到在除草剂处理后不存活的预期数目(约25％)的无效分离子(不含有转基因性状的子代植物)。除了代表一个事件的那些之外，表达具有可操作地连接的CTP的MON-HT55的所有R1转基因植物在施加精喹禾灵后在最嫩的暴露的叶子上仅显示少量褪绿斑点。在施加除草剂后，对于这些植物没有记录超过5％的损伤分数。未喷洒的转基因植物也不与未喷洒的对照植物在表型上不同。图1A示出在施加精喹禾灵后18天的对照LH244植物和包含MON-HT55(SEQ ID NO:13)的转基因植物。

为了评估使用CTP将工程化蛋白质靶向植物细胞叶绿体的作用，比较了包含具有和不具有与蛋白质编码序列可操作地连接的CTP的转基因插入物的转基因植物。包含与蛋白质编码序列可操作地连接的CTP的植物与没有CTP的植物相比显示出对精喹禾灵的更好耐受性。在此实施例2中描述的R1温室测试中，包含与蛋白质编码序列可操作地连接的CTP的大多数转基因植物显示出完全精喹禾灵耐受性。不包含可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP的植物显示精喹禾灵耐受性，但具有一些中度损伤表型。这些结果表明，使用CTP将工程化蛋白质靶向植物细胞叶绿体增强了转基因植物的精喹禾灵耐受性。在使用包含有或无可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP的MON-HT51或者有或无可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP的MON-HT55的R1植物的性状功效田间试验中再次测试了这一出人意料的发现。这些R1植物是单拷贝的，但仍然是分离的。在此田间试验中，将种子种植在田地中并如下处理：在植物前2X(0.16lb ai/英亩)精喹禾灵、在V4生长阶段2X(0.14lb ai/英亩)吡氟氯禾灵、然后在V8生长阶段2X精喹禾灵。与不包含可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP的植物相比，更高百分比的包含可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP的植物在精喹禾灵和吡氟氯禾灵施加后存活，并且具有更低的损伤分数。数据提供于表4中。这证实了出人意料的发现，即可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP赋予用于工程化蛋白质的除草剂施加以更高的植物耐受性。

表4

进行近交性状功效田间试验以评估在近交背景下对AOPP除草剂的耐受性和对环己二酮(CHD)除草剂的敏感性。R2近交植物通过自交纯合的转基因R1植物并收集种子而产生。在两个田间位置处评价含有有或无CTP的MON-HT55或有CTP的MON-HT51的R2近交植物。除草剂处理是PRE(种植后但出苗前)施加的0.16lb ai/英亩的2X精喹禾灵，然后在V4生长阶段施加的0.16lb ai/英亩的精喹禾灵，然后在V8生长阶段施加的0.16lb ai/英亩的精喹禾灵。在除草剂施加后7-10天，将地块以0-100的标度针对作物损伤进行评级，其中零是没有受伤且100是完全作物死亡。使所有数据进行方差分析，并且在LSD(0.05)分离平均值。大多数近交的R1植物未显示损伤，从而证实有或无CTP的MON-HT55和MON-HT51两者赋予对玉米的精喹禾灵耐受性。为了测试对CHD除草剂(其对用于志愿者对照是合乎需要的)的敏感性，在V8生长阶段用1X速率的烯草酮(0.25lb ai/英亩)处理植物。使用1X速率的烯草酮的志愿者对照对所有测试的转基因植物是100％有效的。进行杂交性状功效田间试验以评估在杂交背景下对AOPP除草剂的耐受性和对环己二酮(CHD)除草剂的敏感性。通过使R1近交植物与非转基因植物杂交并收集种子来产生F1杂交植物。在六个田间位置处评价所得到的含有有或无CTP的MON-HT55(SEQ ID NO:13)或者无CTP的MON-HT51(SEQ ID NO:3)的F1植物。在一系列环境条件下在六个位置处进行杂交性状功效田间试验，包括田间季节期间的高热和干旱条件。这允许在高温和水胁迫条件下在玉米中评价工程化蛋白质。数据提供于表5中。在施加后7-10天，来自精喹禾灵的2X施加的初始损伤高于所需(>10％损伤)。植物最终从大多数损伤中生长，与V4生长阶段施加相比，V8生长阶段施加通常具有更少的损伤。当精喹禾灵非常早地施加时(例如，在VE-V2生长阶段)，也注意到过度损伤。

表5

使用基于植物的测定证实了以下发现：当在高温的田间条件下生长时，表达工程化蛋白质MON-HT55或MON-HT51的杂交植物对精喹禾灵施加敏感。设计基于植物的测定以在田间测试之前在生长室中测试对F1杂交种的精喹禾灵的耐受性。使用含有玉米事件NK603(美国专利No.8,273,959)x MON89034(美国专利No.8,581,047)的植物的F1杂交种和含有MON-HT55x MON89034的植物的F1杂交种来开发测定。F1杂交种子在生长室中发芽1周，且然后移至三个不同生长室中的一个，以在20℃/20℃、28℃/20℃和38℃/30℃的日/夜温度下适应两天，然后施加2X(0.16lb ai/英亩)精喹禾灵。如所预期，在所有温度方案中通过2X精喹禾灵施加严重损伤不含MON-HT55的植物(图1B)。含有MON-HT55的转基因植物当适应于20℃/20℃或28℃/20℃的昼/夜温度时对2X精喹禾灵施加的良好耐受性，但当适应于38℃/30℃的昼/夜温度时显示显著敏感性(图1C)。这证实了基于植物的测定可用于针对温度敏感活性筛选生长室中的植物中的蛋白质。

所述数据证明工程化蛋白质可在转基因植物中表达以赋予除草剂耐受性，并且未喷洒的转基因植物在表型上并未与未喷洒的对照植物不同。数据还证实植物中工程化蛋白质的表达允许使用CHD除草剂用于志愿者对照。出人意料地，数据表明使用CTP用于工程化蛋白质的叶绿体靶向增强了除草剂耐受性性状，并且由工程化蛋白质提供的除草剂耐受性是温度敏感的，从而在高温条件下降低。

实施例3：优化工程化蛋白质

当在高温田间条件下生长时，表达工程化蛋白质MON-HT55或MON-HT51的杂交事件对精喹禾灵施加是敏感的发现是出人意料的，并且提供了能够通过蛋白质工程化改变的另外蛋白质特征。开发了一系列新的体外酶测定和基于植物的酶活性测定来测试蛋白质对高温的敏感性。

为了产生针对在更高温度下的活性而优化的工程化蛋白质，将在前两轮蛋白质工程化中使用的蛋白质基序分析与几种工程化蛋白质的晶体结构数据组合。这用于通知如前所述进行的另外几轮的诱变，并且因此产生大约1400种另外的工程化蛋白质。将这些与实施例1中描述的大约1200种工程化蛋白质组合(总计大约2600种工程化蛋白质)以用于筛选新型温度敏感性测定来鉴定针对在更高温度下的活性优化的蛋白质。

为了分析这些工程化蛋白质在更高温度下的活性，修改实施例1中的体外酶测定以指定将所有测定组分预热至所需温度5分钟，然后合并组分且随后将反应维持在所需温度下持续反应的持续时间。为了标准化测定测量，使用精喹禾灵作为反应的底物，并且基于25℃读数将酶活性标准化。使用这些参数，计算酶活性为最大值的一半时的温度(T_1/2)。MON-HT55的T_1/2计算为29℃，且野生型RdpA的T_1/2计算为38℃(图2A)。

由于待测试的大量变体，所以使用五级筛选工艺。表6示出在不同筛选中测试的变体的近似数目。

表6

用大约2600种工程化蛋白质进行第一筛选，并且使用如实施例1中所描述的具有粗细菌裂解物的高通量细菌蛋白质表达和酶测定系统，但修改为在25℃和40℃的所需温度下进行，在25℃下进行猝灭后颜色显色。从此筛选，选择且推进了大约1250种工程化蛋白质。第二筛选是相似的，但包括样品中的蛋白质标准化。从此筛选，选择且推进了94种工程化蛋白质。第三筛选使用如实施例1中所述的除草剂降解酶测定的纯化蛋白质，但是修改为在25℃和40℃的所需温度下进行，在25℃下进行猝灭后颜色显色。从此筛选，选择且推进了47种工程化蛋白质。使用纯化的蛋白质进行第四筛选，将蛋白质浓度标准化，并且筛选包括精喹禾灵和(用于蛋白质变体的子集)2,4-D作为底物，在23℃和40℃下进行终点测定。从此筛选，选择且推进了13种工程化蛋白质。

对于第五筛选，产生和纯化11种工程化蛋白质中的每一种的重组蛋白质用于深入生物化学分析。此生物化学分析包括：(1)动态分析(Vmax和Km)，(2)在一定温度范围内的活性测定，(3)蛋白质熔化分析，(4)对另外的AOPP除草剂底物的活性，和(5)对肽的质谱分析以确认身份。还使用纯化的重组野生型蛋白和MON-HT55蛋白进行生物化学分析以用于比较。对于动力学分析，非终点测定在23℃下以精喹禾灵或2,4-D作为底物进行。用于这些测定的重组蛋白在细菌中产生并且使用在蛋白质的C末端融合的6-His标签进行纯化。在表7中给出10种工程化蛋白质、野生型蛋白和MON-HT55蛋白的使用精喹禾灵或2,4-D作为底物的动力学分析的结果(标准误差显示在括号中)。Vmax表示为比活性，umol除草剂产物mg酶-1min-1；Km表示为mM除草剂底物。NDB指示在较高浓度的除草剂下酶活性可能是明显的，但是在所测试的浓度下的活性不足够稳健来提供适当的动力学表征。对于MON-HT55，具有2,4-D作为底物的低活性水平(Vmax)产生报告值的低置信度。MON-HT7具有比野生型酶大大约40％的使用精喹禾灵的Vmax和仅为野生型酶的约一半的使用2,4-D的Vmax。MON-HT1具有为野生型酶的约一半的针对精喹禾灵的Vmax和比野生型酶高9.5倍的针对2,4-D的Vmax。MON-HT1和MON-HT7的蛋白质动力学的区别出人意料，因为MON-HT1与MON-HT7之间仅存在四个氨基酸差异。具体地说，MON-HT1在指定位置处具有以下氨基酸：I82；F105；T112；和V273，并且MON-HT7在指定位置处具有以下氨基酸：L82；V105；S112；和A273。

表7

对于MON-HT1、MON-HT2、MON-HT7和MON-HT8，深入分析了在一定温度范围内的酶活性。这些测定如上所述进行。使用精喹禾灵或2,4-D作为这些反应的底物，并且基于野生型酶在25℃下的活性将活性标准化。°所获得的活性曲线示于图2B(以精喹禾灵作为底物)和图2C(以2,4-D作为底物)。使用精喹禾灵作为底物，MON-HT55是最温度敏感的，其中T_1/2为29℃。野生型酶具有38℃的T_1/2。MON-HT1和MON-HT8比野生型酶温度敏感性低，分别具有42℃和41℃的T_1/2，野生型酶在所述温度下是90％无活性的。MON-HT2和MON-HT7温度敏感性低得多，分别具有46℃和47℃的T_1/2，野生型酶在所述温度下是完全无活性。当使用2,4-D作为底物时，野生型酶具有36℃的T_1/2。MON-HT2、MON-HT7和MON-HT8的温度敏感性都略微更高，具有比野生型酶更低的T_1/2。MON-HT1的温度敏感性略低，具有比野生型酶高约1℃的T_1/2。

还进行蛋白质熔化分析。对于蛋白质熔化测定，将纯化的酶添加至有或无50uM Fe2+和1.0mM aKG的标准储存缓冲液(30mM Tris pH7.5，150mM NaCl)中的96孔微量滴定板。然后用BioRad CFX96^TM实时PCR机器(BioRad,Hercules,CA)中的橙色蛋白凝胶染色剂(Invitrogen^TM目录号S6651，Life Technologies,Grand Island,NY)检测蛋白质解折叠，所取得的读数在10℃至95℃之间，步幅为0.5℃。T_1/2(在此，50％的蛋白质解折叠的温度)显示在表8中。野生型酶显示用50uM Fe2+和1.0mM aKG稳定化。相比之下，50uM Fe2+和1.0mM aKG对任何工程化蛋白质的稳定性几乎没有影响。MON-HT55、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT6和MON-HT10具有在41℃至48℃范围内的熔化温度，其低于野生型酶的熔化温度。MON-HT1、MON-HT2、MON-HT5、MON-HT7、MON-HT8和MON-HT9的熔化温度在58℃与67℃之间，其比野生型酶高8℃至17℃。对于MON-HT7和MON-HT1，不含Fe2+和aKG的缓冲液中的熔点差为11℃，并且在具有Fe2+和aKG的缓冲液中的熔点差为8℃。这是出人意料的，因为在两种酶之间仅存在四个氨基酸差异。关于酶熔点的此数据证实了工程化蛋白质已经针对更高温度下的蛋白质稳定性进行了优化。此数据还匹配在不同温度下进行的蛋白质的酶活性测定结果。

表8

使用在23℃下用纯化的酶进行的酶活性测定来测定具有吡氟氯禾灵、噁唑禾草灵、吡氟禾草灵和2,4-滴丙酸作为底物的MON-HT蛋白变体的酶活性。将活性记录为作为野生型酶活性的百分比的最大活性，其设定为100％。数据提供于表9中。MON-HT55、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5和MON-HT9对于低于或等于具有同一底物的野生型酶的最大活性的所有四种底物具有最大活性。以吡氟氯禾灵作为底物，MON-HT1、MON-HT2、MON-HT7和MON-HT10具有大于野生型酶的最大活性的最大活性。以噁唑禾草灵作为底物，MON-HT1、MON-HT2、MON-HT6、MON-HT7、MON-HT8和MON-HT10具有比野生型酶的最大活性更大的最大活性。以吡氟禾草灵作为底物，MON-HT2和MON-HT7具有比野生型酶的最大活性更大的最大活性。以2,4-滴丙酸作为底物，MON-HT1、MON-HT7和MON-HT8具有比野生型酶的最大活性更大的最大活性。

表9

使用质谱确认酶身份。对于此分析，在PAGE凝胶上分离纯化的蛋白质并染色。然后切下染色的条带、脱色并使用标准方案消化胰蛋白酶。在标准条件下，使用Thermo Scientific^TM AQUASIL^TM C-18Javelin^TM Guard柱，在Dionox3000RSLCnano LC系统(Thermo Scientific,Sunnyvale,CA)上分离胰蛋白酶消化的蛋白质制剂，并注射用于使用Thermo Scientific^TM Q Exactive^TM杂合四极轨道阱质谱仪(Thermo Scientific，Sunnyvale，CA)的MS-MS分析。

为了在苯氧基酸除草剂存在下优化蛋白质以增加活性，对几种工程化蛋白质的晶体结构进行计算蛋白质工程化。这用于报告如上所述进行的另外几轮诱变，但使用编码蛋白质序列MON-HT1(SEQ ID NO:14)的细菌序列SEQ ID NO:15作为起始序列。产生大约472种另外的工程化蛋白质。将这些与实施例1和表6中描述的大约2600种工程化蛋白质组合以获得总共大约3072种工程化蛋白质，以鉴定在2,4-D存在下针对活性优化的蛋白质。新变体的第一筛选是如实施例1中所述的具有粗细菌裂解物的高通量(HTP)细菌蛋白质表达和酶测定系统，但修改为在25℃和40℃的所需温度下进行，其中在25℃下进行猝灭后颜色显色。在此HTP筛选之后，选择大约34种工程化蛋白质，并且将其推进到所有样品中进行蛋白质标准化筛选。从此筛选中，选择12种工程化蛋白质，并且推进至使用用如实施例1所述的除草剂降解酶测定来测定的纯化蛋白质的筛选。用有限蛋白质熔化测定来测定酶热稳定性。从此筛选，选择7种工程化蛋白质且推进用于植物测试。选择三种酶变体用于使用纯化蛋白质的详细表征，其中将蛋白质浓度标准化，并且筛选包括精喹禾灵和2,4-D作为底物，以及表10和表12中所示的另外除草剂和蛋白质熔化表征。

使用非终点测定的动力学分析在23℃下以精喹禾灵或2,4-D为底物进行，如上文对野生型酶的纯化蛋白质MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17所详述。当用2,4-D作为底物进行测试时，数据表明相对于野生型RdpA酶和MON-HT1酶，MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17的酶活性显著和出人意料的增强。具体地说，所有三种变体相对于MON-HT1显示大约2.5至3倍的活性增加(Vmax)。具有喹禾灵作为底物的MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17变体的酶活性与MON-HT1的活性大致相似。参见表10。

表10

如上详述进行蛋白质熔化分析。MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17的熔化温度类似于MON-HT1的熔化温度，其中缓冲液中的T_1/2在55℃-58℃的范围内，并且在缓冲液加Fe2+和aKG中的T_1/2在60℃-62℃的范围内。这些数据表明，与MON-HT1相比，MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17变体具有相似的酶热稳定性。关于酶变体熔点的此数据证实了工程化蛋白质已经针对更高温度下的蛋白质稳定性进行了优化。参见表11。

表11

使用在23℃下用纯化的酶进行的酶活性测定来测定具有绿草定、氟草烟、MCPA、MCPB、2-甲-4-氯丙酸作为底物的MON-HT蛋白变体的酶活性。将活性记录为作为野生型RdpA酶活性的百分比的最大活性，其设定为100％。数据提供于表12中。对于以除草剂绿草定和氟草烟作为底物测定的每种蛋白质(MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17)，存在可检测的活性，特别是在工程化变体中，但活性不足够稳健来量化。对于以除草剂MCPB作为底物测定的每种蛋白质(MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17)，不存在可检测的活性。与野生型RdpA酶相比，用2-甲-4-氯丙酸作为底物的酶活性对于MON-HT1、MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17变体中的每一种降低。出人意料的结果是，与野生型RdpA酶相比，用MCPA作为底物的酶活性对于MON-HT1大大约6倍，且对于MON-HT13、MON-HT15和MON-HT17大大约10倍。参见表12。

表12

实施例4：玉米中优化的工程化蛋白质的表达

选择在较高温度下针对活性优化的十种独特的工程化蛋白质以用于玉米转化和植物中的分析。产生DNA构建体以用于使用本领域的技术人员已知的方法表达具有针对单子叶植物表达优化的密码子使用的这些工程化蛋白质。在这些DNA构建体中，在与工程化蛋白质的不同组合中测试了增强子、启动子、前导序列、内含子、CTP和3'UTR。DNA构建体用于使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用这些载体转化未成熟的玉米(LH244)胚。将再生的R0转基因小植株在温室中生长。

在移植到塞后7至10天(通常对应于V3-V4生长阶段)，通过施加精喹禾灵(2X)加2,4-D(2X)来筛选转基因R0玉米植物。测试的所有构建体产生含有通过R0筛选的独特事件的植物。使R0植物自交以产生R1纯合种子，并且R0也用作雄性以与含有玉米事件MON89034的近交植物杂交以产生用于功效田间试验的分离F1杂交种子。

用分离的F1杂交植物进行功效田间试验，其中50％对于转基因是半合子的且50％对于转基因是无效的。使用两种除草剂施加方案评估对精喹禾灵(2X)加2,4-D(2X)的耐受性：(1)在VE-V2生长阶段施加的0.16lb ai/英亩(2X)的精喹禾灵(Assure II)加0.25％v/v非离子型表面活性剂(NIS)，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同，以及(2)在VE-V2生长阶段施加的2lb ae/英亩(2X)的2,4-D胺加0.04lb ai//英亩(0.5X)的精喹禾灵加0.25％v/v NIS，接着在V4生长阶段施加的2lb ae/英亩(2X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS，接着在V8生长阶段相同。在VE-V2生长阶段通过第一精喹禾灵施加除去对转基因来说无效的50％植物。在针对作物损伤施加后10-14天，以0至100的标度对地块进行视觉评级，其中“0”是无且“100”是完全的作物破坏。表13显示对于两种喷洒方案在V4和V8生长阶段评级的平均损伤。<10％的损伤评级被认为是非常良好的耐受性，并且<20％的损伤评级被认为良好至中等的耐受性。在V8生长阶段用2,4-D的2X施加评级的损伤百分比在高40％至低0的范围内。类似地，在V8生长阶段用精喹禾灵的2X施加评级的损伤百分比在高90％至低0的范围内。表达相同蛋白质的植物之间损伤评级的变化可能是由于构建体设计或转基因插入位置的变化所致。此数据证实，表达工程化蛋白质的植物在2X速率下显示对2,4-D和喹禾灵除草剂的耐受性。

表13

使用用于热敏感性的基于植物的酶活性测定来确定升高的生长温度对含有优化的工程化蛋白质的转基因植物的除草剂耐受性的影响。为了在升高的生长温度下测试精喹禾灵耐受性，F1杂交(通过将表达MON-HT蛋白中的一种的R1纯合植物与近交玉米事件MON89034杂交产生)玉米种子在28℃的白日温度和20℃的夜间温度与50％湿度在生长室中生长10天。10天后，在三种不同的白日和夜间温度方案中的一种将植物移动以适应3天：(1)设定在20℃下的白日温度和夜间温度；(2)28℃的白日温度和20℃的夜间温度；或(3)38℃的白日温度和30℃的夜间温度。在适应期结束时，植物通常处于V4生长阶段并且用2X精喹禾灵喷洒。处理后10天，将植物以1至5的评级标度针对损伤进行评分，其中‘0’是未观察到可见的损伤，‘1’是褪绿斑点，‘2’是褪绿条纹，‘3’存在叶隙或裂纹，‘4’是具有生长迟缓和/或扭曲叶子的植物，并且‘5’是死植物或观察不到生长。结果呈现于图4中。当昼/夜温度是20℃/20℃(图4A)或28℃/20℃(图4B)时，相对于F1杂交对照植物(玉米事件NK603X MON89034)(损伤评级为5)，表达MON-HT55的F1杂交玉米植物对喷洒处理显示出良好的耐受性(损伤评级为约2)。当昼/夜温度是38℃/30℃时，F1杂交对照植物的损伤评级为5，表达MON-HT55的F1杂交植物的平均损伤评级为3，并且表达MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4或MON-HT7的F1杂交植物的损伤评级≤1(图4C)。当表达这些工程化蛋白质的植物暴露于高温时，在更高温度下针对活性优化的工程化蛋白质提供AOPP除草剂耐受性。

为了在升高的生长温度下测试2,4-D耐受性，通过将含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT7或MON-HT55的R1植物与含有玉米事件MON89034的近交植物杂交来产生F1杂交植物。将F1杂交植物在温室中在20℃的最低温度和28℃的最大温度下在50％至80％湿度下生长一周。1周后，将植物移动以在两种不同的白日温度和夜间温度方案中的一种下适应三天：(1)白日温度和夜间温度两者均设定在20℃或(2)38℃的白日温度和30℃的夜间温度。在适应期结束时，植物通常处于V4生长阶段并且用4X 2,4-D胺喷洒。处理后10天，使用0至100的损伤标度对植物的损伤评分，其中“0”是不损伤且“100”是死植物。在施加4X 2,4-D胺之前，当使植物在20℃/20℃的白日/夜间温度下适应时，含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT7或MON-HT55的F1植物的损伤评级平均值<10％，并且对照植物的损伤评级平均值<20％(图4D)。在施加4X 2,4-D胺之前，当使植物在38℃/30℃的白日/夜间温度下适应时，含有MON-HT4或MON-HT7的F1植物具有<20％的损伤评级平均值，含有MON-HT1、MON-HT2或MON-HT3的F1植物具有<10％的损伤评级平均值(图4E)，并且对照植物和含有MON-HT55F1植物的植物具有50％的损伤评级平均值(图4E)。这些结果表明，当表达这些工程化蛋白质的植物暴露于高温时，针对在较高温度下的活性优化的工程化蛋白质提供2,4-D除草剂耐受性。

在两个位置处进行精喹禾灵和2,4-D的单独性状功效田间试验，每个位置具有通过将含有玉米事件MON89034的近交植物与含有MON-HT55(具有CTP)、MON-HT1(有或无CTP)、MON-HT2(有或无CTP)、MON-HT3(具有CTP)、MON-HT4(具有CTP)、MON-HT5(具有CTP)、MON-HT6(具有CTP)或MON-HT7(具有CTP)的R1植物杂交产生的F1杂交转基因植物。将含有玉米事件NK603x MON89034的转基因F1杂交植物作为对照进行比较。

在精喹禾灵耐受性和烯草酮敏感性的功效田间试验中，使用四种除草剂处理中的一种：(1)在VE-V2生长阶段施加的0.32lb ai/英亩(4X)的精喹禾灵(Assure II)加0.25％v/v非离子型表面活性剂(NIS)，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同；(2)在VE至V2生长阶段施加的0.64lb ai/英亩(8X)的精喹禾灵加0.25％v/v NIS，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同；(3)在VE至V2生长阶段施加的1.28lb ai/英亩(16X)的精喹禾灵加0.25％v/v NIS，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同；或(4)在V8生长阶段施加的0.25lb ai/英亩(1X)的烯草酮加0.25％v/v NIS。在针对作物损伤施加后10-14天，以0至100的标度对地块进行视觉评级，其中“0”是无且“100”是完全的作物破坏。表14和表15分别显示在V4或V8生长阶段施加除草剂后的平均损伤评级。

含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5、MON-HT6或MON-HT7(全部可操作地连接至CTP)的植物显示对精喹禾灵的非常良好的耐受性，其中在所有施加速率和在V4生长阶段和V8生长阶段两者的损伤评级均小于15％。含有可操作地连接至CTP的MON-HT55的植物显示中度至较差耐受性，其中损伤评级为0.8％至78.8％。在精喹禾灵施加后对照植物的损伤评级是99.5％。这些结果表明，含有可操作地连接至CTP的MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5、MON-HT6或MON-HT7的植物对精喹禾灵的连续施加具有非常良好的耐受性。

含有具有可操作连接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物对含有无可操作地连接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物具有更好的对精喹禾灵的耐受性。相较于含有无可操作连接的CTP的MON-HT1的植物的3.3％至18.8％损伤评级，含有具有可操作连接的CTP的MON-HT1的植物在所有精喹禾灵施加中具有0％至5.5％损伤评级。相较于含有无可操作连接的CTP的MON-HT2的植物的16.3％至82.5％损伤评级，含有具有可操作连接的CTP的MON-HT2的植物在所有精喹禾灵施加中具有1.5％至10％损伤评级。图5示出在VE至V2生长阶段施加的1.28lb ai/英亩(16X)精喹禾灵施加(处理3)加0.25％v/v NIS、随后在V4生长阶段相同、随后在V8生长阶段相同之后10至14天，含有可操作地连接至CTP的MONT-HT2的植物(图5A)和含有无CTP的MON-HT2的植物(图5B)。对照植物不能存活，含有无CTP的MON-HT2的植物具有中度至较差耐受性，并且含有可操作地连接至CTP的MON-HT2的植物具有对精喹禾灵施加的强耐受性。这些结果证实，使用可操作连接的CTP大大提高了精喹禾灵耐受性。

所有转基因植物对在V8生长阶段施加的1X烯草酮(0.25lb ai/英亩)的施加具有90％以上的损伤评级，从而证明在含有工程化蛋白质的转基因植物中使用这种除草剂用于志愿者对照。

在2,4-D耐受性的功效田间试验中，使用四种除草剂处理中的一种：(1)施加至VE至V2、随后V4、随后V8的2lb ae/英亩(2X)的2,4-D胺加0.25％v/v非离子型表面活性剂(NIS)；(2)施加至VE至V2、随后V4、随后V8的4lb ae/英亩(4X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；(3)施加至VE至V2、随后V4、随后V8玉米的8lb ae/英亩(8X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；或(4)施加至VE至V2、随后V4、随后V8的16lb ae/英亩(16X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS。如上对地块目测评级。表14和表15分别显示在V4或V8生长阶段施加除草剂后的平均损伤评级。

含有MON-HT1、MON-HT2或MON-HT6(全部可操作地连接至CTP)的植物显示对2,4-D的非常良好的耐受性，其中损伤评级分别在V4和V8生长阶段的所有施加速率下小于10％和小于17％。含有MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5或MON-HT7(全部可操作地连接至CTP)的植物显示对2,4-D的良好耐受性，其中损伤评级分别在V4和V8生长阶段的所有施加速率下小于20％和小于22％。含有可操作地连接至CTP的MON-HT55的植物显示中度至较差耐受性，其中损伤评级为7.5％至66％。在2,4-D施加后对照植物的损伤评级在40％至82.2％的范围。这些结果表明，含有MON-HT1、MON-HT2、MON-HT3、MON-HT4、MON-HT5、MON-HT6或MON-HT7的植物对2,4-D的连续施加具有良好耐受性。

含有具有可操作连接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物通常不显示与含有无可操作地连接的CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物相比对2,4-D的耐受性显著差异，如在精喹禾灵施加情况下所观察到。相较于含有无可操作连接的CTP的MON-HT1的植物的0％至13.8％损伤评级，含有具有可操作连接的CTP的MON-HT1的植物在所有2,4-D施加中具有0％至16.3％损伤评级。相较于含有无可操作连接的CTP的MON-HT2的植物的1.3％至21.3％损伤评级，含有具有可操作连接的CTP的MON-HT2的植物在所有2,4-D施加中具有1.3％至15％损伤评级。然而，与无CTP的植物(在8X下13.75％损伤评级并且在16X下21.25％损伤评级)相比，在含有具有可操作地连接的CTP的MON-HT2的植物的V4生长阶段的2,4-D施加之后差异是显著的(在8X下4.5％损伤评级并且在16X下7.5％损伤评级)。

表14

表15

实施例5：评价叶绿体靶向肽对玉米中的优化的工程化蛋白质的表达的影响

为了评价不同的叶绿体靶向肽(CTP)，构建了植物转化载体，每个载体包含针对单子叶植物表达优化的重组DNA分子并且编码MON-HT1(SEQ ID NO:16)、MON-HT2(SEQ ID NO:20)和MON-HT8(SEQ ID NO:39)、MON-HT9(SEQ ID NO:42)或MON-HT10(SEQ ID NO:45)。使用启动子、前导序列、内含子和3'-UTR的相同组合、但是具有三种独立的CTP(A、B或C)中的一种或无可操作地连接至蛋白质编码序列的CTP产生载体。参见表16。DNA构建体用于使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法转化未成熟的玉米(LH244)胚。将再生的R0转基因小植株在温室中生长。使R0植物自交以产生R1纯合种子。R0植物还被用作雄株以与含有玉米事件MON89034的近交植物杂交，以产生用于性状功效田间试验的分离F1杂交种子。

在两个位置处进行精喹禾灵和2,4-D的单独性状功效田间试验，每个位置具有纯合近交转基因植物(R2或R4传代)。在这些田间试验中，使用了两种除草剂处理中的一种：(1)在V4生长阶段施加0.16lb ai/英亩(2X)的精喹禾灵(Assure II)加0.25％v/v非离子型表面活性剂(NIS)，随后在V8生长阶段相同；或(2)施加至V4、随后V8的2lb ae/英亩(2X)的2,4-D胺加0.25％v/v非离子型表面活性剂(NIS)。在V4和V8施加10至14天后，取得损伤评级(在V4(CIPV4)或V8(CIPV8)的作物损伤百分比)。使用LSD(0.05)计算误差。结果表明，在V4和V8施加后，这些植物具有对精喹禾灵或2,4-D的2X连续施加的耐受性，其中损伤评级低于10％。参见表16。

表16

从含有编码有或无CTP序列的MON-HT1、MON-HT2和MON-HT8的转基因盒的植物收集叶样品，以测定从编码工程化蛋白质的转基因盒转录的mRNA的表达。对叶样品提取物进行分析，以确定转基因盒的mRNA表达。对于这些测定，探针是存在于用于产生转基因植物的每个表达盒中的共同3'-UTR序列。通过标准化至玉米管家基因来计算相对表达。对于用于制备转基因植物的每种构建体构型，从八种植物中的每种收集叶样品，并且所报告的相对mRNA表达数据是具有标准误差的八种样品的平均值。

含有编码MON-HT1(SEQ ID NO:14)或MON-HT2(SEQ ID NO:18)的转基因构建体的植物对于含有‘A’或‘B’CTP的构建体具有比对无CTP或有‘C’CTP的构建体更高的相对转基因mRNA表达。含有编码MON-HT8(SEQ ID NO:37)的转基因构建体的植物对于含有三种CTP(A、B或C)中任一种的构建体具有类似高的相对转基因mRNA表达。参见表17。

表17

在一个位置处进行精喹禾灵和2,4-D压力筛选的单独性状功效田间试验，每个位置具有通过将含有玉米事件MON89034的近交植物与含有有或无可操作连接的CTP序列的MON-HT1、MON-HT2、MON-HT8、MON-HT9和MON-HT10的R1植物杂交而产生的F1杂交转基因植物。将含有玉米事件NK603x MON89034的转基因F1杂交植物作为对照进行比较。

在精喹禾灵耐受性的功效田间试验中，使用三种除草剂处理中的一种：(1)在VE-V2生长阶段施加的0.32lb ai/英亩(4X)的精喹禾灵(Assure II)加0.25％v/v非离子型表面活性剂(NIS)，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同；(2)在VE-V2生长阶段施加的0.64lb ai/英亩(8X)的精喹禾灵加0.25％v/v NIS，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同；(3)在VE-V2生长阶段施加的1.28lb ai/英亩(16X)的精喹禾灵加0.25％v/v NIS，随后在V4生长阶段相同，随后在V8生长阶段相同。如上对地块目测评级。表18显示分别在V4(CIPV4)或V8(CIPV8)生长阶段施加除草剂后的平均损伤评级。在所有精喹禾灵施加后对照植物的损伤评级是100％。使用LSD(0.05)计算误差。

表18

含有具有三种可操作连接的CTP(A、B或C)中的任一种的MON-HT1的植物与含有无可操作地连接的CTP的MON-HT1的植物相比，对精喹禾灵具有更好的耐受性。含有具有可操作地连接的‘A’CTP的MON-HT1的植物在所有精喹禾灵施加中具有0％至15％的损伤评级。含有具有可操作地连接的‘B’CTP的MON-HT1的植物在所有精喹禾灵施加中具有2.5％至20％的损伤评级。含有具有可操作地连接的‘C’CTP的MON-HT1的植物与含有无可操作地连接的CTP的MON-HT1的植物(其在所有精喹禾灵施加中具有2.5％至37.5％的损伤评级)相比，在所有精喹禾灵施加中具有0％至20％的损伤评级。

含有具有三种可操作连接的CTP(A、B或C)中的任一种的MON-HT2的植物与含有无可操作地连接的CTP的MON-HT2的植物相比，对精喹禾灵具有更好的耐受性。含有具有可操作地连接的‘A’CTP的MON-HT2的植物在所有精喹禾灵施加中具有0％至15％的损伤评级。含有具有可操作地连接的‘B’CTP的MON-HT2的植物在所有精喹禾灵施加中具有0％至20％的损伤评级。含有具有可操作地连接的‘C’CTP的MON-HT2的植物与含有无可操作地连接的CTP的MON-HT2的植物(其在所有精喹禾灵施加中具有35％至70％的损伤评级)相比，在所有精喹禾灵施加中具有0％至20％的损伤评级。

含有具有可操作连接的‘A’或‘B’CTP的MON-HT8的植物与含有具有可操作地连接的‘C’CTP的MON-HT8的植物相比，对精喹禾灵具有更好的耐受性。含有具有可操作地连接的‘A’CTP的MON-HT8的植物在所有精喹禾灵施加中具有15％至60％的损伤评级。含有具有可操作地连接的‘B’CTP的MON-HT8的植物与含有具有可操作地连接的‘C’CTP的MON-HT8的植物(其在所有精喹禾灵施加中具有45％至85％的损伤评级)相比，在所有精喹禾灵施加中具有5％至35％的损伤评级。

含有具有三种可操作地连接的CTP中的任一种的MON-HT1或MON-HT2的植物和含有具有可操作地连接的‘A’CTP的MON-HT9或MON-HT10的植物与含有具有三种可操作地连接的CTP中的任一种的MON-HT8的植物相比，对精喹禾灵具有更好的耐受性。含有具有可操作地连接的‘A’CTP的MON-HT9或MON-HT10的植物在所有施加中对精喹禾灵具有耐受性，其与含有具有三种可操作地连接的CTP中的任一种的MON-HT1或MON-HT2的植物相当。在喹禾灵施加的最高速率(16X)下，含有具有可操作连接的‘A’CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物与含有具有可操作连接的‘B’或‘C’CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物相比，具有略微更高的耐受性。

在2,4-D耐受性的性状功效田间试验中使用了三种除草剂处理：(1)施加至VE-V2、随后V4、随后V8的4lb ae/英亩(4X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；(2)施加至VE-V2、随后V4、随后V8玉米的8lb ae/英亩(8X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS；或(3)施加至VE-V2、随后V4、随后V8的16lb ae/英亩(16X)的2,4-D胺加0.25％v/v NIS。如上对地块目测评级。

表19显示分别在V4(CIPV4)或V8(CIPV8)生长阶段施加2,4-D除草剂后玉米中的平均损伤评级。在所有2,4-D施加后对照植物的损伤评级在80％至96.25％的范围内。在通过V8施加的最高2,4-D速率(16x)下，与含有未可操作地连接至CTP的MON-HT1或MON-HT2的植物相比，含有可操作地连接至三种CTP(A、B或C)中的任一种的MON-HT1或MON-HT2的植物具有更好的耐受性。与具有可操作地连接的‘A’CTP的MON-HT9或MON-HT10的植物相比，含有有或无可操作地连接的CTP的MON-HT1、MON-HT2或MON-HT8的植物对在所测试的所有施加下的2,4-D具有更好耐受性。在2,4-D施加范围内，耐受性的相对排序是：含有MON-HT1的植物具有比含有MON-HT2的植物更好的耐受性，所述含有MON-HT2的植物进而比含有MON-HT8的植物更佳。与来自精喹禾灵压力测试试验的数据一致，含有可操作地连接至‘A’CTP的MON-HT1、MON-HT2或MON-HT8的植物显示相对于‘B’和‘C’转运肽的稍微数学但不具有统计学意义的优势。使用LSD(0.05)计算误差。

表19

实施例6：大豆中优化的工程化蛋白质的表达

选择两种工程化蛋白质用于在转基因大豆中进行分析。产生DNA构建体以用于使用本领域的技术人员已知的方法表达具有针对双子叶植物表达优化的密码子使用的MON-HT1(SEQ ID NO:14)和MON-HT2(SEQ ID NO:18)。在这些DNA构建体中，不同组合的增强子、启动子、前导序列、内含子、CTP和3'UTR可操作地连接至工程化蛋白质。DNA构建体用于使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法转化大豆。将再生的R0转基因小植株在温室中生长。在1-2三叶叶片阶段转化后大约9周，鉴定单拷贝R0事件，并且以0.5X(0.375lb ae/英亩)、2X(1.5lb ae/英亩)或4X(3.0lb ae/英亩)的速率喷洒2,4-D除草剂。在除草剂施加后大约2周，对植物按1至3的标度进行除草剂损伤评级，其中1＝几乎无至无损伤(<20％)，2＝中度损伤(20％-50％)和3＝严重损伤(>50％)。

含有每种构建体的R0大豆植物显示对2,4-D的耐受性，几乎无至无损伤(<20％损伤)或中度损伤(20％-50％)。数据提供于表20中。这表明工程化蛋白质MON-HT1和MON-HT2可在大豆植物中赋予对2,4-D的耐受性。

表20

然后选择针对2,4-D的活性优化的另外5种工程化蛋白质以用于在转基因大豆中的分析。产生DNA构建体以用于表达MON-HT13(SEQ ID NO:47)、MON-HT14(SEQ ID NO:48)、MON-HT15(SEQ ID NO:49)、MON-HT17(SEQ ID NO:51)和MON-HT18(SEQ ID NO:52)，其具有针对双子叶表达优化的密码子使用。在所有构建体中，可操作地连接的表达元件(启动子、前导序列、内含子、CTP和3'UTR)是相同的。从R0小植株获取叶样品，并且使用基于PCR的测定鉴定单拷贝植物。当单拷贝R0植物具有大约2至3个三叶叶片时，将它们用1.5lb ae/英亩(2X)或3.0lb ae/英亩(4X)的2,4-D处理。在除草剂施加后7天，如上所述，基于显示损伤的植物的面积百分比针对植物进行除草剂损伤评分。

在2X施用速率下，含有六种MON-HT变体(MON-HT1、MON-HT13、MON-HT14、MON-HT15、MON-HT17和MON-HT18)中的任一种的大豆植物显示对2,4-D处理的优异耐受性，如通过单拷贝植物中除两种之外全部具有<20％的损伤评级所证明；这两个事件(一个针对MON-HT13且一个针对MON-HT18)具有20％-30％的损伤评级。在4X施加速率下，在含有MON-HT1的11株单拷贝植物中，5株植物的损伤评分<20％，并且6株植物的损伤评分是20％-50％。在含有MON-HT13的11株单拷贝植物中，10株植物的损伤评分<20％，并且1株植物的损伤评分是20％-50％。在含有MON-HT14的8株单拷贝植物中，6株植物的损伤评分<20％，1株植物的损伤评分是20％-50％，并且1株植物的损伤评分>50％。在含有MON-HT15的7株单拷贝植物中，5株植物的损伤评分<20％，1株植物的损伤评分是20％-50％，并且1株植物的损伤评分>50％。在含有MON-HT17的11株单拷贝植物中，所有11株植物的损伤评分<20％。在含有MON-HT18的12株单拷贝植物中，9株植物的损伤评分<20％，并且3株植物的损伤评分是20％-50％。这些结果表明含有MON-HT1(SEQ ID NO:14)、MON-HT13(SEQ ID NO:47)、MON-HT14(SEQ ID NO:48)、MON-HT15(SEQ ID NO:49)、MON-HT17(SEQ ID NO:51)或MON-HT18(SEQ ID NO:52)的大豆植物在4X施加速率下具有对2,4-D的耐受性。此外，这证明与MON-HT1(SEQ ID NO:14)相比，含有MON-HT13(SEQ ID NO:47)、MON-HT14(SEQ ID NO:48)、MON-HT15(SEQ ID NO:49)、MON-HT17(SEQ ID NO:51)或MON-HT18(SEQ ID NO:52)的大豆植物在4X施加速率下具有改善的2,4-D耐受性。基于损伤评分<20％的单拷贝植物的百分比，与含有MON-HT1、MON-HT14、MON-HT15或MON-HT18的大豆植物相比，含有MON-HT13或MON-HT17的大豆植物对以4X速率施加的2,4-D具有更好耐受性。参见表21。

表21

实施例7：对合成植物生长素氟草烟、绿草定和MCPA的耐受性

测定含有MON-HT1的玉米和大豆植物对2,4-D、氟草烟、绿草定和MCPA的施加的耐受性。将含有具有‘A’CTP的MON-HT1的三个独特事件的F1杂交玉米种子和R2大豆种子种植在盆中。使用用于植物转化的含有NK603x MON89034杂交玉米种子和相同大豆种质作为对照。将植物生长在温室中，并且四株植物用于每次处理。当植物在6-8英寸(大豆)与10-12英寸(玉米)高之间时，将植物在生长室中喷洒除草剂，然后转移至编程为维持最佳生长条件的温室中。

对于大豆，使用以下各项中的每一种的2X除草剂施加速率：(1)2,4-D胺4(1680g ae/ha)；(2)绿草定(840g ae/ha，)；(3)氟草烟(840g ae/ha，)；或(4)MCPA(g ae/ha 1680)。在施加绿草定、氟草烟或MCPA后，大豆上的主要症状是严重的坏死和偏上性。对所有处理按0％至100％的评级标度进行视觉植物损伤评级，其中0％表示与未处理的对照等效的植物，并且100％表示完全死亡的植物。所有评级均在处理后7天进行。与90％-97％作物损伤的对照相比，所有三种大豆MON-HT1事件的植物显示对2,4-D胺(2,4-D)的良好耐受性，平均小于7％作物损伤。没有大豆事件表现出对绿草定或氟草烟的耐受性，与91％作物损伤的对照相比，在所有三个事件中的损伤评级平均为81％-97％作物损伤。与90％损伤的对照相比，三个大豆事件中的一种显示对MCPA的低水平耐受性，其中平均损伤评级为72％，而另外两个事件具有90％作物损伤。参见表22。

表22

对于玉米，使用以下各项中的每一种的4X除草剂施加速率：(1)2,4-D胺4(3360g ae/ha)；(2)绿草定(1680g ae/ha，)；(3)氟草烟(1680g ae/ha，)；或(4)MCPA(g ae/ha 3360)。在施加绿草定、氟草烟或MCPA至玉米后，主要症状是倒伏。与43％作物损伤的对照相比，所有三个玉米MON-HT1事件的植物耐受2,4-D，平均小于15％损伤。与具有47％作物损伤的对照相比，三个MON-HT1玉米事件似乎显示对绿草定的一些低水平耐受性，其中作物损伤平均为26％-37％。与具有55％作物损伤的对照相比，三个MON-HT1玉米事件似乎显示对氟草烟的一些低水平耐受性，其中作物损伤平均为20％-21％。与31％作物损伤的对照相比，MON-HT1玉米事件中的两个显示对MCPA的良好耐受性，其中平均作物损伤小于6％。第三玉米MON-HT1事件的平均损伤评级为20％。参见表23。对绿草定和氟草烟的低耐受性和对MCPA的良好耐受性的这些结果与纯化的MON-HT1酶的体外酶数据一致。

表23