一种柴油降解菌固定化颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物和环境工程领域，特别涉及一种柴油降解材料的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着石油及石油产品的广泛应用，石油的开采、冶炼、运输产生的泄漏，以及含油废水的排放都造成了严重的环境污染。治理石油污染的常用方法有物理法、化学法以及生物修复法。物理方法适用于突发性溢油的回收并控制溢油的扩散，但是处理效率受天气、海洋状况以及溢油类型影响比较大；化学方法可能产生二次污染，生产工艺复杂，成本偏高，难以在实际中得到应用；化学燃烧产生黑烟，造成二次污染，并且浪费能源。
[0003]生物修复方法在治理污染时，具有成本低、效果好、无二次污染以及破坏小等优点，被认为最有发展前景的技术。目前，多采用传统的生物法如:活性污泥法(sBR法)、生物膜法(膜生物反应器)、接触氧化法以及循序间歇式生物处理等；其中，活性污泥法处理效果较好，但是对于进水要求较高；而生物膜法与活性污泥法相比，生物膜附着于填料载体表面，使繁殖速度慢的微生物也能存在，从而构成了稳定的生态系统，但是，微生物的量难以控制，因而不易操作。
[0004]传统的生物法虽具有其独特的优越性，但是由于微生物通常是在水中以悬浮状态生长的，所以降解菌浓度低、菌体易流失、与环境竞争力弱、抗有毒污染能力差等缺点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种操作简单、微生物流失少、反应过程易控制、无二次污染的柴油降解菌固定化颗粒的制备方法。本发明主要是采用固定化细胞技术，以灭菌的卤虫卵壳为载体材料，在无菌条件下，接入到活化好的柴油降解菌种子液中，对微生物细胞进行吸附、固定化，将固定化菌株细胞的卤虫卵壳与海藻酸钠混合，滴入氯化钙溶液中进行包埋，形成海藻酸钠-氯化钙-卤虫卵壳的固定化颗粒，用于柴油的降解。
[0006]本发明的制备方法如下:
[0007](I)将卤虫卵壳载体放在烘干箱中进行50?70°C烘干处理，再用研磨器研磨，筛选出粒径为0.1?0.5mm的颗粒后高压灭菌。
[0008](2)用LB培养基培养菌株Arthrobacter，按每10mL Arthrobacter菌悬液溶液加入0.5?1.5g卤虫卵壳的比例，将步骤(I)高压灭菌的卤虫卵壳与Arthrobacter进行混合，在100?130rpm/min、25?37°C条件下吸附培养4_10h，让菌株充分固定于齒虫卵壳载体中。
[0009](3)吸附后，在无菌条件下，6000?12000rpm/min离心2?lOmin，将上层清液弃去，按每10mL海藻酸钠溶液加入0.5?1.5g卤虫卵壳载体的比例，将步骤(2)的卤虫卵壳载体加入到浓度为2?3.0%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，再按每10mL海藻酸钠溶液加入500?800mL氯化钙溶液的比例，将上述海藻酸钠溶液滴加到不断搅拌的浓度为4?
5.0%氯化1?溶液中，交联20-50min，得到3?5mm固定化颗粒；
[0010](4)将步骤(3)得到的固定化颗粒用无菌双蒸水冲洗2?4遍，将固定化颗粒表面没有包被的菌株冲洗下来，即得到柴油降解菌固定化颗粒，在4°C条件下保存。
[0011]本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0012]1、操作简单，微生物流失少，且卤虫卵壳材料对微生物细胞无毒。
[0013]2、原材料价格低廉，易降解，无需回收，无二次污染。
[0014]3、制得的固定化颗粒具有很好的微生物活性，对柴油具有很好降解性能，降解性最高可达到65%。
【附图说明】
[0015]图1为本发明卤虫卵壳内部孔道的扫描电镜图。
[0016]图2为本发明实施例1卤虫卵壳吸附菌株细胞后的扫描电镜图。
[0017]具体实施方法
[0018]实施例1
[0019]将卤虫卵壳载体放在烘干箱中进行50°C烘干处理，再用研磨器研磨，筛选出粒径为0.1?0.5_的颗粒后进行高压灭菌，同时对卤虫卵壳进行SEM观察，如图1所示，说明卤虫卵壳载体存在孔隙结构，为菌株提供了附着条件。用LB培养基培养菌株Arthrobacter，将10mL菌株与0.5g经高压灭菌的卤虫卵壳载体进行混合，在120rpm/min、25°C条件下吸附培养10h，让菌株充分固定于载体中；吸附后，在无菌条件下，6000rpm/min离心lOmin，将上层清液弃去，同时对卤虫卵壳进行SHM观察，如图2所示，微生物可以在卤虫卵壳载体内部孔径附着。将卤虫卵壳载体加入到10mL浓度为2.0%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，用移液枪吸取并滴加到500mL不断搅拌的浓度为4%氯化钙溶液中，交联20min，得到3?5mm固定化颗粒；将上述固定化颗粒用70mL无菌双蒸水冲洗2遍，将固定化颗粒表面没有包被的菌株冲洗下来，即得到柴油降解菌固定化颗粒，在4°C条件下保存。运用亚甲基蓝溶液对固定化颗粒的传质性进行测定，比较亚甲基蓝溶液在加入固定化颗粒前后吸光度的变化情况间接得到固定化颗粒的传质性为0.17%。
[0020]实施例2
[0021]将卤虫卵壳载体放在烘干箱中进行60°C烘干处理，再用研磨器研磨，筛选出粒径为0.1?0.5mm的颗粒后进行高压灭菌；用LB培养基培养菌株Arthrobacter，将10mL菌液加入Ig经高压灭菌的卤虫卵壳载体进行混合，在100rpm/min、30°C条件下吸附培养6h，让菌株充分固定于载体中；吸附后，在无菌条件下，8000rpm/min离心6min，将上层清液弃去，将卤虫卵壳载体加入到10mL浓度为3.0%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，用移液枪吸取并滴加到600mL不断搅拌的浓度为5%氯化1?溶液中，交联30min，得到3?5mm固定化颗粒；将上述固定化颗粒用50mL无菌双蒸水冲洗3遍，将固定化颗粒表面没有包被的菌株冲洗下来，即得到柴油降解菌固定化颗粒，在4°C条件下保存。运用亚甲基蓝溶液对固定化颗粒的传质性进行测定，比较亚甲基蓝溶液在加入固定化颗粒前后吸光度的变化情况间接得到固定化颗粒的传质性为0.33%。
[0022]实施例3
[0023]将卤虫卵壳载体放在烘干箱中进行70°C烘干处理，再用研磨器研磨，筛选出粒径为0.1?0.5mm的颗粒后进行高压灭菌；用LB培养基培养菌株Arthrobacter，将10mL菌液加入1.5g经高压灭菌的卤虫卵壳载体，进行混合，在130rpm/min、37°C条件下吸附培养4h，让菌株充分固定于载体中；吸附后，在无菌条件下，12000rpm/min离心2min，将上层清液弃去；将卤虫卵壳载体加入到10mL浓度为3.0%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，用移液枪吸取并滴加到800mL不断搅拌的浓度为4%氯化钙溶液中，交联50min，得到3?5mm固定化颗粒；将上述固定化颗粒用30mL无菌双蒸水冲洗4遍，将固定化颗粒表面没有包被的菌株冲洗下来，即得到柴油降解菌固定化颗粒，在4°C条件下保存。运用亚甲基蓝溶液对固定化颗粒的传质性进行测定，比较亚甲基蓝溶液在加入固定化颗粒前后吸光度的变化情况间接得到固定化颗粒的传质性为0.35%。
[0024]固定化颗粒制备过程中采用1mL的海藻酸钠与吸附菌株的卤虫卵壳进行混合，并对制备的固定化颗粒的传质性进行测定，固定化颗粒的传质性随着卤虫卵壳载体的加入传质性增加，物质的传质阻力减少，易于物质的扩散。
[0025]对于2.0?3.0%浓度海藻酸钠制备的固定化颗粒的成型都较好。CaCl2浓度过低会使制备的固定化颗粒呈现不同的形状，CaCl2浓度过高会使制备的固定化颗粒呈现较好的形状，但是颗粒会较硬。将制备的固定化颗粒在含柴油的无机盐培养基中培养后，测定固定化颗粒对柴油降解率可达到65 %。
【主权项】
1.一种柴油降解菌固定化颗粒的制备方法，其特征在于: (1)将卤虫卵壳载体放在烘干箱中进行50?70°C烘干处理，再用研磨器研磨，筛选出粒径为0.1?0.5mm的颗粒后高压灭菌； (2)用LB培养基培养菌株Arthrobacter，按每10mLArthrobacter菌悬液加入0.5?1.5g卤虫卵壳的比例，将步骤(I)高压灭菌的卤虫卵壳与Arthrobacter进行混合，在100?130rpm/min、25?37°C条件下吸附培养4_10h，让菌株充分固定于齒虫卵壳载体中； (3)吸附后，在无菌条件下，6000?12 000rpm/min离心2?lOmin，将上层清液弃去，按每10mL海藻酸钠溶液加入0.5?1.5g卤虫卵壳载体的比例，将步骤⑵的卤虫卵壳载体加入到浓度为2?3.0%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，再按每10mL海藻酸钠溶液加入500?800mL氯化钙溶液的比例，用移液枪将上述海藻酸钠溶液滴加到不断搅拌的浓度为4?5.0 %氯化1?溶液中，交联20-50min，得到3?5_固定化颗粒； (4)将步骤(3)得到的固定化颗粒用无菌双蒸水冲洗2?4遍，将固定化颗粒表面没有包被的菌株冲洗下来，即得到柴油降解菌固定化颗粒，在4°C条件下保存。
【专利摘要】一种柴油降解菌固定化颗粒的制备方法，其主要是将卤虫卵壳载体烘干处理后研磨成并高压灭菌；用LB培养基培养菌株Arthrobacter与高压灭菌的卤虫卵壳进行混合，在100～130rpm/min、25～37℃条件下吸附培养4-10h，吸附后，在无菌条件下，6000～12000rpm/min离心2～10min，将上层清液弃去，将卤虫卵壳载体加入到海藻酸钠溶液中，混合均匀后，再用移液枪将上述海藻酸钠溶液滴加到氯化钙溶液中，交联20-50min，得到3～5mm固定化颗粒；用无菌双蒸水将固定化颗粒表面没有包被的菌株冲洗下来，即得到柴油降解菌固定化颗粒，在4℃条件下保存。本发明操作简单、无二次污染，制得的固定化颗粒对柴油的降解性最高可达到65％。
【IPC分类】C12N11/02, C12R1/06, C12N11/04, C12N11/10
【公开号】CN104911172
【申请号】CN201510298554
【发明人】高大威, 郑瑞雨, 刘艳平, 李楠, 边艳红, 张旭武, 籍冰朔
【申请人】燕山大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日