一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应 用。
【背景技术】
[0002] 自DNA结构模型确定以来，核酸研宄在分子生物学和医学等领域呈指数式发展， 并在最近的几十年里经久不衰。核酸剪切作为核酸研宄中最重要的技术之一，在基因表达、 编辑、检测、测序等许多领域被广泛应用。
[0003] 核酸的剪切从本质上而言就是使核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。能到达这一目的 的方法有很多，大致可分为化学方法、物理方法和生物方法三类。化学方法主要是利用如铈 离子、多胺铕铽络合物、α -噻吩甲酰三氟丙酮-哌啶铈等化学物质在特定溶液体系内使磷 酸二酯键断裂，物理方法主要是采用超声等物理手段使磷酸二酯键断裂。这两种方法对任 何核苷酸序列均可适用，但无序列特异性，因而其实际应用必然受到限制。生物方法则是在 各种核酸酶的催化下来完成核酸剪切。例如，Sl核酸酶可降解单链DNA或RNA，各种外切 酶（Exonuclease)可以从双链DNA的3'或5'粘性末端逐一剪切核苷酸，但上述这几种酶 也只能实现非特异性或半特异性的核酸剪切。而对于目标核酸序列的特异性剪切则必须依 赖于限制性内切酶（Restriction endonuclease)和由其改造而成的切口内切酶（Nicking endonuclease)。这两类酶都可以特异性地绑定在其特定的识别序列上，进而对目标核酸序 列实施精确的剪切，但它们的剪切方式又有所不同。限制性内切酶是对双链目标核酸序列 的二条链进行剪切，以切断整个双链而形成粘性末端与平末端；切口内切酶是对双链目标 核酸序列的其中一条链进行剪切，即只在一条单链上产生切口。限制性内切酶和切口内切 酶均常用于质粒的重组等基因工程领域以及基因表达、测序等许多研宄中，另外切口内切 酶也常用于核酸等温扩增方法的建立。
[0004] 然而，这两类酶均需要目标核酸序列中含有其识别序列，且剪切位点只能位于该 识别序列内或附近的某一固定位置，无法按实际需要实现精细调节，针对不同的目标核酸 序列来还需选择不同的内切酶才能实现剪切，因而其通用性较差，对于有些序列片段甚至 会由于没有适合的内切酶而无法实现特异性剪切。因此，亟需发展一种简单、通用、精确、可 调的核酸剪切方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用，采用该核酸定位探针 指导内切酶进行核酸剪切时，无需目标核酸序列中含有内切酶识别序列。
[0006] 一种核酸定位探针，包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链 具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的 结合区。
[0007] 内切酶与上述核酸定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链识别区与目标核 酸序列的杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列的精确剪 切。
[0008] 核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还 可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别 区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切 酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数（单链区按核苷 酸数计）根据内切酶的类型来确定。
[0009] 本发明所述的"靠近"是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切 目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位 点间的核苷酸数量来确定。
[0010] 作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的 同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。 [0011] 更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于 双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。
[0012] 进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0,小于等于50。
[0013] 理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪 切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：
[0014] 所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分 互补杂交形成。
[0015] 若以两条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针的两条核苷酸链中存在一部分互补 序列，互补区域中需包含结合区以供内切酶结合，未互补区域中至少包含一段与目标核酸 序列互补的识别区，当然，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数（单链区按核苷酸 数计）根据内切酶的类型来定。说明书附图IB中提供的即为两条核苷酸链形式的核酸定 位探针中的一种具体形式，图中3'侧臂和5'侧臂位于双链的同侧，且均含有一段识别区， 该结构的核酸定位探针有助于提高核酸定位探针与目标核酸序列结合的稳定性，提高剪切 效率。为了提高核酸定位探针的稳定性，双链中非内切酶识别序列的长度可依据所需退火 温度进行调整；增加两单链识别区的序列长度也可以促进核酸定位探针双链结合区的形成 与稳定。
[0016] 若以单条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针中应有两段互补的序列，并杂交形 成带单链环的茎环结构，上述茎环结构能够提高核酸定位探针的稳定性。上述单链环的核 苷酸数多〇, < 50 ;单链环的核苷酸数为0时，是指互补区域的一端通过最末两个核苷酸之 间的磷酸二酯键连接。当然，该核酸定位探针的未互补区域也应具有至少一段与目标核酸 序列互补的识别区。
[0017] 本发明还提供了一种核酸剪切复合物，包括内切酶和所述的核酸定位探针，内切 酶结合于所述的双链结合区。
[0018] 所述的内切酶为限制性内切酶或切口内切酶，包括：Nt. BstNBI、Nb. BsrDI、 Nb. BtsI、Ν· AlwI、Nt. BsmAI、Nt. BspQI、Fok I。
[0019] 本发明还提供了一种包含所述核酸定位探针的核酸剪切试剂盒以及包含所述核 酸剪切复合物的核酸剪切试剂盒。
[0020] 上述核酸定位探针以及核酸剪切复合物可应用于核酸剪切中。
[0021] 本发明核酸定位探针在核酸剪切的应用中可以对任意目标核酸序列实施剪切，既 不要求目标核酸序列中含有内切酶识别序列或任何其它特定序列，也不依赖于任何反应在 目标核酸序列中生成或引入内切酶识别序列或任何其它特定序列，只要设计及特定序列的 核酸定位探针即可。该方法能够在目标核酸序列的任意指定位置实现精确的剪切，通过改 变核酸定位探针在目标核酸序列上的杂交位置即可实现剪切位点的调节。
[0022] 基于核酸定位探针的核酸剪切方法不需要特殊的步骤，只需将目标核酸序列、核 酸定位探针、内切酶和反应缓冲液制成混合液，在一定温度条件下维持一定时间即可实现 对目标核酸序列指定位点的精确剪切。
[0023] 所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。所 述的反应缓冲液主要用于提供合适的反应环境，使内切酶发挥酶切功能，并维持核酸分子 的稳定。
[0024] 本发明采用特定结构的核酸定位探针，实现了核酸的剪切，提供了一种简单通用 的核酸剪切方法，该方法中内切酶在核酸定位探针的帮助下可以在目标核酸序列的任意指 定位置实现精确可调的剪切，具有简单、通用、精确、可调等优势，有望为生物、医学和化学 等领域研宄中核酸剪切提供有效手段。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明核酸定位探针的结构示意图（阴影部分为内切酶识别序列区域）；
[0026] A为茎环结构的核酸定位探针，B为由两条寡核苷酸链杂交形成的非茎环结构的 核酸定位探针。
[0027] 图2为采用本发明核酸定位探针进行核酸剪切的反应原理示意图（以茎环结构的 核酸定位探针为例）。
[0028] 图3为实施例1中FAM标记的核酸序列经不同条件处理后的变性聚丙烯酰胺凝胶 (15% )电泳图；
[0029] 其中，各泳道为各EP管中溶液的结果；泳道1为A管；泳道2为B管；泳道3为C 管；泳道4为D管；泳道5为E管