一种b族链球菌pcr荧光探针法核酸检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种B族链球菌核酸检测试剂盒，具体设及一种B族链球菌PCR巧光 探针法核酸检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] B族链球菌（groupBstreptococcus,GB巧是一种寄生于人类泌尿生殖道及下消 化道的条件致病菌，健康人群带菌率可达35%。早在20世纪70年代B族链球菌就已经被 证实为围产期母婴感染的重要致病菌之一。定植于产妇生殖道的B族链球菌，可在分娩时 垂直传播给新生儿，而新生儿B族链球菌感染所引起的新生儿败血症、脑膜炎和肺炎等症 致死率极高，并可导致神经系统后遗症。2010年美国疾病预防中屯、制定了《围产期GBS预 防指南》，建议孕妇于妊娠35-37周进行GBS筛查。
[0003] 目前，B族链球菌的诊断方法主要有培养法和免疫学方法，其中，培养法的特异性 和敏感性高，但临床检测时间过长（至少需要24h-4她，甚至更长时间），过程繁琐，需要 使用特殊的培养介质W及易受杂菌影响，不适用于大范围检测。免疫学方法，如：乳胶凝 集实验（latexagglutination,LA)，酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbent assay,ELISA)，协同凝集试验(^countercurrentimmunoelectrophotesis,CoA)及对流免疫 电泳kountercurrentimmunoelectrophotesis,CIE；)等，虽然特异性可W高达 95%，但是 敏感性不够，检出率较低。美国抑A已于1997年发出了运些方法假阴性和假阳性率均很高 的可行度警告，加之其试剂盒价格昂贵，所W运些方法的应用迅速减少。
[0004] 近年来，聚核酶链式反应（PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，标准PCR过程分 为Ξ步：DNA变性（90°C-96°C):双链DNA模板在热作用下，氨键断裂，形成单链DNA;退火 (60°C-65°C):系统溫度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；延伸（70°C-75°C):在 Taq酶（在72°C左右，活性最佳）的作用下，W脱氧核糖核巧Ξ憐酸（dNT巧为原料，从引物 的3'端开始W从5' - 3'端的方向延伸，最终合成与模板互补的DNA链。每一循环经过 变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
[0005] 运用PCR技术检测主要设及到两个方面：核酸的提取和核酸的扩增检测。目前，国 内临床上主要采用煮沸法对B族链球菌的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涂，再加 裂解液，煮沸，高速离屯、，取上清为模板。步骤繁琐，而且各厂家浓缩和裂解效率差异较大， 样本依赖性强，对于较复杂的样本提取效率低。
[0006] 巧光定量PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵 敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后 病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了 污染。实时巧光定量PCR技术使用一种带有巧光检测装置的PCR扩增仪，巧光检测装置能够 按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测巧光信号，通过检测巧光信号 的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩 增曲线，根据扩增曲线与巧光阔值线的交点（即Ct值）W及扩增曲线的形状，可W判断阴 阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可w通过软件自动分析 获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反 应体系中增加了一条两端分别标记巧光报告基团和泽灭基团的探针。探针结构完整时，巧 光报告基团发出的巧光能量被泽灭基团吸收，呈现泽灭效应；如果扩增过程中有祀序列的 存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，巧光报告基团与泽灭基团相 互解离，阻断了二者间巧光能量转移效应，巧光报告基团发出的巧光信号被巧光检测装置 收集。随着扩增的进行，巧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可W 通过巧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可W获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果， 因此，该技术在祀多核巧酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十 分广泛的应用。研究显示，实时巧光PCR检测方法与标准的细菌培养方法在GBS检测的敏 感性和特异性方面均达90%W上，达到筛检标准，已经得到美国食品和药品管理局（抑A) 的批准并应用于临床。因此，在国内采用实时巧光PCR技术进行GBS筛检是最快速、可靠的 方法。
[0007] 目前，国内已有数种基于实时巧光PCR技术检测B族链球菌-DNA的试剂盒应用于 临床检测中，运些试剂盒所提供的B族链球菌-DNA提取方法主要是煮沸法。在实际临床应 用中，此方法暴露出诸多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样 本时，经过煮沸裂解、高速离屯、富集DNA等多个步骤，DNA损耗严重，且对高浓度的样本存在 裂解和富集不充分的问题；2)同时由于采用了水浴或金属浴的高溫加热步骤，容易造成气 溶胶污染；3)检测灵敏度偏低，约在lOOOcopies/ml左右；4)没有设置阳性内对照（即内 标），无法监控假阴性。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，W解决现有技术中 试剂盒检测效果差、灵敏度低的问题。
[0009] 本发明提供一种核酸释放剂在B族链球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎 梵婷0.05-0.51111/1、氯化钟 100-3001111/1、十二烷基横酸钢0.05-3%和乙醇0.01-1%。
[0010] 本发明还提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，所述B族链球菌 PCR巧光探针法核酸检测试剂盒包括：核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵 婷0. 05-0. 氯化钟100-300mM/l、+二烷基横酸钢0. 05-3%和乙醇0. 01-1% ;所述 PCR反应液包括用于祀多核巧酸扩增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸检测的探 针。
[0011] 优选的，所述用于祀多核巧酸检测的探针序列为：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCT GGCAACAAAAGT-3^ 〇
[0012] 优选的，所述用于祀多核巧酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别为：上游引 物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3' ；下游引物：5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。
[0013] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒还包括内标，所述内标序 列为：5，-TTCTCAGCCTTCGCACGCGTATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCGGTCTGTGGTATGCACGAAGGTC TTTGAAGTTTGTGCTGTCTTCCATTCTCTGTCGTGCCATCT-3 >。
[0014] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒还包括用于内标片段扩 增的上下游引物和用于检测内标的探针，且所述检测内标的探针序列为：5' -ATTACTCTTGTC ACAGCGTCGTTTGCG-3'。
[001引优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒中还包括酶混合液，所述 酶混合液中包括耐热DNA聚合酶和尿喀晚DNA糖基化酶，同时在所述PCR反应液中还包括 加TP。
[0016] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒还包括阳性对照和阴性 对照。
[0017] 本发明还提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，所述B族链球菌 PCR巧光探针法核酸检测试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括用于祀多核巧酸扩 增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸检测的探针，且所述用于祀多核巧酸扩增的 上游引物和下游引物的序列分别为：上游引物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3';下游引物： 5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。
[0018] 本发明还提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，所述B族链球菌 PCR巧光探针法核酸检测试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括用于祀多核巧酸扩增 的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸检测的探针，且所述用于祀多核巧酸检测的探 针序列为：5'-CAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGT-3，。
[0019] 本发明的实施例提供的技术方案可W包括W下有益效果：
[0020] 本发明提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，所述B族链球菌PCR 巧光探针法核酸检测试剂盒包括：核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷 0.05-0.51111/1、氯化钟100-3001111/1、十二烷基横酸钢0.05-3%和乙醇0.01-1%;所述口〇? 反应液包括用于祀多核巧酸扩增的上游引物、下游引物W及用于祀多核巧酸检测的探针。