加热，不易引起气溶胶污染；3)检测灵敏度可达500copies/m;4)对PCR反应体系 进行了优化组合，利用UNG酶可W降解含加的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶 和加TP，可W预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；5)在样本提取过程中增加了 内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴 性。巧光定量PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值判断GBS-DNA阴阳性，检测结果可用 于GBS感染的辅助诊断W及药物疗效的观察。
[0067] 本实施例还包括B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒准确性实验，利用本 实施例提供的B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒检测企业工作参考品，阴阳性参 考品符合率为100 %。本试剂盒检测阴阳性企业工作参考品各10例，检测结果如表2所示：
[0068] 表2 :准确性检测结果
[0069]
[0070] 图1所示为试剂盒检测阳性参考品的扩增曲线；图2所示为试剂盒检测阴性参考 品的扩增曲线。由图1和图2可知，阴阳性各10例企业工作参考品的符合率为100%。
[0071] 所示为8份企业阳性参考品B族链球菌的扩增曲线，由图可知，8份参考品的扩增 曲线均呈S型，有Ct值且Ct《38,8份参考品均为阳性，且8份阳性参考品出现交叉反应 率=0,表明本B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒检测的准确性较高。
[0072] 请参考图3,所示为本B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒特异性实验的 扩增曲线图。本实施例还包括B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒特异性实验，与 临床常见病原体：乙型肝炎病毒（皿V)、丙型肝炎病毒（HCV)、单纯单纯胞疹病毒1型化SV1 orHHV-1)、沙眼衣原体（CT)、解脈脈原体扣U)无交叉反应，检测结果为阴性，表明本B族链 球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒特异性强。
[0073] 进一步，本实施例还包括B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒精密度实验， 分别用Ξ批试剂盒（2015001、2015002、2015003)检测高、中、低Ξ个浓度样本，每个样本各 检测8个重复。具体的检测结果如表3-6和图4-6所示，图4-6分别所示为2015001批试 剂批内精密度检测扩增曲线，2015002批试剂批内精密度检测扩增曲线W及2015003批试 剂批内精密度检测扩增曲线。精密度实验表明本B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂 盒批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10%。
[0074] 表3 :2015001批试剂批内精密度检测结果统计
[00巧]
[0076]
[0077] 表4 :2015002批试剂批内精密度检测结果统计
[0078]
[0079] 表5 :2015003批试剂批内不精密度检测结果统计
[0080]
[008。 表6 :批间精密度检测结果
[0082]
[0083]
[0084] 本方案还包括DM不同提取方法对GBS-DNA检测的影响实验。选择6个梯度样 本，分别用核酸快速释放法和煮沸法提取核酸检测，检测结果数据如表7、图7和图8所示， 图7和图8所示分别为核酸快速释放法扩增曲线图和煮沸法扩增曲线图。DNA不同提取方 法对GBS-DNA检测的影响实验的结果表明：通过同时检测梯度稀释样本发现，本发明的核 酸快速释放法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明方法操作更为简便快 速，无需加热。同时，煮沸法试剂没有内标监测，如提取的DNA中有PCR抑制物存在时，会导 致GBS阳性样本检测为阴性，即出现假阴性，本发明的快速检测试剂盒中加入内标，可W有 效监控假阴性的存在。
[0085] 表7 :核酸快速释放法与煮沸法提取核酸对比检测的检测结果
[0086]
[0087]
[008引W上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明 的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 [0089]W上所述仅是本发明的【具体实施方式】，使本领域技术人员能够理解或实现本发 明。对运些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可W在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的运些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种核酸释放剂在B族链球菌检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷 0.05-0.5禮/1、氯化钾 100-3001111/1、十二烷基磺酸钠0.05-3%和乙醇0.01-1%。2. -种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所述B族链球菌PCR 荧光探针法核酸检测试剂盒包括：核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷 0· 05-0. 5mM/L、氯化钾 100-300mM/L、十二烷基磺酸钠 0· 05-3%和乙醇 0· 01-1% ;所述PCR 反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。3. 根据权利要求2所述的B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所 述用于靶多核苷酸检测的探针序列为：5' -CAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGT-3'。4. 根据权利要求2所述的B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所 述用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别为： 上游引物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3' ； 下游引物：5, -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。5. 根据权利要求1所述的B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所 述B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒还包括内标，所述内标序列为： 5'-TTCTCAGCCTTCGCACGCGTATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCGGTCTGTGGTATGCACGAAGGTCT TTGAAGTTTGTGCTGTCTTCCATTCTCTGTCGTGCCATCT-3 '。6. 根据权利要求5所述的B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所 述B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒还包括用于内标片段扩增的上下游引物和用 于检测内标的探针，且所述检测内标的探针序列为： 5'-ATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCG-3' 。7. 根据权利要求1所述的B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所 述B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐 热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶，同时在所述PCR反应液中还包括dUTP。8. 根据权利要求1-7任一项所述的B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特 征在于，所述B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。9. 一种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所述B族链球菌PCR 荧光探针法核酸检测试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的 上游引物、下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，且所述用于靶多核苷酸扩增的上游 引物和下游引物的序列分别为： 上游引物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3' ； 下游引物：5, -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3'。10. -种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，其特征在于，所述B族链球菌PCR 荧光探针法核酸检测试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的 上游引物、下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，且所述用于靶多核苷酸检测的探针 序列为：5' -CAAATAACAITTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGT-3'。
【专利摘要】本发明提供一种B族链球菌PCR荧光探针法核酸检测试剂盒，包括：核酸释放剂和PCR反应液，核酸释放剂包含莎梵婷0.05-0.5mM/L、氯化钾100-300mM/L、十二烷基磺酸钠0.05-3％和乙醇0.01-1％；PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针。本试剂盒采用核酸释放法，通过强烈蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，可以对围产期孕妇生殖道分泌物和直肠分泌物等未知样本中的B族链球菌-DNA进行快速检测，检测灵敏度可达500copies/ml，为诊断B族链球菌感染提供可靠的实验依据，可以解决现有技术检测特异性差以及灵敏度低的问题。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/46
【公开号】CN105368946
【申请号】CN201510849049
【发明人】戴立忠, 黄河, 邓中平, 易晓明
【申请人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月27日