本发明提供的B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，提供一种操作快捷、方法简便、 检测范围广、灵敏的高的B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒。应用该试剂盒，可W 对围产期孕妇生殖道分泌物和直肠分泌物等未知样本中的B族链球菌-DNA进行快速检测， 为诊断B族链球菌感染提供可靠的实验依据。
[0021] 应当理解的是，W上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不 能限制本发明。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例中提供的B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒检测阳 性参考品的扩增曲线；
[0023] 图2是本发明实施例中提供的B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒检测阴 性参考品的扩增曲线；
[0024] 图3是本发明实施例中提供的B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒特异性 实验的扩增曲线图；
[0025] 图4是本发明实施例中提供的2015001批试剂批内精密度检测扩增曲线；
[0026] 图5是本发明实施例中提供的2015002批试剂批内精密度检测扩增曲线；
[0027] 图6是本发明实施例中提供的2015003批试剂批内精密度检测扩增曲线；
[002引图7是本发明实施例中提供的核酸快速释放法扩增曲线图；
[0029] 图8是本发明实施例中提供的煮沸法扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 运里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述设及 附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。W下示例性实施例 中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附 权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置的例子。
[0031] 本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部 分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处。
[0032] 实施例一
[0033] 本实施例提供一种B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒，所述B族链球菌 PCR巧光探针法核酸检测试剂盒包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵 婷0. 05-0. 氯化钟100-300mM/l、+二烷基横酸钢0. 05-3%和乙醇0. 01-1% ;所述 PCR反应液进一步包括W下组分：
[0034] (1)0. 2μπιο1/1-0. 5ymol/L的用于祀多核巧酸检测的探针，所述用于祀多核巧酸 检测的探针序列为 5' -CAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGT-3'。
[003引 似0. 2mmol/L脱氧核糖核巧S憐酸。
[0036] (3)0. 2μπιο1/1-0. 5ymol/L的用于祀多核巧酸扩增的上游引物和下游引物，所述 用于祀多核巧酸扩增的上游引物、下游引物及用于祀多核巧酸检测的探针是源于B族链球 菌的保守区域的引物和探针，所述用于祀多核巧酸扩增的上下游引物的序列为：上游引物： 5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3';
[0037] 下游引物：5 ' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3 '。
[003引 （4) 10XPCR反应缓冲液5μ1。
[0039] 优选的，所述10XPCR反应缓冲液包括抑7. 5的200mmol/LΞ径甲基氨基甲烧盐 酸盐溶液、20mmol/L氯化儀溶液、500mmol/L氯化钟溶液、0. 2% (体积/体积）曲拉通溶液 和10% (体积/体积）甲酯胺溶液。
[0040] 本发明提供一种操作快捷、方法简便、检测范围广、灵敏的高的B族链球菌PCR巧 光探针法核酸检测试剂盒。应用该试剂盒，可W对围产期孕妇生殖道分泌物和直肠分泌物 等未知样本中的B族链球菌-DNA进行快速检测，为诊断B族链球菌感染提供可靠的实验依 据。
[0041] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒进一步包括内标，所述内 标的序列为：5'-TTCTCAGCCTTCGCACGCGTATTACTCTTGTCACAGCGTCGTTTGCGGTCTGTGGTATGCACG AAGGTCTTTGAAGTTTGTGCTGTCTTCCATTCTCTGTCGTGCCATCT-3 >。
[0042] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒进一步包括用于内 标片段扩增的上游引物、下游引物和用于检测内标的探针，所述用于内标片段扩增的上 游引物和下游引物序列分别为：上游引物：5' -TTCTCAGCCTTCGCACGCG-3';下游引物： 5' -AGATGGCACGACAGAGAATGGAAG-3';所述检测内标的探针的序列为：5'-ATTACTCTTGTCACAG CGTCGTTTGCG-3' 。
[0043] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒进一步包括酶混合液，所 述酶混合液中包括耐热DM聚合酶和尿喀晚DM糖基化酶，同时在所述PCR反应液中还包 括加TP。利用UNG酶可W降解含加的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和加TP， 可W预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。
[0044] 优选的，所述B族链球菌PCR巧光探针法核酸检测试剂盒进一步包括阳性对 照和阴性对照。其中，阳性对照为临床医院收集的B族链球菌强阳性样本，其浓度为 1. 00-5. 00E+05copies/ml;阴性对照为不含有B族链球菌的灭活阴性临床样本。
[004引实施例二
[0046] 本实施例提供上述实施例1所述B族链球菌核酸检测试剂盒用于检测生殖道分泌 物和直肠分泌物等未知样本中的B族链球菌-DNA的操作步骤是：
[0047] -、试剂准备
[0048] 根据待测样本、阴性对照和阳性对照数量，按比例（反应液38-42μ1/人份+酶混 合液1-2μ1/人份+内标1μ1/人份）取相应量的反应液、酶混合液及内标，充分混匀成 PCR-mix，瞬时离屯、后备用。
[0049] 二、样本处理
[0050] 1、方法A:-步法
[005。 （1)每个PCR反应管中加入核酸释放剂3-5μ1 (建议深吸浅打，避免出现气泡）， 并依次加入待测样本、阴性对照、阳性对照各2-4μ1，吸打4-6次混匀（轻轻吸打，避免出现 气泡）；
[0052] (2)间隔10分钟W上，每管加入PCR-mix38-42μ1，吸打混匀4-6次，盖上管盖 (去除气泡后），300化pm离屯、20秒。
[005引 2、方法B:浓缩法
[0054] (1)取100-500μ1待测样本，13, 000巧m离屯、5分钟后吸弃上清，加入30-50μ1 释放剂，静置10分钟后，备用；
[00巧](2)每个反应管加入上述经预处理的待测样本、阴性对照、阳性对照5-10μ1 ;
[0056] (3)每管加入PCR-mix38-42μ1，盖上管盖（去除气泡后），3000巧m离屯、20秒。
[0057] S、巧光PCR反应
[0058] (1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。
[0059] 似巧光检测通道选择：选择FAM通道巧epo;rtere:FAM,如enche;r:None)检测 GBS;选择肥X或VIC通道巧巧orteriVIC,如enche;r:None)检测内标；参比巧光（Passive Reference)设置为none。
[0060] (3)巧光PCR反应条件见表1 :
[006。 表1:巧光PCR反应条件 [0062]
[006引四、结果分析
[0064] 反应结束后，仪器自动保存结果，可W利用仪器自带的软件进行自动分析（也可 W手动调苄基线的开始值、结束值W及阔值线值进行分析），然后记录样本Ct值结果。扩增 曲线与阔值线的交点，称为Ct(即cyclet虹eshold，指PCR反应管内的巧光信号达到设定 的阔值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，可W判断检测结果。对于 测定Ct值《38的样本，报告为GBS-DNA阳性；对于测定Ct值〉38的样本，同时，内标检测 为阳性（Ct值《40)，报告为GBS-DNA阴性；对于测定无Ct值的样本，同时，内标检测为阳 性（Ct值《40)，报告为GBS-DNA阴性。若内标Ct值>40或无显示，则该样本的检测结果无 效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
[0065] 本方案中方法A又称一步法，其特点是简单；方法B又称为浓缩法，其特点是灵敏 度更高，当样本中细胞数量较少，浓度较低时，适合使用方法B。
[0066] 与市面现有试剂盒相比，本发明有W下优点：1)样本处理简便，提取效率高，对 GBS-DNA的提取方法进行了比较和优化，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂， 快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取； 2)不需要