一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物检测试剂的研发，尤其是一种用于结核杆菌利福平耐药快速 检测的引物及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 利福平自1971年发明W来，一直是抗结核化疗方案中的关键药物之一，可缩短结 核病的疗程。结核杆菌对利福平耐药常导致疗程延长、患者愈后不良甚至化疗失败。快速检 测获得菌株的耐药性信息，及时设计、调整临床化疗方案，是治疗结核病的关键。目前，常规 的"金标准"固体培养基药敏检测法，是将菌株接种到含有被检测药物的固体培养基上进行 培养，观察其生长情况来判断耐药性，但是，此方法耗时长，一般需要1个月，且费用高，已 不能满足耐药结核病早发现、早治疗的迫切需求。一些其他方法也有各自的局限性，例如， PCR-SSCP法检测虽然耗时短，但是其操作复杂，结果判读容易受到电泳条件、W及凝胶染色 条件的影响，而不易判断，不易在基层推广。PCR-DNA测序法虽然结果较准确，但DNA测序 耗时长，费用高，不易在边远地区推广。ropB-LIPA化ineProbAssay)法中待检样品的制备 质量影响其检测结果，XpertM忧/RIF法仪器价格高，操作条件要求较高，推广受限。因此， 一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测引物及其试剂盒被提出，本发明依据结核杆菌rpoB 基因中利福平耐药决定区的DM序列，设计检测其突变的引物，所采用的方法属于巧光PCR 烙解曲线法，本发明设计的引物序列及其组合具有独特性，检测结果图形可视容易判读，利 福平耐药检测的敏感性为80. 95% ;特异性75. 86%，获得菌株的耐药性信息消耗的时间不 超过3天，在结核杆菌利福平耐药性检测中可起到较好的辅助诊断作用。另外，菌株ro地 基因中利福平耐药决定区的同义突变可能是影响检测特异性的主要原因。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测引物及其试剂盒。
[0004] 本发明的目的是提供一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物，所述引物包 括如下引物的至少一组： 阳005] 第一组；
[0006]巧〇8化抓日扣：CGCCGCGATCAAGGAGTTC
[0007] rpoBReverse ：GCCCGGCACGCTCATGT
[0008]第二组：
[0009]巧oB-F:AGCCAGCTGAGCCAATTCAT
[0010]巧oB-R :GCCCGGCACGCTCACGT
[0011] 第Ξ组：
[0012] rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG
[0013] rpoB516-R ：GCACGCTCACGTGACAGAC
[0014] 一种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒，其特征在于：至少包括引物
[0015]巧oB化rwarD :CGCCGCGATCAAGGAGTTC
[0016] rpoBReverse ：GCCCGGCACGCTCATGT
[0017] 或者：至少包括引物 阳0化]巧oB-F :AGCCAGCTGAGCCAATTCAT
[0019]巧oB-R :GCCCGGCACGCTCACGT
[0020] 或者產少包括引物
[0021] rpoB516-F ：AGGAGTTCTTCGGCACCAG
[0022] rpoB516-R ：GCACGCTCACGTGACAGAC
[0023] 一种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒的应用，其特征在于：主要包 括如权利2所述的用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒在PCR扩增中的应用。
[0024] 表1为：实验数据准确率数据表 阳0巧]
[00%] 本发明还设及使用上述用于结核杆菌利福平耐药性快速检测引物组制成的试剂 盒，采用高分辨率烙解曲线（HRM)技术，建立了快速检测结核杆菌利福平耐药的方法。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有检测时间短，一般不超过3天，准确率高，操作简单， 费用低，易推广等特点。
【附图说明】 阳02引图1是第一组引物HRM分析结果。
[0029] 图2是第二组引物HRM分析结果。
[0030] 图3是第Ξ组引物HRM分析结果。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1 :参照图1，为本发明实施例1的实验结果。
[0032] 实验方案如下： 阳〇3引 1、试验方法：
[0034] (1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管 中，85°C金属浴灭活45min。
[0035] 似按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DM。
[0036] 做ii DM浓度，按照不同的浓度稀释到lOug/ml。
[0037] 反应体系：总体积lOul(HRMMix:5ul;MgCl2:l.化 1 巧2〇 :2. 3ul;第一组引物：
[0038]巧oB化rwarD :CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse :GCCCGGCACGCTCATGT各 0. 5ul;DNA模板：lul)
[0039]反应参数：预变性 95°ClOmin;变性 95°C10s;退火 62°C15s;sectarge巧3°C;延 伸 72°C10s;95°CImin;40°CImin;70°CIs;95°Cs;40°C30s;共 50 个循环。 W40] 2实验结果判断：
[0041] (1)每个样品设置3个重复。
[0042] (2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp< 30。如果Cp值大于30,则要稀释样品， 重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0. 5之内W减小试验误 差。
[00创 （3)HRM检测结果如图1所示，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断 为突变株。 W44] 实施例2 :参照图2,为本发明实施例2的实验结果。 W45] 实验方案如下：
[0046] 1、试验方法：
[0047] (1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管 中，85°C金属浴灭活45min。
[0048] (2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DM。 W例 做iiDNA浓度，按照不同的浓度稀释到lOug/ml。 阳化0] 反应体系：总体积lOuUHRMMix:5ul;MgCl2:l. 2ul巧2〇 :2. 3ul;第二组引物：
[0051] 巧oB-F:AGCCAGCTGAGCCAATTCAT和巧oB-R:GCCCGGCACGCTCACGT各 0.加 1;DNA模 板：邮）
[0052] 反应参数：预变性 95°ClOmin;变性 95°C10s;退火 62°C15s;sectarget53°C;延 伸 72°C10s;95°CImin;40°CImin;70°CIs;95°Cs;40°C30s;共 50 个循环。
[0053] 2实验结果判断：
[0054] (1)每个样品设置3个重复。 阳化5] (2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp< 30。如果Cp值大于30,则要稀释样品， 重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0. 5之内W减小试验误 差。
[0056] (3)HRM检测结果如图2所示，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断 为突变株。 阳057] 实施例3 :参照图3,为本发明实施例3的实验结果。
[0058] 实验方案如下：
[0059] 1、试验方法：
[0060] (1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管 中，85°C金属浴灭活45min。
[0061] (2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DM。 阳0创 做iiDNA浓度，按照不同的浓度稀释到lOug/ml。
[0063] 反应体系：总体积 10ul(HRMMix:5ul;MgCl2:l.化 1 出2〇:2. 3ul;第Ξ组引物： 巧OB516-F:AGGAGTTCTTCGGCACCAG和巧OB516-R:GCACGCTCACGTGACAGAC各 0. 5ul;DNA模 板：邮）
[0064] 反应参数：预变性 95°ClOmin;变性 95°C10s;退火 62°C15s;sectarge巧3°C;延 伸 72°C10s;95°CImin;40°CImin;70°CIs;95°Cs;40°C30