s;共 50 个循环。 W65] 2实验结果判断：
[0066] (1)每个样品设置3个重复。
[0067] (2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp< 30。如果Cp值大于30,则要稀释样品， 重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0. 5之内W减小试验误 差。 W側 做HRM检测结果如图3所示，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断 为突变株。 W例实施例4 :实验方案如下：
[0070] 1、试验方法：
[0071] (1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管 中，85°C金属浴灭活45min。
[0072] (2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DM。 阳〇7引 做iiDNA浓度，按照不同的浓度稀释到lOug/ml。
[0074]反应体系：总体积lOul(HRMMix:5ul;MgCl2:l.2ul巧2〇:2. 3ul;第一组引物：
[0075]巧oB化rwarD:CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse:GCCCGGCACGCTCATGT各 0. 5ul;DNA模板：lul)
[0076]反应参数：预变性 95°ClOmin;变性 95°C10s;退火 62°C15s;sectarget53°C;延 伸 72°C10s;95°CImin;40°CImin;70°CIs;95°Cs;40°C30s;共 50 个循环。
[0077]2实验结果判断： W78] (1)每个样品设置3个重复。
[0079] (2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp< 30。如果Cp值大于30,则要稀释样品， 重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0. 5之内W减小试验误 差。
[0080] (3)HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同且与野生型相同，说明第一 组引物对所检测菌株不具备特异性。将试验中所用的第一组引物rpoB化rwarD: CGCCGCGATCAAGGAGTTC和巧oBReverse:GCCCGGCACGCTCATGT更换为第二组引物巧oB-F: AGCCAGCTGAGCCAATTCAT和巧oB-R:GCCCGGCACGCTCACGT，其他实验数据不变，得出HRM检测 结果与图2-致，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判定样品为突变株。 阳0川实施例5 :实验方案如下： 阳0間 1、试验方法：
[008引 （1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管 中，85°C金属浴灭活45min。
[0084] (2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DM。 阳0财 做iiDNA浓度，按照不同的浓度稀释到lOug/ml。
[0086]反应体系：总体积lOul(HRMMix:5ul;MgCl2:l.化 1 巧2〇 :2. 3ul;第一组引物：
[0087]巧oB化rwarD:CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse:GCCCGGCACGCTCATGT各 0. 5ul;DNA模板：lul)
[0088] 反应参数：预变性 95°ClOmin;变性 95°C10s;退火 62°C15s;sectarget53°C;延 伸 72°C10s;95°CImin;40°CImin;70°CIs;95°Cs;40°C30s;共 50 个循环。
[0089] 2实验结果判断：
[0090] (1)每个样品设置3个重复。
[0091] (2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp< 30。如果Cp值大于30,则要稀释样品， 重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0. 5之内W减小试验误 差。
[0092] (3)HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同且与野生型相同，说明第一 组引物对所检测菌株不具备特异性。将试验中所用的第一组引物rpoB化rwarD: CGCCGCGATCAAGGAGTTC和巧oBReverse:GCCCGGCACGCTCATGT更换为第Ξ组引物巧OB516-F: AGGAGTTCTTCGGCACCAG和巧OB516-R:GCACGCTCACGTGACAGAC，其他实验数据不变，得出HRM 检测结果与图3-致，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判定样品为突变株。
[0093] 实施例6:实验方案如下：
[0094] 1、试验方法：
[00巧](1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管 中，85°C金属浴灭活45min。
[0096] (2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DM。
[0097] 做ii DM浓度，按照不同的浓度稀释到lOug/ml。
[0098]反应体系：总体积lOul(HRMMix:5ul;MgCl2:l.化 1 巧2〇 :2. 3ul;第一组引物：
[0099]巧oB化rwarD:CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse:GCCCGGCACGCTCATGT各 0. 5ul;DNA模板：lul) 阳 100]反应参数：预变性 95°ClOmin;变性 95°C10s;退火 62°C15s;sectarget53°C;延 伸 72°C10s;95°CImin;40°CImin;70°CIs;95°Cs;40°C30s;共 50 个循环。 阳101] 2实验结果判断： 阳102] (1)每个样品设置3个重复。
[0103] (2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp< 30。如果Cp值大于30,则要稀释样品， 重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0. 5之内W减小试验误 差。
[0104] (3)HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同且与野生型相同，说明第一 组引物对所检测菌株不具备特异性。将试验中所用的第一组引物rpoB化rwarD: CGCCGCGATCAAGGAGTTC和巧oBReverse:GCCCGGCACGCTCATGT更换为第二组引物巧OB516-F: AGGAGTTCTTCGGCACCAG和巧OB516-R:GCACGCTCACGTGACAGAC，其他实验数据不变，得出 HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型相同，则说明第二组引物对所检测 菌株也不具备特异性，再将引物更换位第Ξ组引物rpoB516-F:AGGAGTTCTTCGGCACCAG和 巧OB516-R:GCACGCTCACGTGACAGAC，其他实验数据不变，得出HRM检测结果与图3-致，样品 的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判定样品为突变株。
【主权项】
1. 一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物，所述引物包括如下引物的至少一 组： 第一组： rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT 第二组： rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT 第三组： rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG rpoB516-R:GCACGCTCACGTGACAGAC。·2. -种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒，其特征在于：至少包括如权利 要求1所述的引物中的至少一组。3. -种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒的应用，其特征在于：主要包括 如权利2所述的用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒在PCR扩增中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测引物及其试剂盒，所述引物包括如下引物的至少一组：第一组：rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC？rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT第二组：rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT？rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT第三组：rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG？rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC。
【IPC分类】C12N15/11, C12R1/32, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105368939
【申请号】CN201510751636
【发明人】陈创夫, 曹旭东, 杨敏, 袁俐, 于潞, 杨彩虹, 张辉, 包海洋, 吴长新
【申请人】石河子大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月6日