用于辣椒品种汇丰2号种子纯度鉴定的ssr引物组及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子标记技术，具体涉及利用SSR分子标记检测辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的引物组及方法。
【背景技术】
[0002]‘汇丰2号’是一个杂交一代辣椒品种，中早熟，具有耐贮运，品质佳等特性，同时抗疫病并且耐热、耐寒、耐涝和耐旱能力强，深受消费者和户喜爱(王恒明，李颖，郭汉权，等.早中熟优质辣椒新品种‘汇丰2号’ [J].园艺学报，2010，02期:337-338.)。由于辣椒是一种常见的异花授粉作物，以自交为主，同时存在一定的天然杂交(〈50%)。因此在h制种时即使是其他方法制种(如雄性不育的利用)，也需要人工辅助授粉。在？1代杂交种制种过程中由于生物学混杂和人工操作混杂等原因造成杂交种纯度降低的现象时有发生，给种子生产者、经营者和农户造成巨大经济损失。因此，在制种后和销售前对辣椒h代杂种子进行纯度鉴定是必不可少的。
[0003]目前辣椒种子纯度鉴定通常采用田间小区种植，以形态观察的办法，但由于辣椒生育期长，形态学鉴定通常需要60-120天，周期长，受环境影响大，准确性较低且耗费人力、财力，所以其应用受到限制。随着分子生物技术的迅猛发展，使从DNA水平准确、可靠地对种子纯度进行鉴定成为现实。简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)是一类广泛分布于基因组上的DNA序列，根据其在不同材料间产生不同的重复次数从而产生多态SSR标记。SSR标记是一种共显性标记，具有多态性好、重复性高、操作简便等优点，被认为是一种发展前景看好的DNA指纹技术，目前已广泛运用于水稻、玉米等作物种子纯度鉴定，随着其它小作物基因组学的迅速发展，利用SSR分子标记检测种子纯度的方法也在黄瓜、甘蓝等蔬菜作物中得以应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记、SSR引物组及方法。
[0005]本发明所采取的技术方案是:
一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0143，其定位于辣椒第1号染色体上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分别为141bp和149bp。
[0006]优选的，所述SSR分子标记L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]用于PCR扩增上述SSR分子标记L0143的引物对。
[0008]优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0143的引物对，其序列如下所示:
L0143F:ATGGAGCACCATACTCAAACAACC (SEQ ID N0.3)；
L0143R:GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG (SEQ ID N0.4)。
[0009]一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0622，其定位于辣椒第6号染色体上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分别为196bp和208bp。
[0010]优选的，所述SSR分子标记L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0011]用于PCR扩增上述SSR分子标记L0622的引物对。
[0012]优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0622的引物对，其序列如下所示:
L0622F:GCTCATCAACCCACCTTCATCA (SEQ ID N0.7)；
L0622R:ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG (SEQ ID N0.8)。
[0013]一种利用SSR引物组鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的方法，包括如下步骤:
(1)以待检测辣椒幼苗基因组DNA为模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物对进行PCR扩增；
(2)对PCR产物进行凝胶电泳检测；如果产物中同时含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的条带，或者同时含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的条带，则该辣椒样品为‘汇丰2号’真杂种。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明的SSR标记、引物组以及方法可将‘汇丰2号’杂交种与其母本、父本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本和操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
[0015]本发明引物组还可以用于辣椒品种‘粵红1号’、‘汇丰1号’、和‘汇丰5号’种子真伪性的鉴定。
【附图说明】
[0016]图1为L0143引物对鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的部分PCR产物电泳图，其中PpP2*别为母本和父本泳道，其特征带型分别长141bp和149bp ;编号1-20为‘汇丰2号’杂交种泳道，除编号17的单株为父本特征带型外，其它都同时具有母本和父本特征条带；
图2为L0622引物对鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的部分PCR产物电泳图，其中P1、P^别为母本和父本泳道，其特征带型分别长196bp和208bp ;编号1-20为‘汇丰2号’杂交种泳道，除编号17的单株为父本特征带型外，其它都同时具有母本和父本特征条带；图3为L0143和L0622的引物对同时扩增‘粵红1号’、‘汇丰1号’、‘汇丰2号’和‘汇丰5号’4个辣椒品种的电泳图，其中第1、2泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘粵红1号’的带型；第3、4泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘汇丰1号’的带型；第5、6泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘汇丰2号’的带型；第7、8泳道分别为L0143和L0622的引物对扩增‘汇丰5号’的带型，每个品种都有其特异的带型组合，能与其它3个品种区分。
【具体实施方式】
[0017]一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0143，其定位于辣椒第1号染色体上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分别为141bp和149bp。
[0018]优选的，所述SSR分子标记L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0019]用于PCR扩增上述SSR分子标记L0143的引物对。
[0020]优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0143的引物对，其序列如下所示:
L0143F:ATGGAGCACCATACTCAAACAACC (SEQ ID N0.3)；
L0143R:GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG (SEQ ID N0.4)。
[0021]一种用于鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的SSR分子标记L0622，其定位于辣椒第6号染色体上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分别为196bp和208bp。
[0022]优选的，所述SSR分子标记L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0023]用于PCR扩增上述SSR分子标记L0622的引物对。
[0024]优选的，用于PCR扩增SSR分子标记L0622的引物对，其序列如下所示:
L0622F:GCTCATCAACCCACCTTCATCA (SEQ ID N0.7)；
L0622R:ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG (SEQ ID N0.8)。
[0025]一种利用SSR引物组鉴定辣椒品种‘汇丰2号’种子纯度的方法，包括如下步骤:
(1)以待检测辣椒幼苗基因组DNA为模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物对进行PCR扩增；
(2)对PCR产物进行凝胶电泳检测；如果产物中同时含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的条带，或者同时含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的条带，则该辣椒样品为‘汇丰2号’真杂种。
[0026]优选的，步骤(1)中提取辣椒幼苗基因组DNA的方法为TPS法，步骤如下:
①将约200mg辣椒幼苗叶片放入2.0ml离心管中，每个管中插一根塑料研磨棒，用长柄镊子夹住在液氮中速冻约30s后快速研磨成粉末，