专利名称：转基因棉花种子纯度鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因农作物种子纯度的鉴定方法，尤其是一种转基因棉花种子纯度鉴定方法，属于农业科学技术领域。
背景技术：
转基因抗虫棉由于在遏制棉虫为害、节省农本、降低劳动强度、减少因喷施农药带来的环境污染、促进农田微观和宏观环境改善等多方面的作用，越来越引起各国科研工作者的重视[1，2，3]。抗虫棉是中国目前准予商品性生产的农作物之一。但在抗虫棉推广过程中缺乏快速有效的纯度鉴定方法，抗虫棉中混杂非抗虫棉种子，将使抗性问题变得不可预测和控制。有研究表明[3]用不同龄期的棉铃虫在棉田内接虫调查表明，棉铃虫3龄以上幼虫有在棉株间转株扩散的行为。如果在抗虫棉中混有较多地非抗虫棉种子，则非抗虫棉株上的3龄以上幼虫可转移到附近的抗虫棉株上，造成取食、存活和抗性淘汰筛选、会加速棉铃虫抗性发展速度；而通过保证田间抗虫棉种子的纯度，将有助于控制昆虫抗性发展，保持品种的持续抗性。
关于转基因棉花纯度快速检测方法，利用CAB Abstracts光盘(1984-2001年)、AGRIS光盘(1975-2000年)、AGRICOLA光盘(1970-2000年)，按关键词“Purity”and“Transgenic Cotton”所做的计算机文献检索结果，尚未发现国外有此类相关研究的文献报道。
在国内，李燕蛾等(1998)[4]报道一种效果较好的转基因棉花纯度快速测定方法，将转基因棉花种子经H2O2表面消毒后，无菌水浸种24小时，种入含卡那霉素(浓度1g/L)的1/2MS种苗培养基，27±2℃培养4天，根据棉苗子叶是否出现黄斑或变为黄化苗，来确定该棉种的抗虫性，依此来检测转基因棉花的纯度。但该方法存在以下缺点①对试验设施要求较高，需配制特定的组织培养基，无菌操作条件要求严格，难以实现农作物品种纯度检测所需的操作简单、快速、高效、具有可普及性等基本目标，因此无法在农业生产中推广应用；②祝建波等(2000)[5]利用李燕蛾报道的方法进行验证性试验，发现该方法会严重抑制转基因棉苗胚根及根的生长，对棉苗的正常生长发育有不良影响。
另外，马丽华等(2000)[6]、祝建波等(2000)[5]、周玉(2000)等[7]报道了转Bt基因抗虫棉采用卡那霉素涂叶的田间快速检测方法，但这些方法仅可用于大田抗虫棉品种的育种筛选或繁殖过程中的棉种抗虫性基因的纯化，不能直接用于转基因抗虫棉销售过程中种子纯度的快速鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提出一种无需MS固体培养基、操作简单的转基因棉花种子纯度鉴定方法，以解决目前抗虫棉种产业化过程中急需解决的种子纯度鉴定问题，为转基因棉花种子的生产销售和推广应用创造良好条件。
目前，在农作物基因工程广泛使用一种称Npt-II的报告基因，它来源于细菌转座子Tn5上的aphA2，该基因编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶(aminnoglycoside-3’-phosphotransferase II)，又称新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotrans-frase II)，英文缩写为Npt-II。该酶使氨基糖苷类抗生素(新霉素、卡那霉素、巴龙霉素等)磷酸化而失活。此类抗生素通过抑制原核生物(或真核生物的叶绿体与线粒体)蛋白质生物合成70S起始复合体的生成，并使fMet-tRNA从70S起始复合体上解离，从而阻碍原核生物的蛋白质生物合成。
此类抗生素对植物细胞毒性的机理是与植物细胞叶绿体中的核糖体30S亚基结合，影响70S起始复合体生成，干扰叶绿体的蛋白质生物合成，最终导致植物组织失绿乃至死亡。Npt-II的作用是使ATP分子上的γ-磷酸基转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体亚基的结合，从而使抗生素失活，不再对植物细胞具有毒性作用。
凡具有外源Npt-II基因的转化植物，可以使植物细胞获得对上述抗生素的抗性。因此用此类抗生素处理，凡具有Npt-II基因的棉籽出苗以后子叶为正常绿色；而没有Npt-II基因的普通棉籽出苗以后，其子叶耳基部出现黄斑或扩展为子叶局部乃至整片子叶变黄。
依据上述研究结果，本发明的转基因棉花种子纯度鉴定方法包括以下步骤(1)配液用氨基糖苷类抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龙霉素等)配制(5-15)×106单位/L浓度的浸种水溶液，浸种液体的用量是种子重量的3-5倍；(2)浸种将被测种子加浸种液体后充分摇匀，浸润于液体之中。浸种的时间为24小时左右，浸种温度在25℃±2℃；(3)播种用淡水沙做为发芽床，沙的含水量以手捏成团、松开即散为度，在塑料盘中先铺一层约3厘米厚的沙层，在沙层上播种棉籽，然后盖一层1厘米的沙层，插上标签，用透明的塑料袋封好；(4)出苗把塑料盘放在光线良好的环境中，保持出苗所需的湿度，日间温度控制在25℃以上，夜间温度不低于15℃；(5)考苗经过7天左右，待棉苗子叶完全平展后，对棉苗进行考察，数每个送检样品的总苗数与黄斑苗数，重复2次以上，求平均值，凡在子叶的耳基部出现黄斑，即判定为黄斑苗；(6)计算按以下算式计算抗虫棉种子纯度与黄斑率。1)抗虫棉种子纯度＝(总苗数-黄斑苗数)/总苗数×100％2)黄斑率＝黄斑苗数/总苗数×100％
上述方法突破了以MS固体培养基进行无菌育苗鉴定抗虫棉纯度的常规，利用一定浓度的氨基糖苷类抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龙霉素等)浸种，采用淡水沙做为发芽床，在发芽过程中不会出现种子因病菌感染造成霉变或因培养基组分造成烂根现象，试验无需对棉种进行消毒，无需进行严格的无菌操作，可直接用自来水配制浸种液体。另外，在日间温度25℃以上，夜间温度不低于15℃，鉴定试验也可直接在光线良好的室内进行，无需温光种子发芽箱设备。
不难看出，本发明对试验条件要求简单，试验所用试剂及物品价格低廉，特别适宜在农业领域推广应用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
1、本方法实施的具体步骤为(1)配液用兽用卡那霉素配制107单位/L浓度的浸种水溶液。浸种液体可直接用自来水(或蒸馏水)配制。浸种液体的用量是种子重量的4倍，(2)浸种被测样品为硫酸脱绒的棉花种子。种子加浸种液体后充分摇匀，浸润于液体之中。浸种的时间为24小时左右，浸种温度在25℃±2℃。在浸种过程中罩塑料袋以防止水分蒸发。(3)播种用淡水沙做为发芽床，沙的含水量要适宜，以手捏成团、松开即散为度(含水量为8.3％±0.6％)。在每塑料盘中先铺一层约3厘米厚的沙层，在沙层上播种100粒棉籽，然后盖一层1厘米的沙层，插上标签，用透明的塑料袋封好。(4)出苗保持发芽所需的湿度。把塑料盘放入种子温光发芽箱中，发芽箱的温度控制在27℃±2℃。照光可在种子顶土后进行。每个被测样品重复4次，求平均值。(当日间温度25℃以上、夜间温度不低于15℃时，发芽试验也可直接在光线良好的室内进行，无需温光发芽箱设备。)(5)考苗经过7天左右，棉苗子叶完全平展，对棉苗进行考察，数每个送检样品的总苗数与黄斑苗数，求各重复的平均值。凡在子叶的耳基部出现黄斑，即判定为黄斑苗。(6)计算按以下算式计算抗虫棉种子纯度与黄斑率。1)抗虫棉种子纯度＝(总苗数-黄斑苗数)/总苗数×100％2)黄斑率＝黄斑苗数/总苗数×100％2、最宜卡那霉素浸种浓度的确定
非转基因普通棉省1-省6，用分别5×106单位/L、107单位/L浓度的卡那霉素浸种24小时，试验结果见表1。
表1 不同浓度卡那霉素浸种后棉苗情况
平均总苗数 平均黄斑苗数 平均黄斑率(％)
品种
5g/L 10g/L 5g/L 10g/L 5g/L10g/L
省1 676460 6389.55 98.44
省2 644762 4796.88 100
省3 544753 4698.15 97.87
省4 616061 60100 100
省5 736071 6097.26 100
省6 475147 51100 100
由表1可知，用5×106单位/L卡那霉素浸种，普通棉省1抗虫性的黄斑率最低，为89％；省4、省6最高，达100％。说明普通棉不同品种对卡那霉素的敏感程度存在一定程度的差异，某些普通棉品种对卡那霉素具有一定耐性。
当浸种浓度达107单位/L时，省2、省4、省5及省6黄斑率均达100％，省1及省3也高达98％，6个普通棉品种的平均黄斑率达99.38％，表明在该浓度下可以消除可能由于某些品种本身对卡那霉素有一定耐性而造成对抗性鉴定结果的干扰，从而提供了关于不同品种是否具有抗卡那霉素基因的真实的抗性鉴定结果，尤其是该浓度对棉种出苗率没有产生明显的不良影响(表2中列出了9个不同棉种经卡那霉素浸种后的平均出苗率与清水浸种后的平均出苗率)。因此，确定把107单位/L卡那霉素浓度作为鉴定棉花品种是否具有抗卡那霉素基因比较合适的浓度。根据该浓度浸种后出现的黄斑率高低，可判断一个品种是否是转基因抗虫棉或非转基因普通棉。
由表2的鉴定结果可见，其中K068、凡8、R086为转基因抗虫棉；石远321、宁早1号、泗168为非抗虫的普通棉；宁杂210、宁杂209、宁杂205为转基因抗虫杂种棉。
表2、107单位/L卡那霉素对不同品种属性鉴定结果3、几个抗虫棉品系(或杂交种)纯度鉴定结果
用107单位/L浓度的卡那霉素浸种，各品种的黄斑率结果见表3。4个2000年参加抗虫棉区试的品系，其中GK22的品种纯度为100％，GK14为91.78％，苏抗103为83.12％；但盐抗1211的品种纯度仅16.95％，说明该品种的抗虫性已极度退化，或抗虫基因发生了丢失。
抗虫棉品系A065的品种纯度很低，仅68.99％。杂交抗虫棉宁杂210的品种纯度为99.46％，宁杂209的品种纯度为96.07％，宁杂202的品种纯度为91.01％；双价抗虫棉SGK321的品种纯度为98.52％；美国2个抗虫棉32B、33B的品种纯度均为100％。
表3 卡那霉素浸种法对棉花抗虫性纯度鉴定结果
为了保障品种的抗虫性，防止棉种抗虫性的退化，作为生产上推广的抗虫棉良种，其抗虫性纯度应在95％以上，黄斑率应控制在5％以内。育种家掌握的原种纯度则不低于99％。4、品系黄斑率与抗虫性的相关分析
随机选择2000年抗虫棉区试中的5个品系，分析结果表明，黄斑率与抗虫性指数具有显著的负相关(R＝-0.9562*)，即品系的黄斑率愈高，其抗虫性愈差；反之亦然。当品系的黄斑率在80％以上时，可以判断该棉种基本上不再具有抗虫性(见表4)，是一种不再具有商品价值退化的或掺杂的假抗虫棉。
表4、黄斑率与抗虫性相关分析注2000年江苏省抗虫棉区试的抗虫性鉴定，依据室内接虫和田间罩笼接蛾二种方法。为了方便数学分析，我们把抗性指标做如下数量化高抗-3；中抗-2；低抗-1；不抗-0。依据室内接虫和田间罩笼接蛾二种方法，对苗期室内鉴定、蕾铃期田间罩笼鉴定结果，按各品系的抗虫性强弱进行数量定级，求得抗虫性平均值，即抗虫性指数。
除卡那霉素之外，采用其它氨基糖苷类抗生素，比如新霉素、巴龙霉素等，只要方法相同、浸种液的浓度适宜，也可以达到同样的鉴定效果。有关实施情况不另一一举例。参考文献[1]Cousin YL，Lyon BR.Transformation of an Australian cottoncultivarprospects for cotton improvement through geneticsengineering.Aust.J Pl.Physiol.，1991，18(8)481-494[2]Benedict JH，et al.Behavior growth survival and plant injury byHeliothis viresences on transgenic Bt cotton..J Econ.Entomol.，1992，85589-593[3]贾士荣，郭三堆，安道昌.转基因棉花.科学出版社.2001年版[4]李燕蛾等.转基因棉花纯度快速测定法.中国棉花，1998，25(8)14[5]祝建波等.转基因棉花的田间筛选技术研究.棉花学报，2000，12(5)230-233[6]马丽华等.转Bt基因棉卡那霉素田间快速检测法.中国棉花，2000，27(12)11-12[7]周玉等.转基因抗虫棉田间快速鉴定方法研究.山东农业科学，2000，(1)48-49
权利要求
1、一种转基因棉花种子纯度鉴定方法。其特征在于包括以下步骤(1)配液用氨基糖苷类抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龙霉素等)配制(5-15)×106单位/L浓度的浸种水溶液，浸种液体的用量是种子重量的3-5倍；(2)浸种将被测种子加浸种液体后充分摇匀，浸润于液体之中。浸种的时间为24小时左右，浸种温度在25℃±2℃；(3)播种用淡水沙做为发芽床，沙的含水量以手捏成团、松开即散为度，在塑料盘中先铺一层约3厘米厚的沙层，在沙层上播种棉籽，然后盖一层1厘米的沙层，插上标签，用透明的塑料袋封好；(4)出苗把塑料盘放在光线良好的环境中，保持出苗所需的湿度，日间温度控制在25℃以上，夜间温度不低于15℃；(5)考苗经过7天左右，待棉苗子叶完全平展后，对棉苗进行考察，数每个送检样品的总苗数与黄斑苗数，重复2次以上，求平均值，凡在子叶的耳基部出现黄斑，即判定为黄斑苗；(6)计算按以下算式计算抗虫棉种子纯度与黄斑率1)抗虫棉种子纯度＝(总苗数-黄斑苗数)/总苗数×100％2)黄斑率＝黄斑苗数/总苗数×100％。
2、根据权利要求1所述的转基因棉花种子纯度鉴定方法，其特征在于所述氨基糖苷类抗生素为卡那霉素，浓度为107单位/L。
3、根据权利要求1所述的转基因棉花种子纯度鉴定方法，其特征在于所述氨基糖苷类抗生素也可以是新霉素、巴龙霉素。
4、根据权利要求1或2所述的转基因棉花种子纯度鉴定方法，其特征在于所述步骤(3)中淡水沙含水量为8.3％±0.6％。
5、根据权利要求1或2所述的转基因棉花种子纯度鉴定方法，其特征在于所述步骤(4)把塑料盘放入种子温光发芽箱中，发芽箱的温度控制在27℃±2℃。
全文摘要
本发明提供了一种转基因棉花(包括杂交棉)种子纯度鉴定方法，该方法通过用氨基糖苷类结构抗生素(卡那霉素等)配制合适浓度的浸种水溶液，将被测种子浸泡后，以不含盐份的淡水沙为发芽床，播种后保持发芽所需的温湿度；经过7天左右，棉苗子叶完全平展，对棉苗进行考察计数，按黄斑率鉴定出种子纯度。本发明对试验条件要求简单，在发芽过程中不会出现种子因病菌感染造成霉变或因培养基组分造成烂根现象，试验无需对棉种进行消毒，无需进行严格的无菌操作，可直接用自来水配制浸种液体，特别适宜在农业领域推广应用。
文档编号G01N33/00GK1394472SQ0111376
公开日2003年2月5日 申请日期2001年7月10日 优先权日2001年7月10日
发明者陈旭升, 狄佳春, 刘剑光, 许乃银, 肖松华 申请人:江苏省农业科学院经济作物研究所