一种提高蛋白纯化纯度的预处理方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】。本发明提供一种蛋白纯化过程的优化步骤，以及该步骤涉及的蛋白吸附材料。本发明所述的蛋白纯化的优化步骤，主要是预处理后、粗分级前，或粗分离过程中，采用本发明提出的非定向蛋白吸附载体，去除杂质蛋白，有利于下一步的分离纯化，提高蛋白纯化产品的纯度。本发明所述的非定向蛋白吸附载体，可以为石墨烯单质，也可以为石墨烯与纳米材料的复合物；其形态可以是粉末状，可以是二维平面状，也可以是三维海绵状；其存在状态可以为固态，也可以为溶液态或分散液。本发明可用于蛋白纯化领域。
【专利说明】一种提高蛋白纯化纯度的预处理方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及蛋白质分离纯化领域，确切的讲，涉及一种蛋白提取液的处理方法以及该方法涉及的蛋白吸附材料。
【背景技术】
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[0002]蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
[0003]分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为预处理、粗分级分离和细分级分离三步。
[0004]预处理，也称前处理:
[0005]分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取获得蛋白质提取液。
[0006]粗分级分离:
[0007]当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。
[0008]细分级分离:
[0009]样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。
[0010]在实际工作中，即使在上述三个步骤中都采用最适合的分离纯化方法，也很难得到高纯度的蛋白质。尤其是性质未知的杂质蛋白或者污染蛋白，现有的技术是很难将其一步去除的，只能采取一系列的步骤；而且这些杂质蛋白、污染蛋白的少量存在也会对目标蛋白的性质研究产生极大的影响。因此，科研工作者和工艺师也在积极地改进现有的纯化方法、或开发新的纯化工艺，以此不断的促进对蛋白质性质的研究；同时蛋白质的性质研究也反过来推动者蛋白分离纯化技术的进步。
【发明内容】
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[0011]本发明的主体思想:
[0012]与上述的蛋白分离步骤中，主要是预处理后、粗分级前，采用本发明提出的非定向蛋白吸附载体，去除杂质蛋白，有利于下一步的分离纯化，提高蛋白纯化产品的纯度。
[0013]本发明涉及的技术方案:
[0014]石墨烯是近几年刚刚发现的新型纳米材料，具有极高的比表面积，理论比表面积高达2630m2 / g。而且具有很好的吸附性能和良好的机械性能，作为吸附材料也得到了很好的开发应用。此外，石墨烯与纳米材料之间的协同效应使这种含有大比表面积的复合材料比单一的纳米材料具有更大的优越性，以石墨烯为载体制备纳米吸附材料也成为当前研究热点。
[0015]发明人长时间进行石墨烯功能化修饰与应用领域。在实验研究中，发现石墨烯或石墨烯与其它纳米材料的复合物对蛋白质具有很好的非定向吸附作用，可以快速、大量的吸附各类杂质蛋白质。在此发现的基础上，发明人经过多次试验，优化了蛋白纯化的步骤，预处理后、粗分级前，或者粗分离之中使用上述石墨烯吸附材料对细胞裂解液或者细胞培养上清液进行处理，有效提高蛋白纯化产品的纯度。
[0016]亦即:本发明提供一种蛋白纯化过程的优化步骤，以及该步骤涉及的蛋白吸附材料。
[0017]1、本发明所述的蛋白纯化的优化步骤，主要是预处理后、粗分级前，或粗分离过程中，采用本发明提出的非定向蛋白吸附载体，去除杂质蛋白，有利于下一步的分离纯化，提高蛋白纯化产品的纯度。
[0018]2、本发明所述的非定向蛋白吸附载体，其特征是，可以为石墨烯单质，也可以为石墨烯与纳米材料的复合物；其形态可以是粉末状，可以是二维平面状，也可以是三维海绵状；其存在状态可以为固态，也可以为溶液态或分散液。
[0019]3、上述2所述的非定向蛋白吸附载体，其特性为:单颗载体的尺寸为1nm至100微米。
[0020]4、上述2所述的石墨烯与纳米材料的复合物,其特征在于:所述的纳米材料包含以下材料中的一种或任意两种及两种以上的混合物:金属纳米粒子，如金、银、氧化铝、氧化铁；半导体纳米晶，如CdTe ;碳纳米管；纳米非金属粉末或溶液；高分子材料。
[0021]5、本发明所述的优化的蛋白纯化步骤为:
[0022](I)准备石墨烯或石墨烯/纳米材料复合材，作为非定向吸附载体；
[0023](2)进行蛋白质纯化的预处理程序，得到细胞裂解液，或者细胞培养上清液；
[0024](3)将上述步骤I得到的载体与步骤2的细胞裂解液中或者细胞培养上清液混合均匀，其中石墨烯质量为细胞裂解液或细胞培养上清液溶液质量的1%——20% ；
[0025](4)将上述混合液搅拌15min-1h,使石墨烯充分吸附杂志蛋白质；
[0026](5)将吸附杂质后的混合液使用滤纸或滤膜过滤；
[0027](6)继续进行蛋白质的后续分离步骤。
[0028]本发明优势:
[0029]本发明利用石墨烯巨大的比表面积，且吸附性能好的特点，将其单独使用或与纳米材料合理复合组装，可起到蛋白非定向吸附的作用。将该材料运用在蛋白分离过程中，主要是预处理后、粗分级前，一步去除多种杂质蛋白，有利于下一步的分离纯化，提高蛋白纯化产品的纯度。该材料具有制备简单，性质稳定的优点；且对环境友好，成本低廉；可以大量快速吸附蛋白；且使用操作简单，不需要操作者具备很高的科技水平都可以进行操作。
【具体实施方式】
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[0030]下面通过具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0031]采用石墨烯/金纳米粒子复合材料进行非定向吸附的蛋白纯化方法:
[0032](I)准备石墨烯/金纳米材料复合材，作为非定向吸附载体:使用氨基环氧加成反应制备超小尺寸氧化石墨烯(<500nm)，试用该方法制备的石墨烯尺寸小，毒性小，便于修饰；用此石墨烯用做基本载体进行金纳米粒子复合；
[0033](2)进行蛋白质纯化的预处理程序:将组织和细胞破碎，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞裂解液作为下步纯化的材料；
[0034](3)将上述步骤I得到的载体与步骤2的细胞裂解液混合均匀，其中石墨烯质量为细胞裂解液或细胞培养上清液溶液质量的1% 20% ;
[0035](4)将上述混合液搅拌15minlh,使石墨烯充分吸附杂志蛋白质；
[0036](5)将及附杂质后的混合液使用滤纸或滤膜过滤；
[0037](6)继续进行蛋白质的后续分离步骤，最终得到纯化的目标蛋白。
【权利要求】
1.一种蛋白纯化过程的优化步骤，以及该步骤涉及的蛋白吸附材料，其特点在于:主要是预处理后、粗分级前，或粗分离过程中，采用本发明提出的非定向蛋白吸附载体，去除杂质蛋白，有利于下一步的分离纯化，提高蛋白纯化产品的纯度。
2.根据权利要求1所述的非定向蛋白吸附载体，其特征是，可以为石墨烯、氧化石墨烯、还原石墨烯，也可以为石墨烯与纳米材料的复合物；其形态可以是粉术状，可以是二维平面状，也可以是三维海绵状；其存在状态可以为固态，也可以为溶液态或分散液。
3.根据权利要求1所述的非定向蛋白吸附载体，其特性在于:单颗载体的尺寸为1nm至100微米。
4.根据权利要求2所述的石墨烯与纳米材料的复合物,其特征在于:所述的纳米材料包含以下材料中的一种或任意两种及两种以上的混合物:金属纳米粒子，如金、银、氧化铝、氧化铁；半导体纳米晶，如CdTe ;碳纳米管；纳米非金属粉末或溶液；高分子材料。
5.根据权利要求1所述的优化的蛋白纯化步骤为: (1)准备石墨烯或石墨烯/纳米材料复合材，作为非定向吸附载体； (2)进行蛋白质纯化的预处理程序，得到细胞裂解液，或者细胞培养上清液； (3)将上述步骤I得到的载体与步骤2的细胞裂解液中或者细胞培养上清液混合均匀，其中石墨烯质量为细胞裂解液或细胞培养上清液溶液质量的1%——20% ； (4)将上述混合液搅拌15min-1h,使石墨烯充分吸附杂志蛋白质； (5)将使用石墨烯进行杂质吸附后的混合液用膜过滤，得到处理后的细胞裂解液或上清液； (6)继续进行蛋白质的后续分离步骤。
【文档编号】B01J20/20GK104130309SQ201310756622
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】刘遵峰, 贾凤美, 刘倩 申请人:常州碳宇纳米科技有限公司