专利名称：一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，属于蛋白质分离纯化技术 领域。
技术背景为了研究蛋白质等生物大分子的细胞定位、相互作用及其动态变化，研究人员急需 新技术和新材料来实现对蛋白质等生物大分子的"标识"、"阅读"和"查询"。现在常用 的荧光标记，由于荧光染料分子荧光特性的限制(荧光光谱较宽、量子产率低)，远远不 能适用于高通量的生物大分子专一标识。藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素-蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和 少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中， 藻胆蛋白和少量无色连接蛋白组成超分子复合体一一藻胆体，高效的吸收和传递光能。在 80年代中期，美国研究藻类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试 剂。由于其独特的优点，藻胆蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点生产过程安全、无毒，光能吸收 强，荧光产率高，超过90%，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以 作双色、三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。但是，由于价格昂贵， 尚未应用到普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。藻胆蛋白及其诊断试剂主要由美国生产，德国也有产品向我国推销，英国和我国台湾 正在研制。最早研制产品的是美国分子探针公司(Molecular Probes, Inc.)，现在Sigma 公司共有6种藻胆蛋白产品，藻胆蛋白-Biotin/Avidin标记物12种，RPE-IgG或RPE-IgM12 种,RPE单抗标记物3种。藻胆蛋白生产沿用已公开的实验室方法。藻胆蛋白的种类包括 异藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)、藻红蓝蛋白(PEC)和藻红蛋白(PE)四大类。其中存在于 蓝藻中的APC是目前常用的藻胆蛋白荧光探针之一，因为，APC亮度大，斯托克位移大。 我国螺旋藻等蓝藻已经开始了工业化培养，资源非常丰富，是分离纯化APC的很好的材料。 国际市场上决定购、销关系的主要是价格因素。影响普及型诊断试剂的开发和应用的主要 因素也是藻胆蛋白价格太高。因此，开发APC的快速大量分离纯化技术，实现高纯度APC 的低成本大量制备，对于APC在普及型诊断试剂的应用具有重要的意义。 发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法。 本发明相对现有方法，只需经过两步柱层析，就能大量得到高纯度的异藻蓝蛋白溶液。一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1) 异藻蓝蛋白的提取 将蓝藻用冻溶和低离子强度溶涨的方法解体溶解，离心分离，取上清液，即得异藻蓝蛋白浆液。(2) 异藻蓝蛋白的初歩纯化用硫酸铵沉淀法，将异藻蓝蛋白从异藻蓝蛋白浆液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用 20mM磷酸缓冲液(pH6.8 7.0)溶解并透析，除去硫酸铵，得异藻蓝蛋白粗提液。(3) 羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白 使用羟基磷灰石在异藻蓝蛋白粗提液中吸附富集异藻蓝蛋白，然后用磷酸缓冲液进行洗脱，得异藻蓝蛋白溶液。这一步骤，可以实现低丰度异藻蓝蛋白的大量浓縮和富集。(4) 离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白 根据异藻蓝蛋白在较宽的pH范围内保持稳定的特性，利用离子交换层析技术，用具有恒定的离子强度、连续pH梯度的缓冲液进行洗脱，即可以得到高纯度的异藻蓝蛋白。 所述步骤(1)中的蓝藻为螺旋藻。所述步骤(1)异藻蓝蛋白的提取的具体操作步骤为将蓝藻藻体按重量体积比1: 1(g/ml或kg/1)加入0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH6.8~7.0)，在-20。C下冷冻，然后在20 25。C下，融化2 3h。反复冻融2-4次后，蓝藻悬液在4。C下，8000 rpm 10000rpm离心 10 min 15min，上清液即为异藻蓝蛋白浆液。所述步骤(2)异藻蓝蛋白的初步纯化的具体操作步骤为向异藻蓝蛋白浆液中加入 固体硫酸铵，至浓度为30%(w/v)，放置4 5h，然后在4。C下，10000 rpm 11000rpm离 心10min 15min，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至最终浓度为60%(W/V)，放 置4h以上，然后在4。C下，10000rpm 11000rpm离心10min 15min，弃上清，取沉淀； 将沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH6.8~7.0)中，然后用20rnM的磷酸缓冲液(pH6.8~7.0) 进行透析，收集透析液，即得异藻蓝蛋白粗提液。上述沉淀与磷酸缓冲液的比例没有严格 限定，只要沉淀能够完全溶解即可。所述步骤(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白的具体操作如下将预先用20mM磷 酸缓冲液(pH6.8~7.0)平衡过的羟基磷灰石，加入异藻蓝蛋白粗提液中，将吸附满异藻 蓝蛋白的羟基磷灰石从溶液中取出，使用20mM磷酸缓冲液(pH6.8~7.0)冲洗羟基磷灰 石，将羟基磷灰石上残余的C-藻蓝蛋白冲洗掉，再用恒定离子强度的缓冲液进行洗脱， 将异藻蓝蛋白洗脱下来，即得异藻蓝蛋白溶液。由于吸附能力的不同，异藻蓝蛋白吸附到 了羟基磷灰石上，而C-藻蓝蛋白却并不发生吸附，仍然存留在溶液中。优选的，所述恒定离子强度的缓冲液为lOOmM磷酸缓冲液(pH6.8 7.0)。所述步骤(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白的具体操作如下取步骤(3)制得 的异藻蓝蛋白溶液，在20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0，含0.05mol/LNaCl)中透析，然后 取透析后的溶液，在琼脂糖凝胶FF ( DEAE Sepharose Fast Flow)离子交换色谱柱上，用 含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0，)洗脱，最后用20mmol/L醋酸缓冲 液(pH5.0，含0.05mol/L NaCl)禾Q 20mmol/L醋酸缓冲液(pH3.6，含0.05mol/LNaCl) 各100mL进行梯度洗脱，洗脱速度为60 70mL/h，检测波长280nm，收集洗脱的蓝液体， 得到纯化的异藻蓝蛋白。优选的，所述的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱是经20mmol/L醋酸缓冲 液(pH5.0，含0.05mol/LNaCl)预先平衡的，规格为0.6X10cm。以上操作步骤如无特别说明，均为本领域常规操作。经吸收光谱检测，得到的纯化异藻蓝蛋白A650/A280达到5.0(图1 )。 一般认为，A650/A280 达到4.5以上，就认为异藻蓝蛋白已经纯化，因此，该离子交换层析得到的异藻蓝蛋白是高纯化的。Native—PAGE电泳检测，只有一个条带，表明分离纯化的APC没有其它蛋白 的污染(图3)。现有技术制备异藻蓝蛋白的方法为将细胞破碎粗提液经过一次羟基磷灰石柱，再用 SephadexG-100凝胶过滤层析，然后再经历一次羟基磷灰石柱层析。对比技术中得到的异 藻蓝蛋白纯度可以达到5.0。与对比技术的三步操作相比，本发明是将粗提液经过一次羟 基磷灰石层析，再经历一次离子交换层析，只需两步操作，就可以得到大量高纯的异藻蓝 蛋白溶液制品，而且有效的降低了成本。现有技术制备异藻蓝蛋白时，所使用的羟基磷灰石层析这一步骤，是预先将羟基磷 灰石装在层析柱内，然后将粗提液进行上柱层析。由于羟基磷灰石柱有层析速度慢的特点， 上样的过程非常耗费时间，这一步是在异藻蓝蛋白提取过程中的非常号费时间的一个步 骤。本发明针对这一现有技术的不足，发明的方法为将预先用20mM磷酸缓冲液 (pH6.8~7.0)平衡过的羟基磷灰石，加入缓冲液同样为20mM磷酸缓冲液(pH6.8~7.0) 的异藻蓝蛋白粗提液中，此时，由于在20mM磷酸缓冲液(pH6.8~7.0)这一特定的离子 强度和pH值条件下，羟基磷灰石对C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的吸附能力的不同，因此异 藻蓝蛋白可以吸附到羟基磷灰石上，而C-藻蓝蛋白却并不发生吸附，仍然存留在溶液中。 将吸附满异藻蓝蛋白的羟基磷灰石从溶液中取出，使用20mM磷酸缓冲液(pH6.8 7.0) 冲洗羟基磷灰石，将羟基磷灰石上残余的C-藻蓝蛋白冲洗掉。再将这些羟基磷灰石安装 到层析柱内，用恒定离子强度的缓冲液进行洗脱，将异藻蓝蛋白洗脱下来，就可以得到大 量比较纯的异藻蓝蛋白。与现有技术相比，本发明在进行羟基磷灰石层析时改变了现有技 术中的上样这一步骤，而是在特定的离子强度和特定的pH条件下使用羟基磷灰石在粗提 液中对异藻蓝蛋白进行选择性吸附，从而达到吸附并富集异藻蓝蛋白的目的。本发明不仅 能将羟基磷灰石层析这一步骤大幅节约时间，而且还可以提高羟基磷灰石的使用效率。本发明的优良效果还在于，以蓝藻为材料，经冻溶和低离子强度溶涨快速提取异藻 蓝蛋白(APC)，经硫酸铵沉淀以后，使用羟基磷灰石层析法进行初步纯化，最后我们根 据异藻蓝蛋白(APC)能够在较宽的pH范围内保持稳定的特性的特点，利用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析技术，用恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液进行洗脱， 可以得到高纯度的异藻蓝蛋白(APC)。与传统的应用分子筛层析结合羟基磷灰石层析的复杂分离纯化程序相比，本方法克 服了难于规模化快速大量制备异藻蓝蛋白的难题，操作简便，省时省力，对设备要求简单， 产率高，容易大量制备并且大大降低了 APC的制备成本，从而为将APC应用于超灵敏的生 物医学检测奠定了基础，具有很好的应用前景和经济效益。
图1分离纯化的异藻蓝蛋白的吸收光谱。最大吸收峰为650nm，在620nm处有一肩 峰。A65。/A娜达到了 5.0，表明已经高度纯化。图2分离纯化的异藻蓝蛋白的荧光发射光谱。用650nm激发，荧光发射峰位于661nm，与标准荧光发射峰相同。图3分离纯化的螺旋藻异藻蓝蛋白的Native — PAGE电泳图谱。在Native — PAGE中，只有一个条带，进一步说明分离纯化的异藻蓝蛋白没有其它蛋白的污染。
具体实施方式
实施例1:一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，步骤如下-(1) 原料为螺旋藻。培养后过滤收集，-20匸冷冻保存。(2) 异藻蓝蛋白的提取取冷冻保存的螺旋藻藻体10g，将螺旋藻藻体加入0.02 mol/L 磷酸缓冲液(pH6.8~7.0) lOrnl，在-2(TC下冷冻，然后在20'C下，融化2. 5h。反复冻融3 次后，螺旋藻悬液在4。C下，10000rpm离心15min，上清液即为异藻蓝蛋白浆液。(3) 异藻蓝蛋白的初步纯化向上述步骤(2)得到的异藻蓝蛋白浆液中加入固体 硫酸铵，至浓度为30%(w/v)，放置4h，然后在4。C下，10000 rpm离心15 min，弃去沉淀， 收集溶液部分。再继续向溶液中加入固体硫酸铵，至终浓度为60y。(W/V)，放置4h以上， 然后在4匸下，10000 rpm离心15min，收集沉淀部分。将沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH6.98)中，然后对20mM的磷酸缓冲液(pH6.98)进行透析，收集透析液，即异藻蓝 蛋白粗提液。(4) 羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白将预先用20mM磷酸缓冲液(pH6.98)平衡 过的羟基磷灰石，加入缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH6.98)的异藻蓝蛋白粗提液中，进 行吸附。将吸附满异藻蓝蛋白的羟基磷灰石从溶液中取出，使用20mM磷酸缓冲液(pH6.98)冲洗羟基磷灰石，将羟基磷灰石上残余的C-藻蓝蛋白冲洗掉。再用100mM磷 酸缓冲液(pH6.98)进行洗脱，将异藻蓝蛋白洗脱下来，即得异藻蓝蛋白溶液。(5) 离子交换法制备高纯度异藻蓝蛋白将步骤(4)的异藻蓝蛋白溶液在20mmol/L 醋酸缓冲液(pH5.0)中透析，透析结束后取透析液上DEAE Sepharose Fast Flow离子交 换色谱柱，该离子交换色谱柱是经20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0，含0.05mol/LNaCl)预 先平衡的，规格为0.6X 10cm，然后用含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0) 洗脱，最后用20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸缓 冲液(pH3.6，含0.05mol/LNaCl)各100mL进行梯度洗脱，洗脱速度为60 70mL/h，收 集蓝色液体，得到高纯度的异藻蓝蛋白。
权利要求
1.一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1)异藻蓝蛋白的提取将蓝藻用冻溶和低离子强度溶涨的方法解体溶解，离心分离，取上清液，即得异藻蓝蛋白浆液；(2)异藻蓝蛋白的初步纯化用硫酸铵沉淀法，将异藻蓝蛋白从异藻蓝蛋白浆液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液，溶解并透析，除去硫酸铵，得异藻蓝蛋白粗提液；(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白使用羟基磷灰石在异藻蓝蛋白粗提液中吸附富集异藻蓝蛋白，然后用磷酸缓冲液进行洗脱，得异藻蓝蛋白溶液；(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白。
2. 如权利要求l所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步 骤(1)中的蓝藻为螺旋藻。
3. 如权利要求l所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步 骤(1)异藻蓝蛋白的提取的具体操作步骤为将蓝藻藻体加入pH6.8 7.0的0.02 mol/L磷 酸缓冲液，在-20。C下冷冻，然后在20 25'C下，融化2 3h;反复冻融2-4次后，蓝藻悬 液在4。C下，8000 rpm 10000rpm离心10 min 15min,上清液即为异藻蓝蛋白浆液。
4. 如权利要求l所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步 骤(2)异藻蓝蛋白的初步纯化的具体操作步骤为向异藻蓝蛋白浆液中加入固体硫酸铵， 至浓度为30%,为重量体积比，放置4 5h，然后在4。C下，10000 rpm 11000rpm离心10 min 15min，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至最终浓度为60%,为重量体积比，放置 4h以上，然后在4。C下，10000rpm 11000rpm离心10min 15min，弃上清，取沉淀；将沉 淀溶于pH6.8~7.0的20rnM的磷酸缓冲液中，然后用pH6.8~7.0的20rnM的磷酸缓冲液进行透 析，收集透析液，即得异藻蓝蛋白粗提液。
5. 如权利要求l所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述歩 骤(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白的具体操作如下将预先用pH6.8~7.0的20mM磷 酸缓冲液平衡过的羟基磷灰石，加入异藻蓝蛋白粗提液中，将吸附满异藻蓝蛋白的羟基磷灰 石从溶液中取出，使用pH6.8 7.0的20mM磷酸缓冲液冲洗羟基磷灰石，将羟基磷灰石上残 余的C-藻蓝蛋白冲洗掉，再用恒定离子强度的缓冲液进行洗脱，将异藻蓝蛋白洗脱下来， 即得异藻蓝蛋白溶液。
6. 如权利要求5所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述恒 定离子强度的缓冲液为pH6. 8~7.0的100mM磷酸缓冲液。
7. 如权利要求l所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步 骤(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白的具体操作如下取步骤(3)制得的异藻蓝蛋白溶 液，在pH5.0、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸缓冲液中透析，然后取透析后的溶液， 在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱上，用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L 醋酸缓冲液洗脱，再用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液和pH3.6、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸缓冲液各lOOmL进行梯度洗脱，洗脱速度为60 70mL/h， 检测波长280nm，收集洗脱的蓝液体，得到纯化的异藻蓝蛋白。
8、如权利要求7所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述的 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱是经pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋 酸缓冲液预先平衡的，规格为0.6X10cm。
全文摘要
一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，属于蓝藻分离纯化技术领域。本发明利用冻溶和低离子强度溶涨快速提取异藻蓝蛋白，经硫酸铵分级沉淀、羟基磷灰石吸附富集异藻蓝蛋白，并通过羟基磷灰石层析大量制备得到较纯的异藻蓝蛋白，最后利用离子交换层析技术，得到高纯度的异藻蓝蛋白。本方法省去了传统的应用分子筛层析结合羟基磷灰石层析共三步层析的复杂分离纯化程序，克服了难于规模化快速大量制备的难题，大大降低了APC的制备成本，从而为将APC应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础。
文档编号C07K1/30GK101240011SQ20081001440
公开日2008年8月13日 申请日期2008年2月28日 优先权日2008年2月28日
发明者周百成, 张熙颖, 张玉忠, 苏海楠, 解彬彬, 陈秀兰 申请人:山东大学