专利名称：R－藻红蛋白在制备光疗肿瘤的光敏剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种R-藻红蛋白的新用途，具体说是R-藻红蛋白在制备光疗肿瘤的光敏剂中的应用，属于医学肿瘤学临床用药物或者辅助药物。
光动力治疗肿瘤细胞是近年发展起来的一种新方法。国内外不少肿瘤医疗中心已对多种肿瘤采用这种方法进行治疗，效果明显，因而日益受到人们重视。目前用作肿瘤细胞光动力治疗的光敏剂主要是从全血中分离的血卟啉衍生物以及蚕砂卟啉(叶绿素卟啉)，缺点是价格昂贵，而且患者一般在注射这些光敏剂后一周内必须避光，一个月内不能直接照射目光，否则会发生严重的皮肤光敏反应。
藻胆蛋白富含于一些藻类中，是一种水溶性色蛋白，分离纯化简单、方便。专利号为93102976.7、授权公告号为CN1052426C的中国专利，公开了利用螺旋藻提纯的藻蓝蛋白作为肿瘤光疗的光敏剂，其疗效优于蚕砂卟啉。但是藻蓝蛋白结构不是很稳定，而且激光光敏效应不是太高。藻红蛋白存在于大量的海洋红藻中，取材方便，价格相对较低，结构稳定，光敏效应强，无任何毒副作用。目前只是用来作生化试剂和食品添加剂，还没有被充分的开发、利用。
本发明目的在于克服现有的用作肿瘤细胞光动力治疗的血卟啉衍生物以及蚕砂卟啉一类的光敏剂的毒副作用大、并需要避光且价格昂贵的缺点，克服藻蓝蛋白的结构不是很稳定且激光光敏效应不是太高的缺点，利用海洋红藻藻红蛋白取材方便，制备简单，价格相对较低的优点，并克服人们认为藻红蛋白只能应用在食品工业领域和化工工业领域的偏见，将R-藻红蛋白开发为肿瘤光疗的光敏剂应用，以增强肿瘤光疗的效率，减小毒副作用，降低肿瘤光疗的费用。
藻红蛋白是藻胆蛋白的一种，广泛的存在于海洋红藻中，它特有的γ亚基将分子中的两个三聚体紧紧的铆在一起，因而结构最稳定，又由于它的色基数量和种类最多，光敏效应很强，并且无毒性。同时藻红蛋白不仅分离简单，价格低廉，而且藻红蛋白本身就有提高机体免疫能力的作用。用它作为光疗肿瘤的光敏剂，克服了人们认为藻红蛋白只能用于生化试剂和食品添加剂的偏见，解决了光动力治疗肿瘤的关键性问题。
本发明采用体内与体外实验相结合的方法，研究藻红蛋白的光敏效应对肿瘤细胞的光敏杀伤作用。通过严格的实验，发现藻红蛋白的光敏效应能有效的杀伤体外培养的肿瘤细胞和抑制移植瘤组织的生长，而且基本没有任何毒副作用。本发明使用的红藻藻红蛋白为R-藻红蛋白，是由发明人自行分离纯化，原料采自青岛太平角或者实验室培养。
本发明将R-藻红蛋白应用作为光疗肿瘤的光敏剂，优点是结构稳定，光敏效应很强，患者注射R-藻红蛋白光敏剂后，不需要特意避光，为治疗带来很大方便，资源丰富，提取方便，因而价格低廉，杀灭和抑制肿瘤细胞作用强，无毒副作用，对正常组织细胞没有任何损伤，是一种易于广泛推广应用的优质光敏剂。
本
发明内容
结合附图通过以下实施例进一步说明
图1表示R-藻红蛋白光敏效应对肿瘤细胞S180存活率的影响。
图2表示R-藻红蛋白与血卟啉衍生物(HPD)和癌光啉Ⅱ(PhotofrinⅡ)对培养的S180细胞在无光辐照时的细胞毒性比较实施例1:R-藻红蛋白光敏效应对体外培养的肿瘤细胞S180的光敏杀伤作用。
S-180细胞于37℃、5％CO2和饱和湿度下，用含10％小牛血清的RMPI1640培养液培养。收集对数期生长的S180细胞，无血清培养液离心洗涤三次，去除培养液中的血清。以含R-藻红蛋白的无血清培养液稀释细胞至106个/ml，接种96孔板，每孔50μl含细胞5×104个。培养液中R-藻红蛋白的浓度分别为1、10、25、50、100μg/ml。培养4小时后，用波长为488nm、能量密度为25.6J/cm2的氩离子激光逐孔辐照。各孔补加50μl含20％牛血清的培养液，继续培养24小时。用MTT法测定各孔细胞数。各组细胞生存率，以其存活细胞数与空白对照组存活细胞数的百分比表示。不加R-藻红蛋白、无激光辐照培养的细胞作为空白对照，单用R-藻红蛋白和单用激光作为阴性对照。用t检验法判定各组间的差别显著性(α=0.005)。实验结果表明，用100μg/ml的R-藻红蛋白处理，再经波长488nm，能量密度为25.6J/cm2的氩离子激光逐孔辐照，肿瘤细胞的存活率仅为25％，而单用R-藻红蛋白或者激光组，肿瘤细胞存活率分别43％和107％。图1表示了R-藻红蛋白光敏效应对肿瘤细胞S180存活率的影响。进一步实验发现，R-藻红蛋白的光敏效应对肿瘤细胞S180的杀伤效率随着R-藻红蛋白浓度的增加而增高，其相互之间的关系符合拟合曲线
lgY=0.1252973-0.2391394(X+0.52)。
其中X表示R-藻红蛋白的浓度，Y表示肿瘤细胞的存活率图1表示R-藻红蛋白和激光辐照对肿瘤细胞S180存活率的影响。在该图中，1、肿瘤细胞在培养基含有100μg/ml浓度的R-藻红蛋白生长时，用不同激光累积能量辐照(自左至右的激光能量分别为6.4J/cm2、3.2J/cm2、25.6J/cm2、51.2J/cm2、102.4J/cm2和0J/cm2)2、肿瘤细胞在培养基含有不同浓度的R-藻红蛋白生长，不用激光辐照(自左至右R-藻红蛋白的浓度1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和0μg/ml)3、不用R-藻红蛋白处理，只用不同辐照强度的激光处理(自左至右激光累积能量分别为6.4J/cm2、3.2 J/cm2、25.6J/cm2、51.2J/cm2、102.4J/cm2和0J/cm2)4、固定激光辐照强度(25.6J/cm2)，用不同的R-藻红蛋白处理(自左至右R-藻红蛋白的浓度1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和0μg/ml)激光的辐照强度与肿瘤细胞生存率之间的关系见下表表1
实施例2:R-藻红蛋白光敏效应对小鼠S180移植肉瘤的生长抑制作用。
收集生长旺盛的S180培养细胞，用无菌生理盐水离心洗涤3次(800×g,10min)。用医用注射器接种到小白鼠左肋缘皮下。每只约接种106个细胞。常规方法饲养，直至瘤体直径达到1厘米时，于肿瘤实质内注射1毫升溶解在磷酸缓冲液中的R-藻红蛋白，使终浓度分别为1、10、25、50、100μg/ml。约6小时后，将瘤体部位剃毛，用200mW功率、波长为488nm的氩离子激光辐照7分钟。继续常规饲养，于治疗后不同的时间(天数)测量瘤体的大小(按长径×横径的方法估算体积)，观察肿瘤生长受抑制的情况。仅以注射相同体积的不含R-藻红蛋白的磷酸缓冲液(激光辐照和不进行激光辐照)，与仅注射R-藻红蛋白而不辐照的作为对照。各组小白鼠数均为10只。注射有R-藻红蛋白的小白鼠避光饲养。实验结果表明，R-藻红蛋白的光敏效应能有效地抑制小白鼠移植瘤的生长，其剂量与效应关系同体外结果一致。由下表表示
表2不同处理对小鼠移植瘤体积变化的影响 实施例3:R-藻红蛋白作为光敏剂与其他光敏剂毒副作用的比较通过对体外培养的S-180细胞在无光辐照的情况下的观察比较，发现R-藻红蛋白的毒副作用最小，而其他的目前已经使用的医用光敏剂对体外培养的细胞均有较大的毒副作用。图2表示了其毒性的不同。PhotofrinⅡ和HPD在无光辐照的情况下使培养的S-180细胞形态发生了较大的改变，而藻红蛋白对S-180细胞基本没有改变，与正常细胞形态一致。
权利要求
1.R-藻红蛋白在制备光疗肿瘤的光敏剂中的应用。
全文摘要
R－藻红蛋白在制备光疗肿瘤的光敏剂中的应用是R－藻红蛋白的新用途,属于医学肿瘤学临床用药物或者辅助药物。本发明采用体内与体外实验相结合的方法,研究藻红蛋白的光敏效应对肿瘤细胞的光敏杀伤作用。通过严格的实验,发现藻红蛋白的光敏效应能有效的杀伤肿瘤细胞和抑制移植瘤组织的生长。优点是结构稳定,光敏效应很强,治疗方便,资源丰富,价格低廉,杀灭和抑制肿瘤细胞作用强,无毒副作用。
文档编号A61K38/16GK1325729SQ0111500
公开日2001年12月12日 申请日期2001年6月4日 优先权日2001年6月4日
发明者王广策, 李振刚, 李冠武, 黄蓓, 孙海宝, 曾呈奎 申请人:中国科学院海洋研究所