专利名称：一种重组藻红蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组藻红蛋白及其制备方法和应用背景技术近年来的科学研究表明，藻红蛋白既可以作为天然色素用于食品、化妆品、染料等工业上，也可制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中。另外，还可以制成食品和药品用于医疗保健上，应用范围广阔，具有很高的开发、利用价值。目前，商业用途的藻红蛋白多由红藻培养经提取而获得，耗时费力，产量低，成本高，还受时间和季节的限制，使得藻红蛋白的市场价格极高，不能满足大规模商业开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组藻红蛋白及其制备方法和应用，它能弥补现有技术的上述不足。
一种重组藻红蛋白，其特征是它用如下的核酸序列表征atgcttgacgcattttctagagtcgtagttaattcagatgctaaagctgcttatgtaggtggcagtgatttacaagctcttaaaacttttattgcagaaggtaacaaaagattagatgccgttaattcaattgtttctaatgcaagttgtattgttacagacgctgtatcaggaatgatttgtgaaaacccaggccttatatctccaggcggaaattgttatactaaccgtcgtatggctgcttgtttacgcgatggagaaattattttaagatatgtatcttatgctcttcttgcaggcgatccatctgttttagaagaccgttgtttaaatggtttaaaagagacttatattgctcttggtgtgccaacaaattcttctgtaagagctgtaagtattatgaaagcagctgctgttgcatttatttctaatacagcttctcaaagaaaaatggatacaacaagtggagattgttctgcactatcttcagaaattgctagctactgtgatagagtatgctctgctattagttaagcaaatactataaagtatacatataagctacatatatcttaataggagataaattatgaaatcagttattactactgtgattagtgcagctgatgctgctggacgttttccaactagttcagatcttgaatctgtacaaggtaatatacaacgcgctgctgcaagattagaagctgcagaaaaattagcagacaaccatgatgcagttgtaaaagaggctggtgatgcttgttttgctaaatattcttatttgaaaaattcaggtgaagctggagaaaatcaagaaaaaatcaataaatgctatagagatatagatcattacatgagattaattaactactctttagttgtaggtggcacaggccctcttgacgaatggggtattgctggtgcacgcgaagtatatcgtgcattaaatcttccaacagcatcttatgttgcagcttttgctttcactcgcgatagattatgcgtgcctcgtgatatgtctgcacaagcaggtgttgaatactccagcgcgttagaattcgtcatcatcgcattaccctaa上述重组藻红蛋白的制备方法，其特征是使引物P1GGAGAG(AC)TCAATGCT(AT)GA和P2(CT)TANNNTAA(AT)G(AC)(AG)(AT)T(AG)ATNA(AC)(AG)(AT)A进行聚合酶链式反应，以龙须菜基因组DNA为模板，进行扩增，将获得的扩增产物连入表达载体进行表达，将培养物超声或加热破碎而获得。
上述重组藻红蛋白在制备抗癌或清除羟自由基制剂中的应用。
本发明的重组藻红蛋白制备方法简便，不受时间和季节限制，在短时间内可使产品获得极高产量；该产品作为抑癌制剂可应用于医药，作为清除羟自由基制剂除应用于医药外，还可应用于饵料、食品和化装品工业；本发明的重组藻红蛋白对医药、食品、养殖业和化装品工业有重要应用价值和意义。
具体实施例方式
在如下的50μl聚合酶链式反应体系中1×聚合酶链式反应缓冲液、3mM MgCl2、50pmol引物P1GGAGAG(AC)TCAATGCT(AT)GA和50pmolP2(CT)TANNNTAA(AT)G(AC)(AG)(AT)T(AG)ATNA(AC)(AG)(AT)A、200μMdNTP、50ng龙须菜基因组DNA为模板，以如下的循环参数扩增94℃8min预变性，94℃1min，45℃2min，72℃2min，30循环。用低熔点凝胶回收扩增产物，连入表达载体，进行诱导表达，将培养物超声或加热破碎，则制备得到重组藻红蛋白。
该重组藻红蛋白用如下的核酸序列表征atgcttgacgc attttctagagtcgtagttaattcagatgctaaagctgcttatgtaggtggcagtgatttacaagctcttaaaacttttattgcagaaggtaacaaaagattagatgccgttaattcaattgtttctaatgcaagttgtattgttacagacgctgtatcaggaatgatttgtgaaaacccaggccttatatctccaggcggaaattgttatactaaccgtcgtatggctgcttgtttacgcgatggagaaattattttaagatatgtatcttatgctcttcttgcaggcgatccatctgttttagaagaccgttgtttaaatggtttaaaagagacttatattgctcttggtgtgccaacaaattcttctgtaagagctgtaagtattatgaaagcagctgctgttgcatttatttctaatacagcttctcaaagaaaaatggatacaacaagtggagattgttctgcactatcttcagaaattgctagctactgtgatagagtatgctctgctattagttaagcaaatactataaagtatacatataagctacatatatcttaataggagataaattatgaaatcagttattactactgtgattagtgcagctgatgctgctggacgttttccaactagttcagatcttgaatctgtacaaggtaatatacaacgcgctgctgcaagattagaagctgcagaaaaattagcagacaaccatgatgcagttgtaaaagaggctggtgatgcttgttttgctaaatattcttatttgaaaaattcaggtgaagctggagaaaatcaagaaaaaatcaataaatgctatagagatatagatcattacatgagattaattaactactctttagttgtaggtggcacaggccctcttgacgaatggggtattgctggtgcacgcgaagtatatcgtgcattaaatcttccaacagcatcttatgttgcagcttttgctttcactcgcgatagattatgcgtgcctcgtgatatgtctgcacaagcaggtgttgaatactccagcgcgttagaattcgtcatcatcgcattaccctaa所述的扩增循环的温度和时间范围为94℃5-10min预变性，94℃1-2min，42-50℃1-3min，72℃1-3min，25-35循环。
以比色法测定羟自由基的生成量检测本发明的重组藻红蛋白对羟自由基的清除作用。具体步骤为(1)羟自由基的产生在10ml刻度具塞试管中加入浓度为10mmol/L的水杨酸0.5ml、浓度为0.4mol/L的1xPBS缓冲液3ml、浓度为3.8mmol/L的Fe(II)EDTA溶液0.5ml和本发明的重组藻红蛋白，加入浓度为4mmol/L的H2O21ml，启动反应。
(2)羟自由基的测定将上述反应体系于25℃恒温水浴中放置90min，加浓度为6mol/L的HCl水溶液1ml，结束反应，再加入0.5gNaCl，滴加去离子水至6ml刻度处，混匀。加入4℃乙醚4ml，充分混匀，静置后移取上层乙醚3ml于10ml刻度离心管中。将该离心管置于40℃恒温水浴中，将乙醚蒸干。加入体积分数为10％的三氯乙酸水溶液0.15ml、质量分数为10％的钨酸钠水溶液0.25ml、质量分数为0.5％的NaNO2水溶液(新鲜配制)0.25ml，放置5min。加入浓度为1mol/L的KOH水溶液0.25ml，滴加去离子水至4ml处，混匀。于510nm处测定其吸光度A0。
(3)按(1)中所述的方法，在羟自由基的产生体系中，以苯甲酸作为阳性对照，按(2)中所述的羟自由基的测定方法测得重组藻红蛋白的吸光度As。
(4)按公式清除率＝(Ao-As)/Ao×100％计算清除率。
测得的结果是本重组藻红蛋白的羟自由基清除率在其水溶液浓度为0.1mg/ml时为60.74％，在其水溶液浓度为0.4mg/ml时为65.05％。加热破碎得到的重组藻红蛋白的羟自由基清除率在其水溶液浓度为0.1mg/ml时为55％，在其水溶液浓度为0.4mg/ml时为44.23％。
以MTT法测定本重组藻红蛋白对癌细胞Hela细胞的抑制作用，具体步骤为(1)收集对数期Hela细胞，调整细胞悬浮液浓度至5×105个细胞/毫升培养液。将细胞以100μl/孔分装于96孔板。置37℃、体积分数为5％的CO2温箱培养使细胞贴壁。
(2)在对照孔和加药孔分别加入不同浓度的不含本重组藻红蛋白的空载体样品和本重组藻红蛋白，放置3天。小心吸去上清液。每孔加入200μl MTT水溶液(浓度为0.5mg/ml)，继续培养4h。中止培养，小心吸去孔内溶液。
(3)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10min，使结晶物充分溶解。设置调零孔(只加入二甲基亚砜)、空白孔(只加入细胞和二甲基亚砜)，每组设定3个重复孔。
(4)在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。以空白孔OD值为本底，加入不含本重组藻红蛋白的空载体的对照孔OD值为对照，加入本重组藻红蛋白的给药孔OD值为给药，按公式抑制率＝[(对照-本底)-(给药-本底)]/(对照-本底)×100％计算抑制率。
测得结果当重组藻红蛋白水溶液浓度在120μg/ml以下时，抑制率为40％左右，随着重组藻红蛋白水溶液浓度的上升，抑制率明显提高；当重组藻红蛋白水溶液浓度达到640g/ml时，抑制率稳定地达到65％。
上述实验结果表明，本重组藻红蛋白具有抑癌活性及清除羟自由基活性，且加热后仍可维持相当的活性，可在制备抗癌或清除羟自由基制剂中应用。
权利要求
1.一种基因重组藻红蛋白，其特征是它用如下的核酸序列表征atgcttgacg cattttctag agtcgtagtt aattcagatg ctaaagctgc ttatgtaggt ggcagtgatttacaagctct taaaactttt attgcagaag gtaacaaaag attagatgcc gttaattcaa ttgtttctaatgcaagttgt attgttacag acgctgtatc aggaatgatt tgtgaaaacc caggccttat atctccaggcggaaattgtt atactaaccg tcgtatggct gcttgtttac gcgatggaga aattatttta agatatgtatcttatgctct tcttgcaggc gatccatctg ttttagaaga ccgttgttta aatggtttaa aagagacttatattgctctt ggtgtgccaa caaattcttc tgtaagagct gtaagtatta tgaaagcagc tgctgttgcatttatttcta atacagcttc tcaaagaaaa atggatacaa caagtggaga ttgttctgca ctatcttcagaaattgctag ctactgtgat agagtatgct ctgctattag ttaagcaaat actataaagt atacatataagctacatata tcttaatagg agataaatta tgaaatcagt tattactact gtgattagtg cagctgatgctgctggacgt tttccaacta gttcagatct tgaatctgta caaggtaata tacaacgcgc tgctgcaagattagaagctg cagaaaaatt agcagacaac catgatgcag ttgtaaaaga ggctggtgat gcttgttttgctaaatattc ttatttgaaa aattcaggtg aagctggaga aaatcaagaa aaaatcaata aatgctatagagatatagat cattacatga gattaattaa ctactcttta gttgtaggtg gcacaggccc tcttgacgaatggggtattg ctggtgcacg cgaagtatat cgtgcattaa atcttccaac agcatcttat gttgcagcttttgctttcac tcgcgataga ttatgcgtgc ctcgtgatat gtctgcacaa gcaggtgttg aatactccagcgcgttagaa ttcgtcatca tcgcattacc ctaa
2.权利要求1所述的重组藻红蛋白的制备方法，其特征是使引物P1GGAGAG(AC)TCAATGCT(AT)GA和P2(CT)TANNNTAA(AT)G(AC)(AG)(AT)T(AG)ATNA(AC)(AG)(AT)A进行聚合酶链式反应，以龙须菜基因组DNA为模板，进行扩增，将获得的扩增产物连入表达载体进行表达，将培养物超声或加热破碎而获得。
3.权利要求1所述的重组藻红蛋白在制备抗癌和清除羟自由基制剂中的应用。
全文摘要
一种重组藻红蛋白，其特征是它用核酸序列表征。制备时，使引物P1GGAGAG(AC)TCAATGCT(AT)GA和P2(CT)TANNNTAA(AT)G(AC)(AG)(AT)T(AG)ATNA(AC) (AG)(AT)A进行聚合酶链式反应，以龙须菜基因组DNA为模板，进行扩增，将获得的扩增产物连入表达载体进行表达，将培养物超声或加热破碎而获得。本发明的制备方法简便，不受时间和季节限制，在短时间内可使产品获得极高产量；该产品作为抑癌制剂可应用于医药，作为清除羟自由基制剂除应用于医药外，还可应用于饵料、食品和化装品工业。
文档编号A61K48/00GK1884543SQ20061004458
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月26日 优先权日2006年5月26日
发明者隋正红, 温若冰, 茅云翔, 张爽, 张学成, 张静 申请人:中国海洋大学