专利名称：一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域，具体涉及一种高稳定性藻蓝蛋白类 融合荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、真核的红藻、隐藻和甲藻(Pyrrophyta)中。 根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类即藻红蛋白(phycoerythrin，PE)， 藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin, PEC),藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)禾口另U藻蓝蛋白 (allophycocyanin，APC)。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有α和β亚基。藻胆蛋白中的色基称 为藻胆素(Phycobilin)，藻胆素的A或D环，或A、D两环同时与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基 通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得不同种类的藻 胆蛋白呈现不同的光学特性。藻红蛋白主要吸收约560nm的可见光，发射光约580nm的荧 光；藻红蓝蛋白吸收约570nm的可见光，发射光约630nm的荧光；藻蓝蛋白吸收约620nm的 可见光，发射光约640nm的荧光；别藻蓝蛋白吸收约650 660nm的可见光，发射光约660 670nm的荧光。藻胆蛋白具有提高人体免疫力，促进动物细胞再生的功能；可以抑制癌细胞 生长，减轻肿瘤化疗的副作用；同时也是一种无毒副作用的理想的光敏剂；藻胆蛋白作为 一种天然色素，也可以应用于食品和化妆品中。由于有强烈的荧光特性，藻胆蛋白还可以制 备成荧光探针，在免疫学、细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋 白的分离方法，CN1344723,2002. 04. 17 ；一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083, 2005.01. 12)；由于天然的蓝藻和红藻亚基存在着单聚体、三聚体和六聚体等多种形 式，不利于对其功能的研究和利用。专利“一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法， 200710029673. X, 2007. 8. 9，提供了一种利用基因工程方法生产重组藻蓝蛋白的方法，得到 的荧光类蛋白质具有结构单一的特点，但是利用此种方法表达的重组荧光类藻蓝蛋白，易 形成大量包涵体，得率低；更重要的是得到的重组荧光类藻蓝蛋白水溶性和稳定性差，不利 于进一步的开发研究。
发明内容
为了解决上述不足，本发明通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合，提高了重组蛋白的稳定性和水溶性。所采用技术路线为1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因 (cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)克 隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白 的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白；
所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803或与其同源的基因。本发明与现有技术相比，具有以下优点1.通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合，提高了重组荧光蛋白的水溶性 和稳定性；在大肠杆菌中表达时包涵体少，目的蛋白表达量高，有利于纯化，目的蛋白得率高.2.不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产新型重组光活性蛋白，大肠杆菌易于 培养，生长快，可以大大缩短生产周期；与藻类相比，大肠杆菌细胞壁易于破碎，纯化过程可 以节约能源，利用率高。3.只使用一种抗生素的选择压力，菌种较稳定。得到的重组蛋白含有His-tag标 记，体系中没有类似蛋白，通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白，且纯度较高。4.本发明简化了质粒构建过程，构建单一质粒，菌种较稳定，可以规模化发酵生产 一种新型重组光活性蛋白，最大吸收波长为621nm，最大激发光波长650nm，具有优良的荧 光性质用于新型荧光探针领域；具有生物学活性，主要体现在抗氧化方面，为藻胆蛋白类色 素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方 法。
图1重组质粒的构建示意2重组蛋白的表达SDS-PAGE和锌电泳图3重组蛋白纯化的SDS-PAGE和锌电泳图4重组蛋白溶解性比较SDS-PAGE电泳5重组蛋白和天然藻蓝蛋白的吸收光谱图6重组蛋白和天然藻蓝蛋白的激发光谱
具体实施例方式下面通过实施例具体说明本发明a.基因的克隆从美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnologylnformation, NCBI)数据库(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)获取 Synechocystis sp. PCC6803 的 cpcA、 cpcE、cpcF、hol、pcyA基因的序列，序列长分别为 0. 49kb、0. 88kb、0. 62kb、0. 72kb 和 0. 75kb 由此设计引物，所用的引物和反应条件如表1，以Synechocystis sp. PCC6803基因组DNA为 模板，PCR克隆对应的基因。b.重组质粒的构建将Synechocystis sp. PCC6803中脱辅基藻蓝蛋白cpcA基因克隆于Novagen公司 的ρ⑶FDuet载体中，基因插入载体的步骤为把上一步经过PCR扩增得到的cpcA基因片 段进行电泳(120V，40分钟)，回收cpcA的PCR产物片段；所得片段用设计的限制性内切酶 BamH I和Sac I进行双酶切，同时把载体pCDFDuet用同样的限制性内切酶进行酶切，分别 回收酶切后cpcAPCR产物片段和酶切后的载体ρ⑶FDuet ；酶切后的cpcA PCR产物片段和酶 切后的载体ρ⑶FDuet按3 μ 1 1μ 1混合，在Τ4连接酶作用下连接一定时间(16°C下16小时)，即得到质粒pCDFDuet-cpcA ；把质粒pCDFDuet-cpcA转化进入大肠杆菌，利用含有抗 生素的平板筛选出圆形单菌落，挑取单克隆，SDS-PAGE电泳和测序验证。将克隆的色基裂合酶(cpcE和cpcF)按上述程序依次连接于pCDFDuet-cpcA载体 的第一个表达框中，并将麦芽糖结合蛋白基因(mbp)连接于cpcA基因的5'-端；将藻胆 素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)依次连接于pCDFDuet-cpcA-cpcE-cpcF载体的第二个表 达框中，所得质粒叫做pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF，hol-pcyA，如图1所示。c.重组质粒的转化与重组菌的筛选 将质粒pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF，hol-pcyA转化大肠杆菌BL21，质粒转化入大 肠杆菌的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21的单菌落，接种于 5mlLB液体培养基，37°C震荡培养过夜；取100 μ 1饱和培养物，无菌转接至5ml LB液体培 养基，37°C震荡培养至OD600为0. 6左右，冰上放置IOmin ；，离心5min (5000g, 4°C )弃去上 清，收集沉淀菌体；用lmllmo 1/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s (10000g，4°C )弃去 上清，菌体沉淀用100 μ 1预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，加入步骤2)所得质粒，混勻后冰浴 30min, 42°C热激90s，冰浴5min后加入400 μ 1 LB液体培养基，37°C低速震荡培养lh，转速 梯度增加至正常，涂布菌液在含有相应抗生素的LB固体平板上，倒置于37°C培养箱至形成 可见的单克隆菌斑。挑取单克隆，经测序验证即得到大肠杆菌工程菌。挑取20个菌落，分别接种于5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，震荡培养 至饱和；分别从中取出100 μ 1转接至5ml含有相应抗生素的液体培养基中；37°C震荡培养 至OD600为0. 8-1. 0，加入IPTG诱导表达，避光280C 120转/分，表达8-10小时。离心收集 细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测定荧光量(参见图5)，选取荧光量较高的菌株保 种。d.重组菌的5L规模发酵5L发酵罐表达别藻蛋白类新型重组光活性蛋白的程序如下取保存的菌种 100 μ 1无菌接种于5ml液体LB培养基，37°C震荡培养12小时，然后转接于含200ml液体 LB培养基的三角瓶，37°C震荡培养6小时。工程菌的发酵在5L自动发酵罐中进行，体积比 5 %的接种量，诱导前培养温度设为37°C，转速随发酵时间由300-500rpm递增，pH均自动控 制；发酵开始4h后，菌体生长至对数期，原培养基中的碳源接近耗尽时，以0. 08g/(L.min) 葡萄糖的速率进行补料。发酵开始约7h时，先将罐内温度缓慢降至25°C，然后加入诱导剂 IPTG至终浓度lmmol/L，降低转速至150rpm，诱导培养IOh以上。e.重组蛋白的分离纯化按照每升结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，0. 5mol/L氯化钠，20mmol/L咪唑，pH7. 4) 加入湿菌体50g的比例将菌体重悬，超声破碎细胞30min，12000rpm，4°C条件下离心，收集 上清液，上样于M2+亲和色谱柱，用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗色谱柱后，用洗脱缓冲液 (20mmol/L磷酸钠，0. 5mol/L氯化钠，500mmOl/L咪唑，pH 7. 4)洗脱，洗脱液经G-25脱盐柱 脱盐后即得到目的蛋白。表 1 重组蛋白的表达形式分析图2为重组蛋白的表达SDS-PAGE和锌电泳；图3为重组蛋白纯化的SDS-PAGE和锌电泳；如图4所示，重组蛋白菌体加入适量破碎缓冲液，经超声波破碎后，取50 μ 1破碎 液加入等体积2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸lOmin，离心后取上清为总蛋白(T)；另取破碎 液离心，取上清加入等体积2 X SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸lOmin，离心后取上清为可溶性 蛋白(S)。每样上样15 μ 1。电泳采用12%分离胶。箭头所示为目的蛋白条带。M为蛋白Marker，左边数字为蛋白分子量。T为总蛋白条带；M为可溶性蛋白条带。总蛋白与可溶性 蛋白亮度基本一致(图4)，证明重组蛋白是以可溶性蛋白形式表达，而非包涵体形式表达。重组蛋白与天然藻蓝蛋白的光谱学性质比较如图5所示，重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在500-800nm波长的吸收图谱。两 者的最大吸收波长一致，为623nm。如图6所示，重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在400-800nm波长的荧光发射图 谱，激发波长为620nm。两者的最大发射波长一致，为650nm。如图5和6所示，光谱学试验结果表明，重组蛋白与天然蛋白有相似的光谱学特 征。序列表SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120> 一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法<130><140>200910019914· 1<141>2009-03-14<160>12<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222>(1). . (29)<223><400>1tgtgtggatc cgatgaaaac ccccctaac29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工合成<220><221>gene<222>(1). . (29)<223><400>2 acaaggagct caactagctt agggcgttg29<210>3
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一种荧光类融合藻蓝蛋白的生物合成方法，其特征包括以下步骤1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指 Synechocystis PCC6803或与其同源的基因。
全文摘要
本发明公开一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法，属于分子生物学技术领域。包括以下步骤1)将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合，并与色基裂合酶基因(cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框，藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克隆到同一载体的第二个表达框，得到一个含有多个相关基因的表达质粒；2)将上述表达质粒转化大肠杆菌后，筛选得到高产菌，应用此工程菌发酵，经蛋白的分离纯化，得到荧光类融合藻蓝蛋白。本发明有以下优点1.提高了重组荧光蛋白的水溶性和稳定性；2.缩短生产周期，节约能源，利用率高。
文档编号C12R1/89GK101838661SQ20091001991
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月14日 优先权日2009年3月14日
发明者刘少芳, 秦松, 陈华新 申请人:中国科学院海洋研究所