专利名称：利用pre-miR159a构建的抗病毒植物表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及了一种采用拟南芥pre-miR159a的克 隆、改造、转化以及转基因制得的抗病毒载体。
背景技术：
植物病毒病是农作物的主要病害，目前约有iooo多种植物病毒病已被人们所认识。每年
全世界的农作物因病毒侵害的损失高达200亿美元，对农业生产构成了严重的威胁。因此， 植物病毒病的防治早已是农业工作者关注和研究的重要对象。早期对病毒病的防治措施主要 是栽培管理和传统的抗病育种。通过改善裁培管理来增强植物的抗病性，这一措施只能是减
轻植物的发病程度但不能从根本上解决植物病毒发生的问题；而传统的抗病育种由于育种周 期长，加之绝大多数植物缺少抗病毒基因或植物对某一病毒的抗性是一种多基因效应，很难 通过传统育种的方式获得抗病毒植株，因此，通过传统的育种方法来防治植物病毒病已远远 无法满足人们的要求。近年来，植物分子生物学和基因工程技术的发展给植物病毒病的抗病 育种幵辟了新途径。利用病毒本身的一些基因或经改造合成的基因转入受体植物中去，可获
得抗病毒的转基因植株。最早获得成功的是使用病毒外壳蛋白基因(CP),这一策略是使转 CP基因在植株内表达，干扰病毒的正常增殖环节，从而达到抗病目的。此外，利用病毒的复
制酶基因、运动蛋白基因转化植物也是植物抗病毒基因工程的重要策略，并已成功地应用于 一些病毒病的防治中。早期的研究大多是通过表达病毒的蛋白质来实现抗病的，转基因序列 表达蛋白量的多少直接影响着抗性水平的高低，因此这类抗性常称作蛋白质介导的抗性。其 主要特征是抗性水平与转基因的蛋白质表达量成正相关。但是，随着研究的深入，与蛋白质 介导的抗性特点相背的例子逐渐增多，甚至在无翻译起始密码子的情况下，转基因仍可以赋
予植物抗性，这是不同于蛋白质介导抗性的另一种抗病类型，即RNA介导的病毒抗性。
在植物抗病毒基因工程育种中，RNA介导的病毒抗性是同源依赖的抗性，即转入的病毒 基因在细胞核内正常转录或高水平转录，转基因mRNA转运到细胞质后与同源的入侵病毒核酸 发生碱基互补，形成双链核酸，然后被寄主内的核酸酶所降解，转基因发生了RNA沉默，而 入侵病毒则不能进一步复制，从而赋予转基因植物对特异病毒的抗性。在这一过程中转基因 植物发生的RNA沉默是由于病毒入侵转基因植物所导致的，因此又称这类RNA沉默为病毒诱 导的RNA沉默。另一种是在没有病毒侵染的情况下转入的病毒基因发生了 RNA沉默，即由于 转基因插入方式的不同、转基因高拷贝的存在、转基因插入位点等造成了转基因高水平转录，
3形成了大量异常RNA,这些异常RNA很容易被寄主内的RNA依赖的RNA聚合酶所识别，然后 以异常RNA为模板，转录形成双链RNA,进一步被寄主体内的核酸酶降解，转基因发生了MA 沉默。当同源的病毒入侵时，病毒的核酸被细胞内已经发生的RNA沉默机制所降解，病毒不 能复制，转基因植物表现为对特异病毒的抗性。这类RNA沉默称之为转基因诱导的RNA沉默。 研究发现，无论是病毒诱导的RM沉默还是转基因诱导的RNA沉默，直接导致MA沉默发生 的是小分子干扰RNA (small interference RNA， siRNA)。因此，将上述两类RM沉默介导 的病毒抗性统称为siRNA参与的RNA沉默介导的病毒抗性。在植物抗病毒工程中这一策略得 到了广泛地运用，获得了大量抗病毒的转基因植物。但是，随着研究的深入人们发现这一策 略存在着一些弊端，主要体现在三个方面第一，siRM的产生和传播受寄主植物内一些酶 活性、环境温度的变化和病毒抑制子等相关因素的影响。如这类转基因植物的病毒抗性往往 因温度的降低而抗病性丧失、能产生沉默抑制子的病毒入侵，通过抑制RM沉默而打破了转 基因植株的抗病性。第二，这一策略需要完整的病毒基因或较长的病毒cDM片断，而长片断 在植物中如果没有足够大的同源性则容易造成脱靶，不会发生RNA沉默，转基因植物就不会 产生抗病毒作用。第三，转入长的病毒cDNA片断存在着与其他入侵病毒或寄主植物的基因 组发生重组的风险，转基因植物的安全性得到一定程度的质疑。因此，在目前研究的基础上 很有必要探讨更有效的植物抗病毒育种新策略。
近年来，随着对小分子RM研究的深入，人们发现植物内还存在着一类称为microRM的 小分子RM,它们在植物的发育调控、植物的抗逆生理等过程中具有重要的生物学功能。曲 静等首次将microRNA应用到植物抗病毒基因工程中，对pre-miM59a基因进行克隆、改造、 转化，使转基因植株产生amiRNA (artificial microRM)，由于amiRNA与入侵的病毒核酸 发生互补，从而抑制了病毒的复制。曲静等采用这一策略获得了抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转 基因烟草。但是通过该方法所获得的转基因植物只能针对单一的病毒具有抗性，采用该策略 获得抗多种病毒的转基因植株尚未报道。
发明内容
根据现有技术，发明人进行了进一步的研究和实验，最终利用拟南芥中的pre-miR159a, 针对烟草的不同病毒TMV、 PVX、 PVY改造pre-miR159a为pre-miR159a""、 pre-miR159a"5、 preiiR159,—"。。利用基因重组技术将以上三个前体串联整合成一段新的基因序列，置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体，采用农杆菌介导的方法转化烟草品种本生烟。
一种抗病毒载体，其基因序列中含有至少一段下列序列
a. pre-miR159a"26,其序列如Seq ID No: 1所示；
b. pre-miR159aP25，其序列如Seq ID No: 2所示；c. pre-miR159aw，其序列如Seq ID No: 3所示。
其中a. pre-miR159aP'"是将不同地区的TMV的126kDa核苷酸进行同源比对，选取保守 的21nt区域作为靶序列，之后根据选定靶序列设计特异引物并进行PCR扩增制得的，其中具 有能产生成熟amiR159a""和其反义链(amiR159aP126* )的序列，序列如Seq ID No: 1中所示。
同理，b. pre-tniR159a"5和c. pre-miR159a"。加均采用同样的方法针对PVX的25kDa和 PVY的HC-Pro制得，其中preiiR159a"5具有能产生成熟amiR159ap"和其反义链 (amiR159aP25*)的序列，序列如Seq ID No: 2中所示；而pre-(niR159a^^具有能产生成熟 amiR159a11。P"和其反义链(amiR159a"cP'°"的序列，序列如Seq ID No:3中所示。
为了使所得的转基因植株能够具有多重病毒的抗性，可以根据现有的生物技术，采用限 制性内切酶和连接酶作为生产手段，将上述的序列串联在一起，从而获得同时含有 pre-miR159a， pre-miR159aP25、 pre-miR159a"26的表达载体，其序列如SEQ ID NO: 17所示， 进而培养相应的植株。由于本发明所针对的主要是烟草等双子叶植物的转基因工作，因此所 采用的表达载体为PBI，本发明采用的为PBI122,也可根据具体情况采用其他的双子叶表达载 体，含有pre-miR159aHC—Pr°、 pre-miR159aP25、 pre-miR159a"26的三者的串联序列在载体中的位 置并没有特殊规定，但是由于酶切位点的限制和载体的选择，我们构建的三者串联的前体排列 顺序才如上所述。采用这种方法获得的转基因烟草中能产生与病毒的126kDa、 25kDa、 HC-Pro 蛋白基因保守序列中的21个核苷酸互补的成熟amiR159a。当病毒入侵时，amiR159a与病毒 核酸的靶序列结合，由于植物要保持自身的基因组结构完整性，会启动对靶序列进行剪切， 从而使转基因植株对病毒具有高度的抗性。运用此法，获得了能高度抗TMV、 PVX、 PVY的转 基因烟草植株。
本发明是在microRNA已有的研究基础上，首次利用microRM构建一种能同时产生三种 不同类型的amiRNA的植物病毒载体，转化植物，获得了抗多种病毒侵染的转基因烟草。这一 策略的应用不仅能丰富植物抗病毒基因工程理论体系，获得多抗、高抗的转基因烟草，而且 对于培育其它植物同时抗多种病毒的种质材料也具有重要的现实意义。
图1. pre-miR159a的改造、表达载体的构建以及表达示意图中F代表正向引物；R代表反向引物。A、 B、 C分别代表araiR159aHC—P'°, amiR159aP25， amiR159a"", A*、 B*、 C承分别代表amiR159aM_p'°, amiR159a"5, amiR159a，的反向互补序列； 图2. T。代转基因烟草的PCR鉴定电泳结果
图中泳道1所示为DL2000 plus MARKER; 泳道2、 3、 4所示为引物Fl分别与引物Ra、 Rb、 Rc组合进行PCR扩增，用于检测pre-miR159a"26、 pre-miR159a"5、 pre-miR159a"c—P"是否成功转入烟草；
图3.实施例6中L代转基因烟草植株与非转基因植株(WT)的抗病性对比图4.转基因植株中表达pre-miR159apl26、 pre-miR159a"5、 pre-miR159a"。P"串联序列，
及其产生的amiR159aP126 、 amiR159aP25、 amiR159aH。p'、t TMV、 PVX、 PVY三种病毒的抗病示意图。
具体实施方式
实施例1:拟南芥pre-miR159a的获得
以普通条件下生长的拟南芥的叶片为材料，用十二烷基硫酸钠(SDS)的方法提取拟南芥 基因组DNA。根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中公布的拟南芥的pre-miR159a 的核苷酸序列，设计DM特异引物分别为
pre-miR159aF,其序列如Seq ID No: 5所示
pre-miR159aR,其序列如Seq ID No: 6所示
以上述提取的拟南芥DNA为模板，利用这对特异引物进行常规RCR扩增。扩增条件为-. PCR反应体积为50^1,包括以下成分
10x反应缓冲液 5pl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4|jl
正向引物(5pM) 化l
反向引物(5^M) 4^1
模板DNA 化l
Taq DNA聚合酶 0. 5^1
ddH20 28. 5|jl
PCR反应条件为94。C5分钟；然后进入下列循环94。C50秒，55'C50秒，72'C30秒， 共35个循环；最后72'C延伸5分钟。
取2pl PCR产物与pMD18-T si即le载体(TAKARA公司产品)连接，方法按照KAKERA产 品说明进行，连接产物转化DH5ct细菌(购于北京全式金生物技术公司)，转化菌在 LB/ampicillin固体培养基培养，37'C倒置培养12-20小时，筛选重组子，保存菌液，提取 质粒，进行酶切和PCR鉴定。
克隆基因序列分析结果如下 (a)序列特征
长度184碱基对 类型核酸
6链型双链 拓扑结构线性
(b) 分子类型DNA
(c) 假设:否
(d) 反义否
(e) 最初来源拟南芥
(f )序列描述SEQ IN NO. 4
实施例2:不同地区的TMV、 PVX、 PVY沉默抑制子的同源比较
(l)将不同地区的TMV的126kDa核苷酸进行同源比对，选取保守的21nt区域作为耙序 列，以矩形框标注。
(2)将不同地区的PVX的25kDa蛋白的核苷酸进行同源比对，选取保守的21nt区域作 为乾序列，以矩形框标注，
(3)将不同地区的PVY的HC-Pro的核苷酸进行同源比对，选取保守的21nt区域作为耙 序列，以矩形框标注。
AJ01脳 AGG脇丁TGCGATC丁丁薦ACTC-GAATATCTGJlT涯C鹿TCCCT認ATCAn
AF273221 AGC'TGGATTGCGATCTTTAG"CTC-GAATATCTGATGATGC"ATTCCCTACGGATCAn
AF395127 AGC-TGGATTGCGATCTTTAW ACTGGAATATCTGATGATGW AATTCCCTACGGATCATT
AF395128 AGGTGGA丁TGCGATCTTTAGI ACTC-GAATATCTGATGATGCJIAATTCCCTACGGATCATT
AF395129 AGGTGGATTGCGATCTTTAG4 ACTGGAATATCTGATGATGCA AATTCCCTACGGATCATT
Target of amiR159a
M72416
AB05S719
AF111193
咖344
EF423572
CCTrATCAGGCACCTGAGTnAGCCTAi|AGCCCCACTTCTACTTSGAAA C CTTATC AGGCACC TGAGTTTAGC C TJ\4 AGCC C C AC TTC 了AC TTGGAAA
CTCATTTCGA tATCATTTCGA
CCTTATCAGGCACCTGAGnTAG:CTA( AGCCCLIACTTCTACTTGGAM :ATCATTTCGA CCTTATCAGC-CACCTGAGTTTAGCCTA( AGCCCCACTTC7ACTTGGAAA :ATCATTTCGA CCTUTCAGGCACCTGAGTTTAGCCTA( .AGCCCCACTTCTACTTGGAAA :ATCATTTCGA
Target of amiRlS9aP25
AB270705
M236852 DQ157180 EF02S075
AAGTATTCMG AAGTATTCAAGTCTATAGGG(
AAGTATTCAAGTCTATAGGGC AGAAGCAACAATCACCTTTW WAACCTGAATATTCTGA AAGTATTCAAC-TCTATAGGGC AGAAGCAACAATCACCTTTC/^AAACCTGAA:■ATTCTGA AAGTATTCAAC-TCUTAGGGf AGAAGCAACAATGACCTTTW MACCTGAATATTCTGA！ ;TCTATAGGGC AGAAGCAACAATCACCTTTW UiAACCTGAATATTCTGA AGAAG':AACAATCACCTTTC/^AAACCTGAATATTCTGA
Target of amiR159a
HC-Ero
o o Q o o
s s K- s CD
<u o
s lb实施例3: pre-attiiR159a的改造
(1) 根据选定的TMV提取物的126kDa蛋白基因保守的21nt序列设计特异引物 pre-ndR159a,:其序列如Seq IDNo:7所示
序列中5-10碱基对处为酶切位点，12-32碱基对处为amiR159a" 在前体中的序 列(即amiR159a"26特征靶序列在前体中的体现，下同) pre-miR159apl26R:其序列如Seq ID No: 8所示 序列中5-IO碱基对处为酶切位点，12-32碱基对处为amiR159a" 在前体中的序列。
(2) 根据选定的PVX提取物的25kDa蛋白基因保守的21nt序列设计特异引物 pre-miR159aP25F:其序列如Seq ID No: 9所示
序列中5-10碱基对处为Z&I酶切位点，12-32碱基对处为amiR159aP 在前体中的序列。
pre-miR159aP25R:其序列如Seq ID No:lO所示
序列中5-10碱基对处为/fe I酶切位点，12-32碱基对处为amiR159a"、在前体中的序列。 pre-raiR159aP25F-2:其序列如Seq ID No: 13所示 序列2-22碱基对处为amiR159a P25h^在前体中的序列。 pre-miR159aP25R-2:其序列如Seq ID No: 14所示
序列中5-IO碱基对处为Xba I酶切位点，12-32碱基对处为amiR159aP25^在前体中的序列。
(3 )根据选定的PVY提取物的HC-Pro蛋白基因保守的21nt序列设计特异引物 pre-miR159aHe_P'°F:其序列如Seq ID No: 11所示
序列中5-10碱基对处为Jfe I酶切位点，12-32碱基对处为amiR159a"e—"°*在前体中的序列。
pre-miR159a,。R:其序列如Seq ID No: 12所示
序列中5-10碱基对处为^/1酶切位点，12-32碱基对处为amiR15Sa"。p 在前体中的序列。 (4)用上述引物进行PCR扩增，序列测定在北京博尚生物公司进行。 (a) pre-miR159a""序列分析结果如下
序列特征
长度204碱基对 类型核酸 链型双链拓扑结构线性 分子类型DNA 假设否 反义否 最初来源
序列描述SEQ IN NO. 1 (b) pre-miR159a"5序列分析结果如下 序列特征
长度204碱基对
类型核酸
链型双链
拓扑结构线性 分子类型DNA 假设否 反义否 最初来源
序列描述SEQ IN NO. 2 (c ) pre-miR159aHe—p'。序列分析結果如下 序列特征
长度204碱基对
类型核酸
链型双链
拓扑结构线性 分子类型DM 假设否 反义否 最初来源
序列描述SEQ IN NO. 3 (d ) pre-miRl59aP25-2序列分析结果如下: 序列特征
长度194碱基对
9类型核酸
链型双链
拓扑结构线性 分子类型DNA 假设否 反义否 最初来源
序列描述SEQ IN NO. 15 实施例4:表达载体的构建
1. 将测序正确的pre-miR159a"e—P'。片段(Seq ID No. 3)与pMD18-T simple Vector进行连 接，方法按照TAURA产品的说明进行。连接产物转化DH5a细胞(购于北京全式金生物技术 公司，下同)，转化菌在氨苄青霉素的LB固体培养基培养，37'C倒置培养12-20小时，筛选 重组子，保存菌液，提取质粒，进行PCR和酶切鉴定；
2. 用&/I和I两个限制性内切酶将pre-raiR159a"w。片段从PMD18-T simple载体 上切下。与用相同酶酶切的PBI122表达载体连接。连接产物转化DH5oc细胞，然后在卡那霉 素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析；
3. 将测序正确的pre-miR159aP25-2片段(Seq ID No. 15)与pEASY-Tl载体按照Transgen 产品说明进行连接，采用与步骤1相同的方法进行培养并鉴定；
4. 用限制性内切酶J化I将测序正确的preiiR159aP25_2片段(Seq ID No. 15)从pEASY-Tl 载体上切下。酶切下后的片段如Seq ID No. 16。再用Wal酶切步骤2中构建好的 pre-miR159^、的表达载体。用T,连接酶将二者连接。连接产物转化DH5 cc细胞，然后在卡 那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析；
5. 将测序正确的pre-miR159a""片段(Seq ID No. 1)与pMD18-T simple Vector进行连 接，采用与步骤l相同的方法进行连接、培养并鉴定；
6. 用限制性内切酶/力oI将测序正确的pre-miR159a"26片段(Seq ID No. 1)从pMD18-T simple载体上切下。与用限制性内切酶J力ol酶切的步骤3中构建好的含有pre-miR159a對" 和pre-miR159aP"的表达载体用1"4连接酶相连(序列如Seq ID No: 17所示)。连接产物转化 DH5a细胞，然后在卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切 分析。
7. 将构建好的含有pre-miR159a"e—P"、 Pre-miR159aP25 、 pre-miR159a""的表达载体PBI122-PPH转化农杆菌LBA4404。上述所述的酶切及连接等各种生物技术，均釆用现有的相 应技术。
实施例5:转基因植株的获得
1. 将本生烟种子播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用。
2. 挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培 养基中，28°C, 250转/分钟，振荡培养约48小时，至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀 释10倍，待用。
3. 取烟草叶片，剪成小块(0.5 cmxO. 5 cm),将剪好的烟草叶片，置于MS预分化培养 基中，28'C,光照时间16小时/天，光照强度2,000 Lux，预培养2天。
4. 将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10分钟，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入 MS基本培养基；弱光下，28'C共培养2天。
5. 共培养后的外殖体先用含羧节青霉素250 mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉 素250 mg/L的MS培养液洗1次，然后用灭菌滤纸吸千，转入含有卡那霉素100 mg/L,羧苄 青霉素250 mg/L的MS选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15天更换一次培养基。
6. 待芽长至l cm左右时，切下，移入MS生根培养基(附加卡那霉素50 mg/L,羧苄青 霉素250 mg/L)中，促其生根。
7. 根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。
8. 对所得到的To代转基因植株进行分子鉴定。根据CaMV 35S启动子序列设计正向引物 记作F1: (5' -TCAGAAAGAATGCTAACCCACAG-3');根据转入的pre-miR159a隨，pre-miR159aP25， pre-miR159aTO—P"基因序列设计三条反向引物，分别记作Ra, Rb, Rc。
Ra: (5' -ACTGGAATATCTGATGATGCA-3'); Rb: (5' -AGCCCCACTTCTACTTGGAAA-3'); Rc: (5' -AGAAGCAACAATCACCTTTCA-3')。
提取获得的转基因植株的基因组DNA,以Fl和Ra、 Rb、 Rc分别组合形成三对引物，进 行常规聚合酶链式反应，电泳结果见附图2。电泳结果与设计引物扩增的目的带相符合。由 此可知pre-miR159a""、 pre—miR159aP25、 pre—miR159a"c-pr°已经成功转入烟草。且转入的顺 序为pre-miR159aP126、 pre-miR159a"5、 pre—miR159aHC_Pl°。
实施例6:转基因植株的抗病性分析
为了确定转基因植株的功能，我们对T,代转基因植株进行抗病毒分析。将获得的1\代转基因烟草(amiR-PPH)分为A、 B、 C、 D四组，分别取实验室所保存的 PVX、 PVY、 TMV三种毒源，按1/10(W/V)比例用磷酸缓冲液(PH7. 0)稀释，离心后取上清即 为接种物。采用摩擦接种的方法对A组接种PVX、 B组接种PVY、 C组接种TMV、 D组接种以上 三种病毒的混合液，以同样接种的非转基因植株(WT)为对照。
两周后，如见附图3所示单一和混合接种病毒的T,代转基因植株均生长正常，未观察 到发病症状；接种TMV的WT植株生长缓慢，严重矮化且具有典型的花叶症状，新叶严重畸形； 接种PVY的WT植株叶片出现巻曲、小叶叶缘下翻、植株矮化、发病严重的植株部分叶片出现 坏死；接种PVX的FT植株叶片出现不均匀的斑驳和坏死斑点，叶片泛黄，植株矮化，下部叶 片出现萎蔫等现象；混合接种的WT植株新叶表现出严重的畸形和花叶症状，且出现严重的矮 化萎蔫。<110〉山东农业大学
<120>利用pre-miR159a构建的抗病毒植物表达载体及其应用
<160〉 17
<210> 1
<211〉 204
<212>陽
<213>人工序列
<220>
<222> (12) ... (32)
<223> amiR159a""的反义链在前体中的序列
<220>
<222> (173)…(193)
<223> amiR159a""在前体中的序列
<400> 1
gcgcctcgag gactggaata tctgatgatg cacatgagtt gsigcagggta aagaaaaigct 60 gctaagctat ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat 120 ggattgcaU tctcaggagc Utaacttgc cctUaatgg cttttactct tctgcatcat 180 cagatattcc agtcctcgag gcgc 204
<210> 2 <211> 204 <212>廳 <213>人工序列 <220>
<222> (12) ... (32)
<223> amiR159aP25的反义链在前体中的序列
<220>
<222> ( 173 ) ... ( 193 )
<223> amiR159aP25在前体中的序列
<400〉 2
13gcgctctaga gagccccact tctacttgga a編tgagtt gagcagggta aag謹agct 60
gcUagctat ggatcccata agccctaatc cttgt雄gt a譜aaggat ttggttaUt 120
ggattgcata tctcaggagc ttUacttgc cctttaatgg cttttactct tctttccaag 180
tagaagtggg gctctctaga gcgc 204
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<222> (12 ) ... ( 32 )
<223> amiRl59aHe—P'n的反义链在前体中的序列 <220>
<222> (173) ... (193)
<223> amiRl"a"c—化°在前体中的序列
<400> 3
gcgctctaga gagaagcaac aatcaccttt cacatgagtt gagcagggta aagaaaagct 60
gctaagctat ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat 120
ggattgcata tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct tctgaaaggt 180
gattgttgct tctcgtcgac gcgc 204
<210> 4
<211> 184
<212> DM <213〉人工序列 <220>
<222> (2) ... (22)
<223> miR159a的反义链在前体中的序列
<220>
<222> ( 163 ) ... ( 183 )
<223> miR159a在前体中的序列<400〉 4
gUgagctcc ttaaagttca aacatgagtt gagcagggta aagaaaagct gctaagctat 60
ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt編aaaggat ttggttatat ggattgcata 120
tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct tctttggatt gaagggagct 180
ctac 184
<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 5
gtagagctcc ttaaagttca aac 23
<210> 6 <211> 23 <212>薩 <213>人工序列 <400> 6
gtagagctcc cttcaatcca aag 23
<210〉 7 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 7
gcgcctcgag gactggaata tctgatgatg cacatgagtt gagcagggta aag 53
<210> 8 <211> 53 <212>腿 <213>人工序列<400> 8
gcgcctcgag gactggaata tctg"gatg cagaagagta aaagccatta aag 53
<210> 9 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400〉 9
gcgctctaga gagccccact tctacttgga aacatgagtt gagcagggta aag 53
<210> 10 <211> 53 <212>醒 <213>人工序列 <400> 10
gcgctctaga gagccccact tctacttgga aagaagaigta aaagccatta aag 53
<210> 11 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 11
gcgctctaga gagaagcaac aatcaccttt cacatgagtt gagcagggta aag 53
<210> 12 <211> 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 12
gcgcgtcgac gagaagcaac aatcaccttt cagaagagta aaagccatta aag 53
16<210> 13 <211> 43 <212〉腿 <213>人工序列 <400> 13
gagccccact tctacttgga aacatgagtt gagcagggta aag 43
<210> 14 <211〉 53 <212> DNA <213>人工序列 <400> 14
gcgctctaga gagccccact tctacttgga aagaagagta aaagccatta aag 53
<210> 15
<211> 194
<212>腿
<213>人工序列
<220〉
<222> (2) ... (22)
<223〉 amiR159a"5的反义链在前体中的序列 <220>
<222> (163)…(183)
<223> amiR159a p25在前体中的序列
<400> 15
gagccccact tctacttgga aacatgagtt gagcagggta aagaaaagct gctaagctat 60
ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat ggattgcaU 120
tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg ctttUctct tctttccaag tagaagtggg 180
gctctctaga gcgc 194
<210> 16<211> 245 <212> , <213>人工序列 <220>
<222> ( 58 ) ... ( 78 )
<223> araiR159a^的反义链在前体中的序列
<220>
<222> ( 219 ) ... ( 239 )
<223〉 amiR159a^在前体中的序列
<400> 16
tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctgcagaatt gcccttgagc 60
cccacttcU cttggaaaca tgagttgagc agggtaaaga aaagctgcta agctatggat 120
cccataagcc ctaatccttg aaagtaaaaa aggatttggt tatatggatt gcatatctca 180
ggagctttaa cttgcccttt aatggctttt actcttcttt ccttgtagaa gtggggctct 240
ctaga 245
<210> 17
<211> 634 <212>腿 <213>人工序列 <220>
<222> (12) ... (32)
<223> amiR159a""的反义链序列
<220>
<222> (195) ... (215)
<223> amiR159a,序列<220〉
<222> ( 252 ) ... ( 272 ) <223〉 amiR159aP25的反义链序列 <220>
<222> ( 413 ) ... ( 433 ) <223> amiR159a ^序歹'J 〈220>
<222> ( 452 ) . ( 472 )
<223> amiR159aK—Pr。的反义链序列
<220>
<222> ( 602 )…(622 ) <223> amiR159aHc令。序列 <400> 17
gcgctctaga tgcatgctcg aggactggaa tatctgatga tgcacatgag ttgagcaggg 60
taaagaaaag ctgctaagct atggatccca taagccctaa tccttgtaaa gtaaaaaagg 120
atttggttat atggattgca tatctcatgga gctttaactt gccctttaat ggcttUact 180
cttctgcatg atcagatatt ccagtcgagc tccggccgcc agtgtgatgg atatctgcag 240
aagtgccctt gagccccact tctacttgga aacatgagU gagcagggta aagaaaagct 300
gctaagctat ggatcccat'a agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat ttggttatat 360
ggattgcata tctcaggagc Utaacttgc cctttaatgg cttttactct tctttccttg 420
tagaagtggg gctctctaga gagaagcaac aatcaccttt cacatgagtt gagcagggta 480
aagaaaagct gctaagctat ggatcccata agccctaatc cttgtaaagt aaaaaaggat 540
ttggttatat ggattgcata tctcaggagc tttaacttgc cctttaatgg cttttactct 600
tctgaaaggt gattgttgct tctcgtcgac gcgc 634
19
权利要求
1. 一种利用拟南芥pre-miR159a制得的含有病毒基因特殊序列的抗病毒载体，其特征在于其基因序列中含有至少一段下列序列a. pre-miR159aP126，其序列如Seq ID No1所示；b. pre-miR159aP25，其序列如Seq ID No2所示；c. pre-miR159aHC-Pro，其序列如Seq ID No3所示。
2. 根据权利要求1所述的抗病毒载体，其特征在于其基因序列中具有 pre-miR159apl26、 pre-miR159aP25、 pre-miR159aHC—Pr°的三者串联序列，其序列如 Seq ID No: 17所示。
3. 根据权利要求1或2所述的抗病毒载体，其特征在于所用表达载体为 PBI122。
4. 如权利要求1所述的抗病毒载体，用于获得抗TMV或PVX或PVY的转基 因植株。
5. 如权利要求2所述的抗病毒载体，用于获得同时抗TMV和PVX和PVY的 转基因植株。
全文摘要
本发明涉及拟南芥microRNA159a前体(pre-miR159a)的克隆、改造、转化及转基因植株的抗病毒分析，属于分子生物学和生物技术领域。从拟南芥中克隆pre-miR159a的核苷酸序列并对其产生成熟miR159a的序列进行定点突变。分别对烟草花叶病毒的126kDa蛋白、马铃薯X病毒的25kDa蛋白、马铃薯Y病毒的HC-Pro蛋白基因突变得到三段突变序列。将这三段序列串联，构建植物表达载体，采用农杆菌介导的方法转化本生烟，得到转基因烟草。这些转基因植株对上述三种病毒都具有高度的抗病性。此抗病毒策略具有抗病性强、抗病持久、生物安全等优点，在植物抗病毒基因工程育种领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/82GK101519659SQ200910019780
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者李善伟, 艾涛波, 郭兴启 申请人:山东农业大学