专利名称：一个在植物中高效表达的载体的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及调控目的基因在植物中高效表达的DNA序列，包含所述的DNA序列与报告基因的融合构建体，携带该构建体的重组表达载体，以及由所述的表达载体转化植物外植体所产生的表达外源基因的转基因植物。
在细胞中，一个基因的转录水平主要受其上游的调控序列(即启动子)所控制，所以在分子生物学及生物技术研究与应用中，对启动子的结构和功能的研究一直是一个热门。但转录后mRNA的稳定性及翻译效率对基因的最终产物-蛋白质的产率，有着非常重要的影响，在翻译水平上的调控重要程度并不亚于在转录水平上。
许多真核生物(包括病毒)的mRNA的非翻译区序列(UTR)可以通过影响mRNA的稳定性和翻译效率对调节蛋白表达水平起着重要的作用。本发明中所述的两段UTR序列来自烟草花叶病毒(TMV)，分别为TMV-RNA的5’端(简称Ω片段，为67bp)和3’端(简称TMV 3’UTR，为204bp的cDNA)。
TMV的Ω片段能够提高外源基因的表达[1,2]。这种增强表达的作用不依赖于任何病毒基因的产物，并且在双子叶植物细胞中的作用比在单子叶中强[3]。Sleat等人认为Ω片段减少了mRNA的二级结构，使得40S核糖体亚基更容易在5’端运动寻找转录起始位点，并且使得5’末端与起始因子的相互作用加强了，因而TMV的Ω片段对翻译有增强作用[4]。这方面的技术已有专利发表(WO87/07644；WILSON；Enhancing translationof mRNA by attaching leader sequence-from--RNA--virus,opt.in form ofcomplementary DNA-,e.g.for improving protein expression in transformedcells.)。
而其RNA的3’端UTR可以形成具有复杂高级结构的五个假结(pseudoknot)。在3’最末端的2个假结形成一个在二级结构上类似tRNA的尾巴，这是病毒复制必需的。紧接这个区的上游是另外3个假结(UPD)。Gallie等[3、5、11]用原生质体体系研究表明，TMV 3’UTR中UPD的主要作用是提高翻译效率，其机理与真核生物mRNA的poly A的作用机理相似。
但以上有关TMV UTR区对外源基因表达影响的研究结果都是在离体细胞表达体系中，报导基因在非整合状态下得到的。本发明中首次用TMV5’UTR和3’UTR构建了植物表达载体，并在植株整体水平上，报导基因在整合状态下证明TMV 5’UTR与TMV 3’UTR序列能够增强外源基因的表达，而且证明两个序列共同作用较单独使用5’UTR更能增强外源基因的表达。所以，本发明所构建的表达载体pBin440对于研究嵌合基因在整体植物中表达的影响能够更准确地反映TMV UTR在体内的真实作用，它应该是一个新的在植物中高效表达的载体。
TMV-外壳蛋白(CP)基因的克隆pGT114含有外壳蛋白编码区及其3’端非翻译区[6]。以PCR方法获得TMV 3’UTRDNA序列(两端分别有SalⅠ及SacⅠ的酶切位点)，经SalⅠ及SacⅠ酶解，将其插入质粒pD513，而构建成pD515；最后经HindⅢ及EcoRⅠ酶解插入pBin438[7]，得到植物高效表达载体pBin440。
下文所要叙述的实施例揭示本发明人获得的植物表达载体(
图1A)能够在植物中高效表达报告基因以及其他目的基因。
本发明将首次构建的植物表达载体pBin440与β-glucuronidase(GUS)报告基因的编码区核苷酸序列相融合产生了在植物表达中的重组质粒pBG440，并将这两种重组质粒分别转化入埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)和土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)产生了重组微生物。含有pBin440的埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)转化子已保藏到中国微生物菌种保藏保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌种号为CGMCC No.0444。
为了证明新的植物表达载体pBin440中TMV 3’UTR对提高外源基因在植物中表达水平的作用，本发明利用GUS基因及TMV-RNA非翻译区序列构建了另三种GUS基因的植物表达载体，pBG437(不含TMV 5’UTR和3’UTR),pBG438(仅含TMV 5’UTR)和pBG440 ΔNOS(除不含NOS终止子，其他与pBG440相同)，将重组质粒分别转化入埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)和土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)产生了重组微生物。用叶盘转化法在含有重组质粒pBG440等的土壤农杆菌的介导下将上述各嵌合GUS基因分别导入植物染色体产生了转基因植物。
本发明涉及调控目的基因编码区的核苷酸序列在植物细胞内高效表达的载体。所述的“植物细胞内高效表达”指在植物细胞的表达水平显著高于无TMV UTR序列的植物表达载体，如pBin437、pBin438(缺3’UTR)等等。
本发明所构建的植物表达载体利用TMV 5’UTR与3’UTR共同作用以增强插入在这两个序列之间的外源基因在植物体内的表达水平，并第一次在整体植株水平上证明该片段具有增强基因表达的功能。所以本发明中的植物表达载体pBin440应是一个新的植物高效表达载体。
结合下列附图对本发明予以详细说明
图1A:pBin440的结构图。 204bp TMV 3’UTR DNA 来自pBR322的BamHⅠ-SalⅠ277bp片段 TMV 5’UTR箭头指基因的转录方向LB-T-DNA左边界序列Knr-在细菌中表达的卡那霉素抗性基因RB-T-DNA右边界序列NPTⅡ-新霉素磷酸转移酶基因，在植物Sc-SacⅠ 中表达对卡那霉素的抗性。
SL-SalⅠBm-BamHⅠHd-HindⅢRI-EcoRⅠRK2-RK2复制起点DE35S-带双增强子的CaMV 35S启动子*该图各部分未按比例画出，仅为示意图。
图1B植物表达载体pBG437、pBG438、pBG440和pBG440ΔNOS的构建。
图2四种不同结构的GUS基因瞬间表达的平均活性(单位pmolMU/min/ug提取总蛋白)。
图3转基因烟草GUS活性的分布。
图4转基因烟草的GUS平均比活性。
图5部分再生植株的PCR结果。
实施例1．完整TMV 3’UTR序列的获得TMV外壳蛋白(CP)基因克隆pGT114含有CP基因编码区和3’非编码区[6]。根据3’非编码区序列，设计合成了以下PCR引物UT5:5’CGGTCGACGGTAGTCAAGATGCATAATAAAT 3’31merUT3:5’CTGAGCTCTGGGCCCCTACCGGGGGTAA3’28merPCR反应混合物总体积50ul，含有pGT114DNA～10ng，引物UT5和UT3各5ul，使最终浓度达1umol/L，缓冲液(500mM KCl,100mM Tris-HCl,pH8.8,15mM MgCl2,30mM DTT,1mg/ml BSA)5ul,2mM dNTP 5ul,2U Tag DNA Polymerase。反应在94℃预变性3分钟，然后以94℃变性30秒，56℃复性1分钟，72℃延伸30秒，共30个循环。反应混合物经酚/氯仿抽提一次后，用两倍体积的乙醇在-20℃沉淀一小时以上，离心回收PCR产物。从而得到全长204bp的TMV 3’UTR片段，其序列为
GGTAGTCAAGATGCATAATAAATAACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTACGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCACTTAAATCGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCGGGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCACGTAATAAAGCGAGGGGTTCGAATCCCCCCGTTACCCCCGGTAGGGGCCCA2．植物表达载体pBin440及pBG440等的构建DNA的酶解、片段分离纯化及连接反应按Ausubel等人的“CurrentProtocols in Molecular Biology”一书所述的方法进行。为了将3’UTR片段插入到pBin438的表达框架中，首先用HindⅢ和EcoRⅠ将pBin438中由双增强子的CaMV 35S启动子-TMV“Ω”片段-来自pBR322的BamHⅠ-SalⅠ的一段DNA填充物-Nos 3’终止序列组成的表达框切下后，与用BamHⅠ和EcoRⅠ酶解的pUC19连接，即得到重组质粒pD513。上述pGT114的PCR产物经SacⅠ和SalⅠ酶解后，与用同样酶解的pD513连接可构建成pD515,pD515与pD513不同之处仅在于pD515在Nos终止序列的5’端插入了TMV UTR序列。以Nos 3’端序列为负链引物、用Pharmacia公司的T7DNA Sequencing Kit进行序列分析的结果证明，pD515中所插入的UTR序列是正确的。用HindⅢ和BamHⅠ酶解PCR产生的UTR DNA片段与同样酶解的pBin438[7]所得的载体DNA连接，即得到重组质粒pBin440，一个新的二元表达载体，或称之为一个新的植物表达载体。pBin440的结构见
图1。任何外源基因经适当酶切插入到该表达载体的上述表达框中，在植物中都可能实现高效表达。在pBin440中，我们用了CaMV 35S启动子及Nos 3’端终止序列来调控由TMV 5’和3’端UTR序列所连接的外源基因(GUS)的表达。但并不排斥用其他植物强启动子和其他转录终止序列来取代上述启动子及转录终止序列以实现TMV UTR序列提高外源基因表达水平的作用。
为了证实TMV UTR在整体植物中可提高外源基因表达效率的可能性，本发明还用从p35SGUSINT分离的、带有一个内含子的GUS基因，分别与pBin440、pBin438和pBin437构建了GUS嵌合基因表达载体pBG440、pBG438、pBG437以及将pBin440中的Nos 3’端序列切除后构建成的pBG440ΔNOS。这些表达载体的构建过程参见
图1B。
3．转基因植物的产生
1．转化土壤农杆菌以碱变性法(J.Sambrook et al.,Molecular cloning,A LaboratoryManual,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)制备pBG437,pBG438,pBG440和pBG440ΔNOS质粒，用液氮冻融转化法(贾盘兴，蔡金科等微生物遗传学实验技术北京科学出版社1992 108-109)将上述质粒转入土壤农杆菌LBA4404，然后以PCR和酶切筛选克隆。
2．植物转化用叶盘法(Horsch,R.B.et al.,Science 227,1229-1231,1985)将pBG437,pBG438,pBG440和pBG440ΔNOS的土壤农杆菌克隆分别转化烟草(NC89)。通过卡那霉素抗性筛选获得烟草再生植株。
3．农杆菌介导的嵌合GUS基因的瞬间表达(1)瞬间表达用温室培养的长到10-12片叶的本名烟(Nicotianabenthamiana)。
(2)从新划的平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5mL LB培养基中(含Kn 50ug/mL),28℃,300r.p.m，摇床培养过夜，取1mL加到50mL同样(含Kn50ug/ul)培养基中，28℃300r.p.m摇过夜。然后以4000r.p.m,4℃离心收集菌体，再将菌体悬浮，使最终浓度为O.D600至1.5，静止放置在室温下3hr。在同一植株的不同叶片上分别注射4种农杆菌溶液，使农杆菌液浸润整个叶片，以LBA4404菌悬液为空白对照。3-5天内按Jefferson的方法检测注射过的叶片的GUS比活性。
4．转基因烟草的PCR检测取1ul小规模提取的烟草DNA为模板，在20μl PCR反应体系(dNTP最终浓度为每种0.2mmol/l，用NOS正链引物和GUS负链引物，浓度为0.5μmol/l)中94℃变性4分钟，然后以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟进行30个循环反应，反应产物于1％琼脂糖凝胶电泳观察、照相。
引物序列如下GUS负链引物5’ATCGAAACGCAGCACGATAC 3’NOS正链引物5’CGCGGTGTCATCTATGTTAC 3’
PCR结果请参见图-5。
结果显示所有GUS反应为阳性的植株在PCR反应中都可扩增出一条GUS基因特异的DNA片段，表明pBG440中的GUS基因表达框已与T-DNA一起整和到烟草的基因组上。
5．转基因烟草的GUS活性分析(1)烟草总可溶性蛋白的提取参照Jefferson等[9、13](Jefferson R A,Kavanagh T A,Beven M W.EMBO Journal,1987,6:3901-3907.Jefferson R A,Plant Molecular BiologyReporter,1987,5:387～405)和Promega公司的荧光素酶分析系统(Luciferage Assay System,E1500,Promega Technical Bulletin)的方法提取烟草叶片或叶脉的总可溶性蛋白取50mg烟草叶片或叶脉组织，经液氮冷冻研磨后，加入200ul蛋白提取液(25mmol/L Tris-phosphate,pH7.8,2mmol/L DTT,2mmol/L 1,2-diamino cyclohexane-N,N,N′,N′-tetraaceticacid,10％glycerol和1％Triton X-100)，混匀，4℃离心(12,000rm,2min.)，取上清液即为烟草总可溶性蛋白提取液。蛋白浓度的测定采用Bio-Rad ProteinⅡ测定液，按厂家提供的方法进行。
2．GUS活性检测参照顾红雅等所述[10]，取10ul步骤1中制备的烟草叶片或叶脉的总可溶性蛋白提取液与90ul GUS反应液(在步骤1所述蛋白提取液中加入1mmol/L 4-甲基伞形酮酰-葡萄糖醛酸苷，即4-MUG和10mmol/Lβ-巯基乙醇即为GUS反应液)混匀，在37℃保温反应。每一种样品设置2个反应时间，即分别在20′和30′时各加入900ul 0.2mol/L的Na2CO3溶液终止反应。以0.2mol/L的Na2CO3溶液制备0.2umol/L的4-甲基伞形酮(4-MU)作为荧光标准物，使用Hoefer Pharmacia生物技术公司生产的荧光计(DyNA QuantTM200 Fluorometer)在激发光365nm，发射光455nm条件下测荧光。在正式测量之前，先用系列稀释浓度的标准物4-MU测量荧光值，作出标准曲线，确定荧光值与4-MU浓度的线性范围。测量转基因植物时，用每个样品的测量荧光值从标准曲线查出生成的4-MU的含量，作出不同时间对应于4-MU的函数曲线，求出每分钟生成的4-MU的含量，再除以每个样品的总可溶性蛋白量，即为GUS活性，最后单位为“4-MU pmol./min.ug total protein”。
6．结果与讨论(1)瞬间表达结果表明转化pBG440(35S-Ω-GUS-UTR-NOS)的叶片GUS活性最高，GUS平均比活性是pBG437(35S-GUS-NOS)的6.6倍，是pBG438的(35S-Ω-GUS-NOS)1.4倍；转化pBG438的叶片的平均比活性是pBG437的4.7倍；pBG440ΔNOS没有检测到GUS活性。(图-2)(2)经农杆菌法转化烟草获得了一批转化再生植株。经PCR分析，GUS组织化学染色及GUS比活定量测定表明这四种类型的嵌合基因已经整合到烟草染色体上，除转pBG440ΔNOS的烟草植株外其它转基因植物都有GUS的表达。GUS平均比活性转pBG440植株的是转pBG437的5倍，是转pBG438的1.6倍，转pBG438的是转pBG437的3.2倍。(图-3)因为GUS基因在烟草基因组中插入位置的不同，对其表达水平有很大的影响，造成个体之间表达水平差异很大。通过尽量扩大样本量，可使得系统中单个样本对结果的影响减小，取得更为准确可信的结果。本发明研究了所获得的pBG437转化再生烟草50株，pBG438的95株，pBG440的116株，pBG440ΔNOS的80株。对每一植株进行GUS比活性定量测定后，获得GUS有表达的pBG437为33株，占总再生植株的66％；pBG438为50株，占53％,pBG440为81株，占70％,pBG440表达GUS活性的植株比例稍高于其它类型的比例，可能是这一类型的GUS基因的表达水平高造成的。但总的看表达GUS活性的植株占总再生植株的百分比差别不大，表明四个构建的转化条件较一致，转化效率相似。转pBG440ΔNOS的植株虽PCR为阳性但没有检测到GUS表达。从表1的显著性分析[11]可得知，pBG437,pBG438,pBG440之间GUS活性的差异是显著的，反映了四种不同结构对GUS表达水平的真实影响，而并非实验中误差所至。从图3可见转pBG440的烟草表达GUS活性高的(＞30pmolMU/min/ug总蛋白)所占的比例最大，转pBG438的GUS活性高的植株占的比例高于转pBG437的烟草，相应的GUS低水平表达的植株(1-10pmol MU/min/ug总蛋白)中，转pBG437的比例最高，转pBG440的最低。从图4也可看出转pBG440的平均GUS比活性最高，是转pBG438的1.6倍，是转pBG437的5倍，转pBG438的平均GUS比活性明显高于转pBG437的，是转pBG437的3.2倍。
表1
GUS活性单位pmol MU/min/ug total protein.
*差异显著；--不显著；本发明从瞬间表达和转基因植物两个方面，第一次对TMV-RNA的非翻译区对嵌合GUS基因在整体植物中表达的影响作了较系统的研究，证明在整合状态下，TMV-RNA的3’UTR区可以与5’端的UTR序列(即Ω片段)共同作用，从而明显地提高插在这两个UTR序列之间的外源基因的表达水平。在pBin440中，发明人使用了CaMV35S启动子和NOS 3’终止序列来调控外源基因的转录，这里不排除用其他转录调控序列也可取得类似的效果。以上结果证明本发明构建的植物表达载体pBin440确实为一个高效表达载体，它在植物基因工程研究以及转基因植物的开发运用方面具有重要的运用价值。
总之，本发明所构建的植物表达载体pBin440与报告基因融合构建成植物表达载体pBG440，通过农杆菌介导转化双子叶植物，能够高效表达目的基因，该植物表达载体对于植物的抗虫、抗病等基因工程的开发利用，有着广泛的应用前景。
参考文献[1]Dowson Day MJ,Ashurst JL,Mathias SF,Watts JW,Wilson TMA,Plant viral leaders influence expression of a reporter gene in tobacco.Plant Molecular Biology 23:97-107(1993)[2]毛立群，郭三堆，Ω序列和3’poly(dA)长度与基因表达效率的关系植物学报1998,40(12):1166-1168[3]Gallie DR,Lucas WJ,Walbot V:Visualizing mRNA expression inplant protoplast:factors influencing efficient mRNA uptake andtranslation.Plant cell 1:301-311(1989)[4]Sleat DE,Hull R,Turner PC,Wilson TM:Studies on the mechanismof translational enhancement by the 5′-leader sequence of tobaccomosaic virus RNA Eur J Biochem.1988 Jul 15:175(1)；75-86[5]NAR 19:5031-5036,1991；Pl.Mol.Biol.32:145-158,1996[6]田颖川等中国科学20(8):822-831,1990[7]李太元等，高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学B辑24:276-282,(1994)[8]田颖川等，生物工程学报1991 7:1-10[9]Richard A.Jefferson,Assaying chimeric gemes in plants:the GUSgene fusion system,Plant Molecular Biology Reporter,1987(5):387-405[10]顾红雅，瞿礼嘉等，植物基因与分子操作，1994,275-276[11]杜荣骞，生物统计学，高等教育出版社，1985 p118-135[12]Leathers V,Tanguay R,Kobayashi M,Gallie DR:A phylogeneconserved sequence within viral 3’untranslated RNA pseudoknotsregulates translation.Mol.Cell Biol.1993 Sep:13(9):5331-47.[13]Jefferson R A,Kavanagh T A,Beven M W.EMBO Journal,198权利要求
1．一种植物表达载体，其特征在于启动子下游含有TMV 5’UTR(Ω)和转录终止序列上游含有如下式所述的TMV 3’UTR-RNA3’非翻译区的204bp核苷酸的序列。GGTAGTCAAGATGCATAATAAATAACGGATTGTGTCCGTAATCACACGTGGTGCGTACGATAACGCATAGTGTTTTTCCCTCCACTTAAATCGAAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGCGGGTCAAATGTATATGGTTCATATACATCCGCAGGCACGTAATAAAGCGAGGGGTTCGAATCCCCCCGTTACCCCCGGTAGGGGCCCA。
2．根据权利要求1中所述的一种植物表达载体，它是在pBin438的基础上构建的。
3．一种重组微生物，含有权利要求1、2所述特征的植物表达载体。
4．根据权利要求3所述的重组微生物，是一种大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α。
5．根据权利要求4所述的重组微生物，其保藏登记号为CGMCCNo.0444。
6．根据权利要求3所述的重组微生物是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。
全文摘要
利用烟草花叶病毒(TMV)RNA的非翻译区序列(UTR)构建植物高效表达载体pBin440,包含所述的UTR序列与GUS报告基因的融合基因构建体,用所说的构建体转化植物外植体所产生的高效表达外源基因(GUS)的转基因植株。
文档编号C12N15/74GK1315582SQ0010356
公开日2001年10月3日 申请日期2000年3月24日 优先权日2000年3月24日
发明者田颖川, 秦红梅, 郭洪年 申请人:中国科学院微生物研究所