重组人硒蛋白p基因表达纯化方法及专用引物与培养基的制作方法

专利名称：重组人硒蛋白p基因表达纯化方法及专用引物与培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域人体蛋白基因的表达纯化方法与专用引物及培养基，特别是重组人硒蛋白P基因的表达纯化方法与专用引物及专用培养基。
原核细胞和动物细胞的硒蛋白均含有硒半胱氨酸，如原核细胞的甲酸脱氢酶、动物细胞的谷胱甘肽过氧化物酶、甲状腺原氨酸脱碘酶、硒蛋白P等。各种硒蛋白的活性中心均决定于硒半胱氨酸，硒半胱氨酸在其基因阅读框架中均编码为TGA，而TGA在一般蛋白的翻译时作为终止密码。已发现的动物细胞硒蛋白中，绝大多数蛋白的多肽链含一个硒半胱氨酸。人硒蛋白P(HSEP)是在人血浆中发现的富硒蛋白，具有多种抗氧化功能，而人硒蛋白P却含有十个硒半胱氨酸，即其基因阅读框架中有十个终止密码TGA，这给用基因工程方法表达人硒蛋白P基因带来了非常大的困难。本发明的发明人通过基因重组的方法，构建了一种重组人硒蛋白P，其在3′端非编码区内包括干环部分，使在转录基因不变的情况下，阅读时不受终止密码的控制。该重组基因的序列发表于Hill KEPNAS,1993 vol.90,pp537-541；Yasui Y,Yang JGGene,1996 vol,pp269-270。
本发明的目的是提供一种上述重组人硒蛋白P基因表达纯化的方法。
本发明的技术方案为一种表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，包括以下步骤(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因；(2)、将上述扩增的硒蛋白P基因与克隆载体连接，构建人硒蛋白P克隆质粒；(3)、将上述人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达全长人硒蛋白Pa、将上述带有人硒蛋白P基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为0.5时停止培养；c、将上述菌液放入装有富硒培养基的培养瓶内，在37℃摇箱内培养5小时，测菌液A650OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)、纯化人硒蛋白Pa、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人硒蛋白P；d、用金属镍螯合剂亲和层析进行纯化。
本发明的另一目的是提供一种重组人硒蛋白P基因表达纯化中的专用引物及专用培养基。
本发明专用引物的基因序列为引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′本发明的专用培养基，由下列配方组成富硒酵母提取物10克蛋白冻16-20克亚硒酸钠1-20微克氯化钠10克加无离子水至1000毫升本发明由于采用了上述方法，特别是由于采用了本发明的专用引物及专用培养基，使重组人硒蛋白P基因能够得到表达和纯化，为对人硒蛋白P的进一步科学研究及批量生产奠定了基础。
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。


图1为纯化的人硒蛋白P的电泳图实施例一、人硒蛋白P基因cDNA的获得1、取2克人胎儿肝细胞，采用美国Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法提取总RNA，将总RNA走变性胶，确认总RNA的质量可靠；2、设计引物如下引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′3、以上述总RNA为模版，PCR反转录合成人硒蛋白P的cDNA,PCR反应体系参照文献(Scarf S.J.,In PCR ProtocolA Guide to Method andApplication,and ed.New York,Academic Press,USA 1990)进行，反应条件为94℃变性50秒，55℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃保温10分钟4、PCR产物经1％琼脂糖电泳初步确证后，酚/氯仿抽提回收；二、构建人硒蛋白P克隆质粒
1、按照Klenow多聚酶推荐方法，将PCR产物用Klenow多聚酶补平。
2、将补平的PCR产物与EcoRV酶切的pBluscript KS载体(任何的克隆载体均可以，如PUC19,pGEM等)平端连接，连接反应体系如下pBluscript KS(EcoRV酶切)1ul5x连接缓冲液2ulT4 DNA连接酶1ulEcoRV(1u/1ul) 0.5ulPCR产物 4ulH2O 1.5ul以上混合物16℃连接12小时；3、将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆，用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定出重组质粒pBLU-HSEP；三、表达质粒pMAL-HSEP的构建1、将上述pBLU-HSEP克隆载体中人硒蛋白P(HSEP)的基因片段用SalⅠ和PstⅠ双酶切下，经1％琼脂糖电泳，回收约1.4 Kb的人硒蛋白P的基因片段；2、将上述该片段与相同酶切的pMAL表达载体(表达载体是多样的，如pBluescript KS、pPUC、pGEM等)连接，连接反应体系如下pMAL(SalⅠ,PstⅠ酶切)1ul5x连接缓冲液 2ulT4 DNA连接酶 1ulHSEP 5ulH2O 1ul以上混合物16℃连接12小时3、将连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB板，挑取阳性克隆；4、用碱裂解法制备质粒DNA，将质粒DNA用SalⅠ和PstⅠ双酶切鉴定出重组质粒pMAL-HSEP；四、HSEP在大肠杆菌中的表达1、将筛选出的在E.coli JM109中的重组质粒pMAL-HSEP克隆接种10mlLB试管，16℃ 300r/min摇床培养，测菌液A650 OD值为0.5时停止培养；2、制备富硒培养基(TYSeY培养基)，其配方为富硒酵母提取物 10克蛋白冻 16克亚硒酸钠 5微克氯化钠 10克加无离子水至1000毫升其中富硒酵母提取物可购自美国difco公司，也可自制，自制方法为接种酿酒酵母菌于丰富培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，20ug/L亚硒酸钠)，30℃摇床培养3天，收集酵母菌，离心5000r/min 20分钟，去上清液，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶沉淀，超声破碎菌体，离心10000r/min20分钟，干燥沉淀。
3、将上述10ml菌液放入装有1000ml TYSeY培养基的培养瓶中，在37℃摇箱内培养300r/min，测菌液A650 OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)诱导，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；4、收集细菌，以3000转/分，4℃，离心20分钟，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸盐缓冲液混溶沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至1mM，放于-20℃冻存；五、HSEP的分离纯化1、将细菌沉淀用pH 8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心5000转/分，4℃，5分钟，去上清液，再用磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；2、用超声破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使细菌裂解，4℃条件下12000转/分离心，30分钟，取上清液；3、按麦芽糖结合蛋白亲和层析试剂盒(美国BioLab公司)推荐方法纯化融合蛋白将离心后上清液装亲和层析柱，然后用磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗层析柱，最后用10mM麦芽糖磷酸盐缓冲液洗脱单一蛋白峰，将洗脱下的融合蛋白进行酶切，反应如下融合蛋白(1mg/m1)20ul酶因子Xa(200 ug/m1) 1ul室温下反应3小时；4、用金属镍螯合剂亲和层析按Ni-NTA蛋白纯化试剂盒(美国QIAGEN公司)推荐方法进行纯化将酶切后的蛋白混合物用磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析，上述透析平衡的HSEP溶液人Ni-NTA，混匀，放置30分钟，用磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗二次后用100mM咪唑(imidazol)磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱；将纯化的人硒蛋白P走12％的聚丙烯酰胺胶，如
图1所示，所得HSEP溶液SDS-PAGE电泳呈现一条带(A为目的产物的带，B对照带)，其分子量为40Kd，与天然人硒蛋白P相符。
在上述实施例中，表达质粒的构建还可以用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以人硒蛋白P克隆质粒DNA为模板，做PCR扩增；将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接(与上述实施例三、表达质粒pMAL-HSEP的构建中的1、2、3、4所述的步骤相同)。
富硒培养基(TYSeY培养基)，其配方还可为富硒酵母提取物8克蛋白冻18克亚硒酸钠20微克氯化钠10克加无离子水至 1000毫升或富硒酵母提取物 12克蛋白冻 20克亚硒酸钠 1微克氯化钠 10克加无离子水至1000毫升
权利要求
1.一种表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、克隆人硒蛋白P的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因；(2)、将上述扩增的硒蛋白P基因与克隆载体连接，构建人硒蛋白P克隆质粒；(3)、将上述人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达全长人硒蛋白Pa、将上述带有人硒蛋白P基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为0.5时停止培养；c、将上述菌液放入装有富硒培养基的培养瓶内，在37℃摇箱内培养5小时，测菌液A650OD值，当OD值为1.0时，向菌液内加IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)、纯化人硒蛋白Pa、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人硒蛋白P；d、用金属镍螯合剂亲和层析进行纯化。
2.根据权利要求1所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于所述反转录PCR法扩增硒蛋白P的基因所用的引物为引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′
3.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于所述将人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体的方法为表达载体为任一表达载体；用一对上游和下游的5′端各带有和表达载体相对应的二个限制性内切酶位点的引物，以人硒蛋白P克隆质粒DNA为模板，做PCR扩增；将PCR产物用常规方法进行纯化；用二个相应的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，用常规方法纯化酶切后的PCR产物和表达载体；用T4连接酶将纯化的PCR产物和表达载体连接。
4.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于所述将人硒蛋白P克隆质粒亚克隆进表达载体的方法为表达载体为任一表达载体；选用克隆载体和表达载体上相同的限制性内切酶位点。用一个限制性内切酶对克隆载体和表达载体酶切，切出克隆载体内的硒蛋白P基因序列，切去表达载体内的多克隆位点序列；用常规方法纯化硒蛋白P基因序列和切去表达载体内多克隆位点序列的表达载体；用T4连接酶将纯化的人硒蛋白P基因序列和表达载体连接。
5.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于在所述表达全长人硒蛋白P的过程中，LB培养基中加入的抗生素为氨苄青霉素；收获细菌的方法为将培养物以3000转/分离心20分钟，去上清液，收集沉淀。
6.根据权利要求1或2所述的表达纯化重组人硒蛋白P基因的方法，其特征在于在所述纯化人硒蛋白P的步骤中，用磷酸盐缓冲液洗洗细菌沉淀后，离心的速度为5000转/分，持续5分钟；细菌裂解的方法为超声破碎法或溶菌酶裂解法，细菌裂解后的离心为12000转/分，持续30分钟，取上清液；初步纯化的方法为离子交换层析或分子筛法。
7.一种表达纯化重组人硒蛋白P基因中的专用引物，其基因序列为引物15′GTGGTTGTGACAACCCCAGC 3′引物25′AATGGAAAGCATGTCTTTGT 3′
8.一种表达纯化重组人硒蛋白P基因中的专用培养基，由下列配方组成富硒酵母提取物8-12克蛋白冻16-20克亚硒酸钠1-20微克氯化钠10克加无离子水至1000毫升
9.根据权利要求8所述的一种表达纯化重组人硒蛋白P基因中的专用培养基，其特征在于它是由下列配方组成的富硒酵母提取物10克蛋白冻16克亚硒酸钠 5微克氯化钠 10克加无离子水至1000毫升
全文摘要
本发明涉及一种重组人硒蛋白P基因的表达纯化方法与专用引物及专用培养基,该方法将人肝细胞cDNA,用PCR方法(引物1为5′GTGGTTGTGACAACCCCAGC3引物2为5′AATGGAAAGCATGTCTTTGT)获得人硒蛋白P基因,并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中,在有1-20ng/ml亚硒酸钠及富硒酵母提取物的培养基中进行培养表达,表达产物用金属螯合镍亲和层析纯化,本发明的方法为大量生产人硒蛋白P奠定了基础。
文档编号C12N15/12GK1314469SQ0010313
公开日2001年9月26日 申请日期2000年3月20日 优先权日2000年3月20日
发明者杨建国 申请人:北京市营养源研究所