专利名称：鸡crbp2基因遗传变异的检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因变异的检测方法，具体涉及鸡CRBP2基因遗传变异的检测方法和应用。
背景技术：
单核苷酸多态性(singlenucleotid印olymorphisms，SNPs)主要是指基因组DNA 中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化所引起的DNA序列的多态性。 SNP标记和其他遗传标记，如限制性酶切片段长度多态性(re-striction fragment length polymorphism, RFLP)、微卫星标记(microsatellites or short tandem repeats, STRs)等 相比具有两个显著特点。一是，SNP在基因组中的分布最为广泛，有最为丰富的遗传多样性， 而且许多SNP和生物性状的变异相关联，其本身即是遗传变异研究的候选基因或位点。所 以，研究SNP有助于解释不同个体表形性状的差异，不同群体和个体对疾病、环境因子等反 应的差异；其二，SNP在基因组中为双等位基因，在任何群体中其等位基因的频率都可准确 地估算出来，因而便于高通量的批量检测，此外，通过比较种间SNP的差异，还可以了解种 间的亲缘关系和群体遗传多样性等信息。目前对SNP进行检测的方法较多，而大多数实验室采用的是成本相对较低、技术 易掌握、检出率较高、快捷、安全和步骤简单的PCR-SSCP技术。该方法原理是经PCR扩增 的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并确保成为DNA单链，然后在一 定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时， DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在 非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由DNA单链碱 基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA 单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同，PCR产物变性 后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因靶DNA中发生单碱基置换，或个别碱基插入或 缺失时，因迁移产生变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。相同长度 的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，其在凝胶中泳动速度 不一样，从而显示出带型的差异，即多态型。SNP有非同义cSNP、同义cSNP、内含子区SNP、调控区的rSNP几类，均能从不同角 度影响基因功能，其中非同义cSNP由于改变基因编码的氨基酸，从而影响基因功能；同义 cSNP可通过改变mRNA的二级结构、翻译速度等影响基因功能的发挥；内含子区SNP可通过 改变剪接位点的活性来影响基因功能；调控区的rSNP则可通过影响启动子元件来调节基 因的功能。CRBP2是一类与维生素A (VA)代谢有关的疏水性小分子，担任着转运视黄醇(VA) 的任务，从而参与体内许多生物学过程，如视觉、繁殖、上皮细胞的维持、骨的生长发育等 [7]。陈咏梅等O000)研究后发现睾丸支持细胞(Sertoli细胞)可合成CRBP2，且合成量具 有与生精周期相伴的的周期性变化。因此研究CRBP2基因遗传变异和分子遗传特征对动物生长发育、繁殖具有重要理论意义和实践意义。迄今为止，国内外均未见鸡CRBP2基因遗传变异的研究，由于中国地方鸡种CRBP2 基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与产蛋性状(如产蛋 量、开产体重、开产蛋重等)关联的研究仍是空白。
发明内容
本发明的目的在于，采用PCR-SSCP技术检测鸡CRBP2基因的单核苷酸多态性，并 将其与生产性状进行关联分析，以筛选出SNP位点以辅之于育种，加快畜禽育种进程。为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案一种鸡CRBP2基因遗传变异的检测方法，其特征在于包括提取鸡血样 基因组DNA ；对基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为 ATTTCATTTATGCAGACACTA,下游引物序列为CAGAGATCAGAGCTGTCTAA ；将扩增产物进行凝胶 电泳并拍照，分析电泳结果；。本发明的一个实施方式中，PCR扩增步骤包括30 40个循环的变性、退火、延伸步骤。本发明的一个实施方式中，PCR扩增为对包括鸡CRBP2基因第90 位点的基因片 段进行扩增。本发明的一个实施方式中，PCR扩增片段长度为237bp。本发明的一个实施方式中，在于还包括对扩增的基因片段进行测序。本发明还涉及一种或一对PCR扩增引物，其序列为ATTTCATTTATGCAGACACTA和/ 或 CAGAGATCAGAGCTGTCTAA。本发明还涉及鸡CRBP2基因第90 位点T/C多态性在畜禽育种中的应用。本发明还涉及将所述的检测方法在鸡育种中的应用。本发明的一个实施方式中，所述的应用是指筛选产蛋率高的鸡。本发明还涉及将所述的PCR扩增引物在鸡CRBP2基因第90 位点T/C多态性检 测中的应用。本发明根据CRBP2基因的序列设计引物，分别以2个鸡品种/系的基因组DNA为 模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到的鸡的CRBP2基因的部分序列与 NCBI公布的原鸡的序列进行比较发现在编码区第90 位存在SNP多态性。针对上述第90 位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计 特定的引物PCR扩增包含SNP位点的基因片段，然后进行高温变性再进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本发明对2个鸡品种/系的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP 位点与鸡产蛋性状(开产体重、300日龄产蛋量、开产蛋重、平均产蛋间隔)进行关联分析， 该SNP位点的CC基因型可以做为一个提高鸡300日龄产蛋量的候选分子遗传标记。
图IPCR扩增产物的凝胶电泳结果；图2PCR扩增产物的测序验证；
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。(1)特定引物的设计针对鸡CRBP2基因第90 位点错义密码子突变 可能产生编码蛋白组成发生变化的单核苷酸多态性，以NCBI公布的原鸡序列 (NC_006096. 2REGI0N :6957813. · 6968779)为参考，利用 Primer5. 0 设计能够扩增包含 鸡CRBP2基因第三外显子(8932 9033)区域的PCR引物，其引物序列M为上游引物 ATTTCATTTATGCAGACACTA(8917 8937)，下游引物CAGAGATCAGAGCTGTCTAA (9134 9153)。 扩增片段长度为237bp。对不同品系和个体的血样混合成DNA池后以该对引物进行扩增， 得到与目的片段大小一致的片段，经双向测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现在 90 位点存在T/C多态性。(2)鸡样本的采集以3个鸡品种/系作为检测对象，具体采集样本见表1。
O ΛΧ,样样样品采品数品名称来源样方式二郎山山地 鸡02品系(SD02)188血四川 农业大学 科研鸡场翅 下静脉 ^Ja-二郎山山地 鸡03品系(SD03)161样(3)鸡血样基因组DNA的提取①冷冻血液在室温融化以后，取10 μ L移至离心管中，加入500 μ LSTE缓冲液， IOyL SDS，加入IOyL蛋白酶Κ(浓度为10 μ g/uL)，混合，上下充分摇动，37°C摇床水浴2 小时，然后55°C水浴过夜。②将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，轻摇离心管20分钟，直至两相混合形成 乳浊液，4°C，12000r/min离心10分钟。③取上清，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10分钟，4°C，12000r/min离心10分钟。④取上清，加入等体积酚氯仿异戊醇混合液04 23 1)，缓慢颠倒离心管 10 分钟，4°C，12000r/min 离心 10 分钟。⑤取上清，加入等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10分钟，4°C，12000r/min离心10分钟。⑥取上清，加入2倍体积的预冷-20°C冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白 色DNA沉淀。⑦4°C，12000r/min离心10分钟，去上清，然后加4°C预冷的70%乙醇快速冲洗两 次，12000r/min离心10分钟，去上清。⑧将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入 适量(100-200 μ L) TE (pH8.0)缓冲液溶解，置4°C冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于4°C、-20°C、-70°C 中备用。注意在抽吸上清液时，尽量小心勿将中间的蛋白质层抽出。(4) PCR 扩增PCR 反应体系 QXTaq PCR MasterMix 5 μ L、ddH20 3.4yL、引物(10pmol/yL) 各0. 4μ L、模板DNA(50ng/mL)0. 8μ L)采用的是混合法，即先把引物、酶、ddH20比扩增量多 一点的份数混勻后分装，最后加入模板短暂离心后进行PCR扩增，扩增程序为94°C预变性 5min — (94°C变性 30s — 53. 3°C退火 30s — 72°C 30s) X35cycle — 72°C延伸 IOmin.(5)电泳及基因型判定将扩增产物99°C变性5min后于10%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后 进行硝酸银染色拍照。根据电泳结果直接判定个体基因型，四条带的为杂合型，上面两条带 的为CC纯合型，下边两条带的为TT纯合型，具体见附图1。(6)不同基因型个体PCR产物的测序验证对不同基因型个体各5个50 μ 1大体系扩增，经琼脂糖凝胶检测有目的条带后直 接送华大公司纯化测序，结果见附图2，双峰为杂合型个体。(7)鸡CRBP2基因SNP位点的基因和基因型频率统计分析①基因型频率指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于PCR-SSCP 方法的检测结果为共显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率。基因型频率=基因型个数/检测群体总数②等位基因频率记为Pi，表示在一个群体中某一等位基因的数量与占据同一基 因座位的全部等位基因总数的比例，取值0-1之间。Pi = [2(ii) + (ijl) + (ij2)+......(ijn)]/2NPi 第i个等位基因的频率i 纯合复等位基因jl、j2、……jn:与i共显的第1到第η个等位基因鸡CRBP2基因第90 位SNP基因频率分布表
权利要求
1.一种鸡CRBP2基因遗传变异的检测方法，其特征在于包括提取鸡血样基因组DNA ；对 基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为ATTTCATTTATGCAGACACTA， 下游引物序列为CAGAGATCAGAGCTGTCTAA ；将扩增产物进行凝胶电泳并拍照，分析电泳结果。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中PCR扩增步骤包括30 40个循环的变性、退 火、延伸步骤。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中PCR扩增为对包括鸡CRBP2基因第90 位点 的基因片段进行扩增。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于PCR扩增片段长度为237bp。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于还包括对扩增的基因片段进行测序。
6.一种或一对PCR扩增引物，其序列为ATTTCATTTATGCAGACACTA和/或 CAGAGATCAGAGCTGTCTAA。
7.鸡CRBP2基因第90 位点T/C多态性在畜禽育种中的应用。
8.权利要求1-5任意一项所述的检测方法在鸡育种中的应用。
9.根据权利要求7的应用，其特征是筛选产蛋率高的鸡。
10.权利要求6所述的PCR扩增引物在鸡CRBP2基因第90 位点T/C多态性检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鸡CRBP2基因遗传变异的检测方法，其特征在于包括提取鸡血样基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为ATTTCATTTATGCAGACACTA，下游引物序列为CAGAGATCAGAGCTGTCTAA；将扩增产物进行凝胶电泳并拍照，分析电泳结果。其中鸡基因组第9028位点T/C多态性与产蛋性状(如产蛋量、开产体重、开产蛋重等)相关，选出的单核苷酸多态性位点以辅之于育种，可以加快畜禽育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102134607SQ201110003340
公开日2011年7月27日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者刘益平, 朱庆, 肖礼华, 赵小玲 申请人:四川农业大学