专利名称：大豆adf基因及其在花器官改造中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个大豆ADF基因GmADFl的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中广泛存在的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统。肌动蛋白骨架对植物高度特异化的细胞如花粉管、叶毛、根毛和气孔保卫细胞的形态发生和功能起着重要作用，同时在高等植物形态发生的细胞分裂和伸长过程中发挥着极为关键的调节作用(Kostei al. , 1999; Dong et al. , 2001) ADF (actin depolymerizing factor)作为一种重要的肌动蛋白结合蛋白，自从1997年Carlier克隆第一个拟南芥ADFl后，越来越多的植物ADF被克隆。众多研究表明ADF可调节肌动蛋白聚合和解离，参与植物细胞形态建成，从而起到调节植株性状的作用，为筛选特定性状的植株提供了理想的候选调控基因。大豆起源于我国，是重要的粮油兼用作物。大豆作为严格自花授粉的作物，其花器较小，花粉粘重，花朵开放时翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，导致花药和柱头不能外露，故造成大豆异花传粉非常困难，同时也使得大豆的杂种优势很难被利用。若能定向改变大豆的花器官结构，使之更利于接受外源花粉，必将大大降低不育系繁殖或杂交制种的成本，使大豆杂交种应用于大面积生产得以实现。因此，从分子水平上挖掘能够影响和控制细胞形态建成的相关基因，并应用于特定器官的改造，如大豆的花器官，具有重要的理论和现实意义。本发明从大豆中克隆了 1个影响花瓣位置和数目的基因—iF_/，提出了利用该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的旨在公开GmADFl在花器官改造中的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，改变植物的花型，从而进行植物品种改良。技术方案
本发明所提供的大豆ADF基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1，其表达蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。大豆ADF基因GmADFl的基因工程应用，包括 1) X^GmADFl 的克隆
搜索大豆EST库，设计一对引物如下 上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3，，见 SEQ ID NO. 3 ； 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3，，见 SEQ ID N0. 4 ； 提取大豆品种拟899叶的总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增。PCR 反应体系为 25μ L，包含模板 cDNA 1.0 μ L(50ng. μ Γ1) ,IOXTaq 缓冲液 2 μ L，MgCL2 1.2 μ L (25 mmoL. L-1), dNTPsO. 5 μ L (10 mmoL. L-1), Taq 聚合酶 0· 5 μ L (5 U. μ L-1)，上游弓 |物，下游引物各1.0 μ L (lOpmoL. μΓ1)，用ddH20补齐至25 μ L0 PCR反应程序为:95°C 预变性4min，反应共30个循环包括95°C变性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，最后 72°C保温10 min0再将PCR产物进行克隆至pGEM-Teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆 GmADFl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；
2)植物表达载体的构建
运用Gateway技术可以快速并高效地将目的序列同时构建到多种与(Gateway技术兼容的载体系统，用于功能分析和蛋白质表达研究。其基本过程如下根据Gateway说明书设计一对过量表达的特异性引物
上游引物5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACG CAGCATCTGGTATGGC -3，，见 SEQ ID NO. 5 ； 下游引物5，_ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGC TTTTGAACAC -3，，见 SEQ ID NO. 6 ；
将经PCR扩增并测序后的目的序列与donor vector进行BP反应，得到的entry cLone 再与destination vector (pMDC83)进行LR反应，获得植物表达载体_C83-GmAIWl。
3)转基因植株的获得
将步骤2)获得的表达载体经过液氮冻融法将其转入根癌农杆菌菌株EHA105，进一步转化烟草。对获得的转基因烟草植株进行PCR，RT-PCR验证后再对阳性植株的表型进行分析。转GmADFl基因烟草植株部分开花提前，花瓣的数目或增加或减少，并且花瓣的空间分布呈多样性。此外，有的花出现了融合的现象，即两朵花共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5个，但其内部却又长出两个类花瓣，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊， 这样的位置关系导致了该类型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看则呈两小半且表面较为光滑，有粘性。有益效果
的组织表达分析表明其参与了大豆根，莲，茎尖，叶，花和种子的发育。过量表达 GmADFl的烟草的花器官变化表明GmADFl在花瓣位置和数目及其空间分布方面可能发挥了重要的调控作用。本发明公开了该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。该方法对培育花器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定向地改造植物的花器形态，为重要的经济农作物提高育种效率。利用植物表达载体，将本发明的―导入植物细胞，可获得花器官改变的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(潮霉素标记物、卡那霉素标记物等)。然而从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。携带有本发明GmADFl的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成成熟植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、苜蓿等双子叶植物。
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下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1 GmADFl基因的组织表达分析
(A) GmADFl在大豆不同组织中的半定量RT-PCR分析；(B) GmADFl在大豆不同组织中的实时荧光定量RT-PCR分析。分别采用半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR技术对不同大豆组织中GmADFl的表达情况进行研究，内参为Actin。图2过量表达GmADFl引起烟草植株花器形状和结构异常
A 花药未开裂的野生型烟草(WT)的花，花瓣为5枚；E 花药开裂的野生型烟草(WT) 的花，花瓣为5枚1，K 转GmADFl基因烟草的花，花瓣为6枚，分布不对称；B，F 转GmADFl 基因烟草的花，花瓣为4枚，对称分布；C，G 转GmADFl基因烟草的花，花瓣为5枚，分布不对称；D，J 转GmADFl基因烟草的融合花，花瓣总数仍为5枚，但从中间对分，只有一套雄蕊和柱头且柱头高于雄蕊，致不能正常授粉；H 花瓣内生；L 柱头开裂。
具体实施例方式下述实例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。实施例1、大豆ADF基因GmADFl的cDNA克隆与鉴定搜索大豆EST库，设计一对引物如下
上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3’ 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3’
应用RT-PCR方法，从大豆品种N2899 (公知公用，国家大豆改良中心可购买)中克隆了基因。取大豆六复叶期的叶片，于玻璃研钵内加入液氮迅速研磨成粉末，然后
加入裂解液进一步研磨制成勻浆。再移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzoL Reagents, Invitrogen, USA)。抽提完毕用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，然后利用分光光度计测定RNA的含量。以获得的总RNA为模板，按照TaKaRa公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链。再进行PCR扩增反应。PCR反应体系为25 μ L， 包含模板 cDNA 1. 0 μ L(50ng. μ Γ1)，IOXTaq 缓冲液 2 μ L, MgCL2 1. 2 μ L (25 mmoL. Γ1)，dNTPsO. 5 μ L (10 mmoL. Γ1)，Taq聚合酶0. 5 μ L (5 U. μ Γ1)，上游引物，下游引物各 1.0 μ L (lOpmoL. μΓ1)，用 ddH20补齐至 25 yL。PCR反应程序为:95°C预变性 4 min，反应共30个循环包括95°C变性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，最后72°C保温10 min。 将693 bp的PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆GmADFl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；
实施例2、极GmADFl基因在不同组织中的表达特征
大豆品种N2899于正常季节播种于南京农业大学网室中。取大豆六复叶期的根、茎、茎尖和叶，大豆盛花期(Rl)的花，开花后15、20、30、40、45天种子的混合物，以上样品采集后均立即于液氮速冻后存于_80°C备用。总RNA的提取同实施例1。以大豆组成型表达的Jcii/ 基因(GenBank accession No. V00450)为内部参照，以来自大豆不同组织的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR 分析结果表明—iF·/在根、茎、茎尖、叶、花和种子中都有较强的表达，且以根和花中的表达量最高。推测—可能参与了这些组织的细胞形态建成和生长发育过程，尤其是在具有顶端生长优势的器官中更加明显。实施例3、GmADFl的基因工程应用
搜索大豆EST库，设计扩增出完整编码阅读框的引物 上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3’ 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3’
以1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将的cDNA克隆至 pGEM-Teasy载体，进一步克隆到植物表达载体pMDC83 ；通过冻融法将此表达载体转入农杆菌菌株EHA105，通过农杆菌介导法转化烟草，并对获得的转基因植株进行表型分析，发现 GmADFl的异位表达促使烟草植株的花瓣数目或增加或减少，并且花瓣的空间分布呈多样性。此外，有的花出现了融合的现象，即两朵花共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5 个，但其内部却又长出两个类花瓣，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊，这样的位置关系导致了该类型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看则呈两小半且表面较为光滑，有粘性。综合以上结果，我们认为―在花瓣位置和数目及其空间分布方面可能发挥了重要的调控作用。该方法对培育花器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定向地改造植物的花器形态，为重要的经济农作物提高育种效率。利用
基因获得的花器官发生变异的新材料可应用于重要的经济农作物和观赏园艺植物的育种工作。
权利要求
1.一种大豆ADF基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
2.一种大豆ADF基因在花器官改造中的应用，其特征在于按如下步骤实现1)大豆ADF基因的克隆设计一对引物如下上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3’下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3’提取大豆品种拟899叶的总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增；其中 PCR 反应体系为 25 μ L，包含模板 1. 0 μ LcDNA 50ng. μ Γ1, 2 yL IOXTaq 缓冲液，1.2 μ LMgCL2 25 mmoL.171，0. 5 μ L dNTPs 10 mmoL. L-1, 0. 5 μ L Taq 聚合酶 5 U. μ L-1，1.0 μ L上游引物 IOpmoL. μ Γ1,1.0 μ L下游引物 IOpmoL. μ Γ1，用 ddH20补齐至 25 yL;PCR反应程序为95°C预变性4 min，反应共30个循环包括95°C变性50s，56°C退火50s，72°C 延伸lmin，最后72°C保温10 min ；再将PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表达载体的构建设计一对过量表达的特异性引物上游引物5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACGCAGCATCTGGTATGGC -3’下游引物5，_ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGCTTTTGAACAC -3，将经PCR扩增并测序后的目的序列与donor vector进行BP反应，得到的entryclone再与destination vector pMDC83进行LR反应，获得植物表达载体； 3)转基因植株的获得将步骤2)获得的表达载体经液氮冻融法将其转入根癌农杆菌菌株EHA105，进一步转化烟草；对获得的转基因烟草植株进行PCR，RT-PCR验证后再对阳性植株的表型进行分析； 转基因烟草植株部分开花提前，花瓣的数目或增加或减少，并且花瓣的空间分布呈多样性； 此外，有的花出现了融合的现象，即共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5个，但其内部却又长出两个类花瓣，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊，这样的位置关系导致了该类型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看则呈两小半且表面较为光滑，有粘性。
全文摘要
本发明公开了一个大豆ADF基因及其在花器官改造中的应用，属于生物技术领域。一种大豆ADF基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。转基因烟草植株的花出现了融合的现象，即两朵花共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5个，但其内部却又长出两个类花瓣，形成花中有花的有趣现象，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊，因此这样的空间分布导致了该表型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看呈两小半且表面较为光滑，有粘性。利用大豆ADF基因获得变异的花器官新材料可应用于重要的经济农作物和观赏性园艺植物的育种工作。
文档编号C12N15/29GK102154312SQ20111000299
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者何慧, 喻德跃, 黄方 申请人:南京农业大学