专利名称：一种山羊草属杀配子染色体2c特异scar标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR标记，尤其涉及一种检测小 麦遗传背景下杀配子染色体2C的试剂盒及其应用。
背景技术：
小麦是世界上重要的粮食作物之一。在中国它是仅次于水稻的第二大农作物，小 麦生产对国民经济发展有着十分重要的战略意义。由于小麦栽培品种单一化，使其遗传基 础日益狭窄，抗源匮乏，极大地限制了其产量和品质的进一步改良。小麦的近缘物种中存在 着大量的遗传变异，是小麦改良可以利用的有益基因资源，将这些有益基因导入小麦一直 是遗传学家和育种学家经久不衰的研究课题。创制易位系是把外源有益基因导入小麦的一 种有效途径。常用的创制易位系的方法有自发易位、辐射诱发、利用Ph基因、染色体错分 裂与着丝点再融合、组织培养以及利用杀配子染色体等。国内外的研究都已证明，利用杀配 子染色体诱导产生易位的频率要远远高于其它方法。山羊草属植物中的一些杀配子染色体，当单体附加到不同基因型普通小麦中 时，具有完全或不完全的杀配子作用，在不完全杀配子作用下，可高频诱导各种类型的染 色体结构变异，变异频率可达10%以上，远远高于自发易位、辐射诱发、Ph基因等其他 方法的诱导效率。这些杀配子染色体是经长期自然选择保留下来的，有的与小麦有部 分同源关系，在诱导染色体结构变异中有特殊的意义。杀配子染色体不仅可诱导普通 小麦染色体结构变异，而且对附加或代换到普通小麦中的外源染色体也具有同样的功 能，这就为小麦的诱变育种开辟了一条新途径。杀配子染色体起源于不同的基因组(C， S或M)，就同祖性来说，现已识别出三种类型的山羊草杀配子染色体同祖群2中的杀 配子染色体 Ae. Iongissima (2)、Ae. sharonensis、Ae. cylindrica、Ae. speltoides (1) 和Ae. speltoides (2)；同袓群3中的杀配子染色体Ae. triuncialis (1)和 Ae. triuncialis(2)；同袓群 4 中的杀配子染色体 Ae. Iongissima(I)、Ae. Iongissima (3)、 Ae.sharonensis(2)禾口 Ae. sharonensis(3)0杀配子染色体效应的强度是多样的，从致死到半致死，而且也受不同小麦的遗传 背景的影响，其作用特点、方式也各不相同。染色体2S1()，2Ssh，T2B-2Ssp'au,4Sl0,4Ssh,4Ssh#2, 在“中国春”小麦中引起不带这些染色体的配子完全不育，因此无法传递给下一代。3C染色 体在“中国春”中发挥很强的杀配子效应，但在其它品种中却产生温和的、半致死效应，暗示 在这些栽培品种中仍存在阻遏基因。染色体T2B-2SSP "，2C，3(fAT*4Mg，在中国春中诱导半 致死效应的染色体断裂，而且结构重排的染色体可以被保留和分离。染色体3C和3Csat都 起源于离果山羊草，但是它们的杀配子效应强度在“中国春”中却不相同；其中3C的效应是 致死的，而3CSAT则是半致死的。杀配子染色体2C在普通小麦“中国春”等遗传背景下可诱导半致死效应的染色体 断裂，使后代产生易位、缺失等染色体结构畸变。利用杀配子染色体2C在构建大麦染色体 缺失图谱，诱导小麦-偃麦草、小麦-冰草易位等方面取得了很好的成效。在杀配子染色体2C的利用过程中，杂种后代中2C染色体的鉴定是非常重要的环节。有很多学者利用分带的 方法对后代进行鉴定，但该方法非常繁琐，而且需要结合相关的细胞学技术。与之相比，利 用DNA分子标记进行鉴定则是十分方便快捷的途径。随机扩增多态性DNA(RAPD)技术具有操作简单、模板DNA用量少、扩增产物多态性 高、经济快捷等优点，已经被广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定、分子标记辅助育种、基 因定位及遗传图谱构建等多个研究领域。但由于它的重复性和稳定性较差，将RAPD标记转 化为SCAR标记后，其特异性和稳定性大幅度提高，可以更方便快捷地应用于异源染色体的 检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测小麦遗传背景下杀配子染色体2C的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另 一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。所述植物为含有杀配子染色体2C的小麦属植物，所述含有杀配子染色体2C的小 麦属植物具体为“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二 体附加系杂交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。本发明另一个目的是提供一种检测植物杀配子染色体2C的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂由如下引物对、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶和PCR缓冲液组 成所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另 一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5 μ M ；所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR试 剂中的浓度为0. 06υ/μ 1 ；所述氯化镁在所述的PCR试剂中的浓度为0. ISmM ；所述植物为含有杀配子染色体2C的小麦属植物。所述含有杀配子染色体2C的小麦属植物为“中国春”-长穗偃麦草7Ε 二体附加系 与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2 代。PCR缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号R10T1。所述的试剂盒在检测小麦遗传背景下杀配子染色体2C中的应用；所述的PCR试剂 在检测小麦杀配子染色体2C中的应用；以上应用均是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种辅助检测待测植物中是否含有杀配子染色体2C 的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述试剂盒中的引物对或所述的PCR试剂 对待测植物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产 物中含有大小为586bp，则所述待测植物中候选含有杀配子染色体2C，若所述PCR扩增产物 中不含有大小为586bp的片段，则所述待测植物中候选不含有杀配子染色体2C。所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；
所述PCR扩增的退火温度为53°C。所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表序列2自5’末端第405-990位核苷酸。所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的实验证明，本发明开发的SCAR分子标记为快速、准确地鉴定小麦遗传背 景下的外源山羊草属杀配子染色体2C奠定基础。该SCAR标记的开发对于鉴定普通小麦中 导入的杀配子染色体2C是极其有价值的，它为跟踪鉴定普通小麦-杀配子染色体2C的后 代提供了十分方便快捷的途径，也为杂种后代染色体构型的分析奠定了良好的基础。
图1为RAPD引物在普通小麦“中国春”、杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草 三种材料中的扩增结果图2为SCAR标记在柱穗山羊草、“中国春”_杀配子染色体2C 二体附加系、二倍体 长穗偃麦草、“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系中的扩增结果图3为SCAR标记在“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子 染色体2C 二体附加系杂种后代F”F2中的扩增结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。供试材料为柱穗山羊草(Endo TR. Gc chromosomes and their induction ofchromosome mutations in wheat. Jpn J Genet, 1990,65 :135-152.,公众可从哈尔滨 师范大学获得。)、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系(2n = 44AABBDD+2C II, Endo TR. Allocation of a Gc chromosome of Aegilops cylindrica to wheathomoeologous group 2. Genes Genet Syst，1996，71 :243_246，公众可从哈尔滨师范大学获得。)和“中 国春”-长穗偃麦草 7E 二体附加系(2n = 44AABBDD+7E II，DvorakJ，Knott DR. Disomic and diteleosomic additions of diploid Agropyron elongatumchromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol，1974，16 :399_417，公众可从哈尔滨师范大学 获得。)；普通小麦“中国春”(Miller TE, Hutchinson J, Chapman V Investigation of a preferentially transmitted Aegilops sharonesischromosome in wheat. Theor Appl Genet, 1982,61 :27-33.，公众可从哈尔滨师范大学获得)；“中国春”-长穗偃麦草7E 二体 附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的FpF2代。实施例1、山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR标记的获得1、山羊草属杀配子染色体2C特异RAPD标记0PF03标记的筛选与克隆利用40条RAPD引物，对普通小麦“中国春”、普通小麦“中国春”-杀配子染色体 2C 二体附加系、柱穗山羊草等材料进行扩增筛选，分离和克隆2C基因组特异扩增片段。其中，PCR扩增的20 μ 1体系Template DNA50ngIOxPCR buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl22. 5 μ 1
dNTP Mix (2. 5mM)
Random Primer(10 μ Μ)
1. 5μ 1 1 μ 1r Taq polymerase (5U/μ 1) 0. 25 μ 1_Distilled sterile water up to 20 μ 1IOx PCR buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号RlOTl。PCR程序94°C预变性 3min，94°C变性 15s，36°C复性 30s，72°C延伸 45s，46 个循环 结束后72°C延伸lOmin。4°C保存。PCR扩增产物经1. 2%的琼脂糖胶电泳进行检测，BIORAD紫外仪扫描，拍照。PCR扩增结果如图1所示，其中，M.为DL2000Marker ；a.为普通小麦“中国 春”(AABBDD)，b.为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系Qn = 44AABBDD+2C II) ；c.为柱穗山羊草；箭头所示为杀配子染色体2C特异扩增带，从图中看出，引物 0PF035，-CCTGATCACC-3，(序列1)在“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊 草中扩增出一条HOObp左右的片段，此产物在普通小麦“中国春”中没有出现，表明这个片 段是杀配子染色体2C所特有的。回收从普通小麦“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系中扩增得到的特异片段， 送去测序。经测序结果可知，该PCR产物具有序列表中序列2的核苷酸序列，序列表的序列 2由1496个核苷酸组成，将PCR产物命名为0PF031496。在GeneBank中将其进行Blast同源性搜索，结果发现它与大麦的1个cDNA克隆 序列(genbank号为AK252862. 1)同源性达92%。也可人工合成序列2。2、山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR标记的建立根据序列表序列2中的序列，利用I^rimer Premier 5. 0软件，设计了一对SCAR引 物2C-F5865，TCTGTCGGGAAACTAATT 3，(序列 3)2C-R5865，AAGATAGCAACAGGGGAG 3，(序列 4)反应体系为20 μ 1，将RAPD扩增条件调整为正反向引物各0.5 μ 1，53°C退火，35个 循环外，其他同RAPD分析。PCR扩增的20 μ 1体系PCR扩增体系Template DNA50ngIOxPCR buffer2. 5 μ 11. 5mM MgCl2 (终浓度为 0. 18mM)2. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM,终浓度为 0. 18mM)1· 5 μ 12C-F586 上游引物(10 μ Μ,终浓度为 0· 5 μ Μ)0. 5 μ 12C-R586 下游引物(10 μ Μ,终浓度为 0· 5 μ Μ)0. 5 μ 1r Taq polymerase (5U/ μ 1，终浓度为 0. 06U/ μ 1) 0. 25 μ 1_ Distilled sterile waterup to 20 μ 1
分别以“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草、“中国春”、二倍体长 穗偃麦草(Knott D R. The inheritance of rust resistance. VI. The transferof stem rust resistance from Agropyron elongatum to common wheat. CanadianJournal of Plant Science, 1961,41 :108-123.，公众可从哈尔滨师范大学获得)、“中国春”-长穗偃麦 草7E 二体附加系的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果如图2所示，其中，1.为柱穗山羊草；2.为“中国春”-杀配子染色体2C 二体 附加系；3.为“中国春”;4.为Marker :DL2000 ；5.为二倍体长穗偃麦草；6.为“中国春”-长 穗偃麦草7E 二体附加系。从图中看出，在“中国春””-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗 山羊草材料中均得到586bp的片段，而在“中国春”、二倍体长穗偃麦草、“中国春”-长穗偃 麦草7E 二体附加系中没有此片段。测序两个586bp的片段，结果为该片段均为具有序列表 序列2自5’末端第405-990位核苷酸，表明该片段为杀配子染色体2C所特有。实施例2、山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR标记的应用用SCAR引物2C-F586、2C-R5a;对“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国 春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交后代F1和F1自交得到的F2代进行了鉴定。以普通 小麦“中国春”为对照。结果如图3所示，1.为普通小麦“中国春”;2-12.为“中国春”-长穗偃麦草7E 二体 附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代；13.为DL2000Marker ； 14 25.为F1代自交获得的F2代。从图中看出，在&代材料中均扩增出了 586bp的产物，符合理论预期，经过测序为 该片段具有序列表序列2自5’末端第405-990位核苷酸，为杀配子染色体2C所特有,F1代 均表现为阳性结果。而在115株F2代材料中扩增结果出现分离现象，其中有65株F2材料中有扩增出 产物，说明在这些材料中存在2C染色体，占整个F2代材料的56. 52%，其余50株材料中没 有扩增产物，说明这些材料中没有2C染色体，占整个F2代材料的43. 48% (杀配子染色体 2C是一种可以诱导染色体产生畸变的特殊染色体，它可以使不含有它的配子产生致死或半 致死的效应，半致死的效应就包括如染色体的易位、缺失等染色体畸变，达到要创制易位系 或缺失系的目的，这是一种诱导染色体产生畸变的一种方式，但2C产生的这些畸变行为完 全是随机的。在F2代中，理论上存在2C染色体的几率为75%，但在实际的杂交后代中经检 验，实际情况往往低于理论值，因为2C染色体的杀配子作用，可能会使一些后代产生致死 效应，所以，一般情况下，实际值要低于理论值，实验结果是在实际情况范围内的。)；进一步 证明了此SCAR标记可以用来检测小麦背景下的杀配子染色体2C，为小麦背景中杀配子染 色体2C的快速跟踪检测提供了新途径。
权利要求
1.一种检测植物杀配子染色体2C的试剂盒，包括如下引物对所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条 引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述植物为含有杀配子染色体2C的小麦属植物，所述含有杀配子染色体2C的小麦属 植物具体为“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附 加系杂交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
3.一种检测植物杀配子染色体2C的PCR试剂，由如下引物对、dNTP、氯化镁、DNA聚合 酶和PCR缓冲液组成所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条 引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于所述引物对中各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0. 5μΜ ；所述dNTP在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR试剂中 的浓度为0. 06U/y 1 ；所述氯化镁在所述的PCR试剂中的浓度为0. 18mM ；所述植物为含有杀配子染色体2C的小麦属植物。
5.根据权利要求3或4所述的PCR试剂，其特征在于所述含有杀配子染色体2C的小麦属植物为“中国春”-长穗偃麦草7Ε二体附加系与“中 国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交得到的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
6.权利要求1或2所述试剂盒或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂在检测小麦杀配 子染色体2C中的应用。
7.一种辅助检测待测植物中是否含有杀配子染色体2C的方法，包括如下步骤用权利 要求1或2所述试剂盒中的引物对或权利要求3或4中所述的PCR试剂对待测植物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物中含有大小为 586bp，则所述待测植物中候选含有杀配子染色体2C，若所述PCR扩增产物中不含有大小为 586bp的片段，则所述待测植物中候选不含有杀配子染色体2C。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，以待测植物的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为53°C。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物的核苷酸序列为序列表序列2自5’末端第405-990位核苷酸。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR标记。本发明提供了一种检测植物杀配子染色体2C的试剂盒，所述引物对中的一条引物为序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物对中的另一条引物为序列表中的序列4所示的核苷酸。杀配子染色体2C是诱导易位系的一种有效方式，通过它可以将许多作物的优良性状导入小麦，以改良小麦的品质。通过本发明的实验证明，该SCAR标记的开发对于鉴定普通小麦中导入的杀配子染色体2C是极其有价值的，大量杂交后代的筛选和鉴定工作非常繁杂，杀配子染色体2C分子标记的开发为跟踪鉴定普通小麦-杀配子染色体2C的后代提供了十分方便快捷的途径，也为杂种后代染色体构型的分析奠定了良好的基础。
文档编号C12Q1/68GK102146444SQ201110002658
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者丛雯雯, 徐国辉, 束永俊, 郭东林, 郭长虹 申请人:哈尔滨师范大学