染色体分子标记及用途
【专利摘要】本发明属于作物分子遗传育种领域，具体涉及希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记的建立，12个新标记的序列如序列表中序列1-24所示。还涉及这些分子标记在跟踪检测小麦背景中希尔斯山羊草染色体方面的应用。分子标记筛选与鉴定杂交后代的结果与基因组原位杂交结果一致性为100%，因此，本发明获得的特异分子标记不仅可用于杂交群体的筛选与鉴定，还可以用于辅助选育籽粒微量元素高且抗小麦白粉病的小麦新品系/品种。
【专利说明】基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2SS染色体分子 标记及用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物分子遗传育种领域，具体涉及利用小麦和水稻EST序列来建立 的希尔斯山羊草2^染色体分子标记的内容，还涉及这些分子标记在跟踪检测小麦背景中 希尔斯山羊草染色体方面的应用。
【背景技术】
[0002] 六倍体小麦（friiicw? aesiira? L.，2n=42,基因组AABBDD)是世界最主要的粮 食作物之一。提高小麦产量和改良其品质是小麦育种的重要内容，然而，二者均受到生物或 非生物胁迫的影响。小麦远源物种中含有丰富的可以应用于小麦育种的优异农艺性状基 因。远缘杂交可以将来自小麦外源物种的优异基因导入小麦，相应基因的导入可以大大改 良小麦对生物或非生物胁迫的抗性。小麦的远源物种黑麦（fecah cereal 2n=14,基因组 RR)是在小麦育种中应用最为成功的范例之一。导入栽培小麦的小麦-黑麦IRS. IBL易位 系因为含有抗小麦条锈病基因久抗叶锈病基因 ΖΠ 、抗杆锈病基因和抗白粉病基 因 /--大大提高了我国小麦产量和抗性，因此，受到了育种家们的普遍青睐。据报道，我国 约有70%的小麦品种含有该易位系。由于长期的品种间杂交选育导致我国小麦品种抗源日 趋单一化和遗传变异范围缩小，从而使小麦群体遗传多样性丧失并且使得各种病害加重。 此外，由于强毒性致病生理小种及其变种的产生与流行，使得包括/^9、7r7-7r< 7r久 辟P 在内的白粉病、条锈病和杆锈病等抗性基因的抗性丧失。2014年， 我国约有1. 3亿亩小麦感染纹枯病，I. 0亿亩小麦感染小麦白粉病，3000万亩小麦感染条锈 病，导致小麦大面积减产造成直接经济损失达上百亿元人民币。所以，加强对不同小麦远源 物种中抗性基因的挖掘并应用小麦育种工作中进行可持续抗源多样化育种工作对我国粮 食安全具有重要意义。
[0003] 希尔斯山羊草（2n=14，基因组SsSs),是小麦的远源物种，高抗小麦叶锈病和白粉 病、高抗小麦杆锈病和禾谷类二叉蚜、对干旱和盐胁迫也有较好的抗性。因此，该种质中 的优异基因值得进一步向小麦转移。Friebe等（Friebe B, Tuleen NA, and Gill BS. Standard karyotype of Triticum searsii and its relationship with other S-genome species and common wheat. Theor Appl Genet, 1995，91(2) :248-254.)鉴定了一整 套中国春-希尔斯山羊草附加系，为定位优异基因在染色体上的位置提供了研究材料。 以这套附加系为工具，Garg 等（Garg M，Tanaka H，Ishikawa N，Takata K，Yanaka Mj Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry，2009，86:26-321.)将显 著提高小麦品质的相关基因定位在希尔斯山羊草ISs染色体上；Buloichik等（Buloichik AA j Borzyak VSj Voluevich EA. Influence of alien chromosomes on the resistance of soft wheat to biotrophic fungal pathogens. Cytol Genet， 2008， 42:9-15.)将 抗小麦白粉病基因定位在2SS染色体上；Wang等（Wang SW，Yin LN，Tanaka H，Tanaka K, Tsujimoto Η. Vheat-Aegilops chromosome addition lines showing high iron and zinc contents in grains. Breeding Sci, 2011, 61: 189-195.)将显著提高小麦杆粒 铁和锌元素的基因定位在ISs和253染色体上；Liu等（Liu WX, JinY, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.)将抗小麦杆镑病 基因定位在3SS染色体上。
[0004] 小麦-外源物种附加系中除了含有小麦育种需要的优异基因外，还含有一些控 制不利农艺性状的基因，因此，需要利用染色体工程方法将其诱导后才能应用于小麦育种 工作。到目前为止，中国春-希尔斯山羊草3S S附加系已经被成功改造 （Liu WX，Jin Y， Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.), 而2SS附加系尚未被利用染色体工程方法诱导。基于此，我们开展该项工作。诱导群体的 筛选与鉴定需要分子标记的辅助进行，因此，希尔斯山羊草2S S染色体特异标记的建立对 该工作的顺利开展起着重要作用。到目前为止，Sun等（Sun X，Hu SL，Liu X，Qian WQ， Hao ST, Zhang AM, Wang Dff. Characterization of the HMW glutenin subunits from Aegilops searsii and identification of a novel variant HMW glutenin subunit. Theor Appl Genet, 2006，113:631-641.)和 Garg 等（Garg M, Tanaka H, Ishikawa N， Takata K, Yanaka M, Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009, 86:26-321.)均建立了希尔斯山羊草ISs的种子蛋白标记。Liu等（Liu WX, Jin Y, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.)建 立了希尔斯山羊草3SS染色体的EST-STS标记，用这些标记鉴定了小麦-希尔斯山羊草易 位系并定位了来自希尔斯山羊草上的抗小麦杆锈病基因。然而，能用于快速简便实用的检 测小麦背景中希尔斯山羊草2S S的PCR标记未见报道。
[0005] 目前，尚未发现有关希尔斯山羊草基因组序列信息的报道，而小麦、水稻和包括希 尔斯山羊草在内的小麦远源物种的基因具有较好的共线性，并且不同物种基因的内含子区 域含有丰富的序列变异，因此，可以利用现有的小麦和水稻EST序列来设计引物，进而对希 尔斯山羊草和小麦基因组DNA进行扩增并对其扩增产物进行酶切，以此来建立希尔斯山羊 草染色体特异分子标记。希尔斯山羊草2S S染色体导入小麦能显著提高小麦籽粒铁锌含 量，并且可以改良小麦白粉病抗性，因此，利用小麦和水稻EST序列来建立小麦背景中希尔 斯山羊草2S S染色体分子标记，对快速选育抗小麦白粉病、高铁和锌含量的小麦品种，具有 很重要的实际意义。
【发明内容】
[0006] 为了解决以上现有技术中没有希尔斯山羊草2^染色体的PCR标记的问题，本发 明提供了一种能够快捷、有效、简便地鉴定待测样本中是否含有希尔斯山羊草2^染色体的 方法。本发明的目的是建立希尔斯山羊草2SS染色体特异分子标记，并将建立的分子标记 应用于小麦-希尔斯山羊草杂交后代的筛选工作。
[0007] 本发明还提供了所述希尔斯山羊草2SS染色体分子标记在杂交种质筛选与鉴定中 的应用。
[0008] 本发明是通过以下措施得到的： 本发明所建立的希尔斯山羊草2SS染色体分子标记是MAG3253-EST-SSR、 MAG3930-EST-SSR、BE444521-EST-STS、TNACl 137-PLUG、TNACl 139-PLUG、TNAC1210-PLUG、 MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、C0S40、C0S65 和 C0S70,其序列和 扩增特异片段长度如表3所示。本发明所提供的检测小麦背景中希尔斯山羊草2SS染色体 的新方法，是以待测希尔斯山羊草、小麦-希尔斯山羊草附加系及小麦对照(表1)基因组总 DNA为模板，对EST-STS、EST-STS、COS和PLUG引物进行筛选，筛选出能在希尔斯山羊草和 小麦-希尔斯山羊草2S S附加系中扩增出特异DNA条带的引物，引物筛选的统计结果见表 2。再用筛选出的引物对小麦-希尔斯山羊草ISISs附加系进行扩增，确证相应特异DNA条 带仅小麦-希尔斯山羊草加系能扩增出而其他6个附加系（IS s、3Ss-7Ss)和小麦对照 (表1)不能扩增出，确证相应DNA条带为希尔斯山羊草2SS染色体特有。进而，利用这些引 物再对2S sS和2SSL端体附加系进行PCR扩增，将这些DNA片段定位在2SsS或2S SL染色体 臂上。各引物检测特异扩增产物长度如表3所示。
[0009] 一种基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2SS染色体分子标记， 短臂引物对碱基序列如下： MAG3253-EST-SSR ： F :5' - CTGCTGCTTGGGATCATTCT-3'，（见序列表中序列 1) R: :5' - GCTGGTGAGAGTTGGAAACC-3'，（见序列表中序列 2) MAG3930-EST-SSR ： F :5' - CCTCCAAAGAGAAGCCATGA-3'，（见序列表中序列 3) R: :5' - ATGCCCTTGAGGACGAACT-3'，（见序列表中序列 4) 长臂引物对碱基序列如下： BE44452I-EST-STS ： F :5' -CCAATGACTGGCATGTGAAG-3'，（见序列表中序列 5) R :5' -CTTCGGATCGAGACACTTCC-3'，（见序列表中序列 6) TNACl137-PLUG ： F :5' -GCTGAATCACTCAACCATTCC-3'，（见序列表中序列 7) R :5' -TGCTCGCGCTCTACTTCAC-3'，（见序列表中序列 8) TNACl139-PLUG ： F :5' -ATGTTGTCCATGCCTCCACTT-3'，（见序列表中序列 9) R :5' -:CTGGAATTCTCCGTCTGCTTA-3'，（见序列表中序列 10) TNACl210-PLUG ： F :5' -TTGTGACTGACAGCAACATCC-3'，（见序列表中序列 11) R :5' -AGAGCTTGGCCTTCTCTTCC-3'，（见序列表中序列 12) MAG4271-EST-SSR ： F :5' - CTGCTGTTAAGGCAAGCACA-3'，（见序列表中序列 13) R :5' -TACCTCCCCCAATACGTGTC-3'，（见序列表中序列 14) MAG3512-EST-SSR ： F :5' -ACGCAAAGCCCAAATACATC-3'，（见序列表中序列 15) R :5' -CAGGCTCCTCCTCTACGTCA-3'，（见序列表中序列 16) MAG3798-EST-SSR ： F :5' -ATTGCGAGACGGATAACGAA-3'，（见序列表中序列 17) R :5' -GCTTACGAGCGAACATCAGG-3'，（见序列表中序列 18) C0S40 ： F :5' -GTGCTGCTGCCATTACTTTAG-3'，（见序列表中序列 19) R :5' -AGCAGCAGCCAATTGAAG-3'，（见序列表中序列 20) COS65 ： F :5' -GTGAGGATTCCTGATTGTGG-3'，（见序列表中序列 21) R :5' -ACGGTTAACACGAAGAATCG-3'，（见序列表中序列 22) C0S70 ： F :5' -AACCTTCTGTTTTGGAGGTTC-3'，（见序列表中序列 23) R :5' -TGGTAAAAAGCCCAGCTTC-3'，（见序列表中序列 24) 希尔斯山羊草2^染色体分子标记为上述12对引物中的一对以上的组合或者一对以 上的短臂引物对与一对以上的长臂引物对的组合。
[0010] 所述的希尔斯山羊草2^染色体分子标记的应用，使用所述的希尔斯山羊草253染 色体分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草2SS染色体进行检测或 辅助检测。
[0011] 所述的应用，优选检测或辅助检测步骤如下： (1) 以待测的可能含有希尔斯山羊草2^染色体或染色体片段的小麦背景系的基因组 总DNA为模板，用权利要求1所述的希尔斯山羊草2S S染色体特异分子标记分别对模板和 对照进行PCR扩增，扩增结果使用凝胶电泳进行检测； (2) 如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系 的基因组中含有希尔斯山羊草2^染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有 特异DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有希尔斯山羊草2^染色体。
[0012] 所述的应用，优选步骤（1)中使用希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加 系为阳性对照，以中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系为阴性对照。
[0013] 其中，EST-STS、COS和PLUG引物扩增反应体系为15 μ L，包括25 ng/μ L的模 板 DNA 1 μ L，5 U/μ L Ti^DNA polymerase (申能博彩公司）0.15 μ L，200 yi^AdNTPs (博奥公司），含Mg2+的IOX PCRbuffer 1.5 yL (申能博彩公司），10 μ M的上、下游引物 各I UL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至ISyL15PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪上进行， 扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94 °C变性45 S，57 °C退火45 S，72 °C 延伸2 min，最后72 °C延伸10 min，4 °C保存。而EST-SSR引物扩增体系和上述扩增体系 一致，仅需要把退火温度调整为52 °C。
[0014] EST-SSR和COS引物扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液 为1XTBE。取15yL扩增产物，加入3yL指示剂(含0· 1%溴酚蓝和0· 1%二甲苯青)，混 匀，上样量3 μ L，180V恒定电压电泳约55min。经硝酸银染色30 min后观察照相。PLUG 和EST-STS引物的扩增产物进行2%的琼脂凝胶上电泳，电泳缓冲液为1XTAE。扩增产物 IOul在150V恒压下电泳约25min，然后用lug/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在 ⑶S-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。
[0015] 本发明的有益效果： (1) 本发明利用小麦和水稻EST序列建立了希尔斯山羊草2SS染色体的新标记，拓宽了 小麦和水稻EST序列的使用范围，提供了检测小麦背景中希尔斯山羊草2S S染色体的新方 法； (2) 本发明的希尔斯山羊草2^染色体特异标记引物序列位于小麦和水稻各FL (Fragment Length)区段，根据比较基因组学原理，这些标记也位于2SS染色体各FL区段， 因此可以综合利用这些标记鉴定涉及2S S染色体易位断点的材料； (3) 本发明的特异性分子标记，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草2SS染色体进行检 测或辅助检测，特异性强，检测准确率高，提高筛选效率，对辅助选育籽粒微量元素（Fe和 Zn)高且抗小麦白粉病的小麦新品系/品种具有积极的产业化价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1.引物MAG3253扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为 引物MAG3253对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵 阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3253对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS 附加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3253对中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中 国春-希尔斯山羊草2S S短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图2.引物MAG3930扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 MAG3930对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3930对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加 系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3930对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国 春-希尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图3.引物BE444521扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 BE444521对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳 11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物BE444521对中国春-希尔斯山羊草1SS-7SS 附加系和中国春的扩增结果，C图为引物BE444521对中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、 中国春-希尔斯山羊草2S S短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图4.引物TNACl 137扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 TNAC1137对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳 11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物TNAC1137对中国春-希尔斯山羊草1SS-7SS 附加系和中国春的扩增结果，C图为引物TNAC1137对中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、 中国春-希尔斯山羊草2S S短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图5.引物TNAC1139扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 TNAC1139对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳 11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物TNAC1139对中国春-希尔斯山羊草1SS-7SS 附加系和中国春的扩增结果，C图为引物TNAC1139对中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、 中国春-希尔斯山羊草2S S短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图6.引物TNAC1210扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 TNAC1210对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳 11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物TNAC1210对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS 附加系和中国春的扩增结果，C图为引物TNAC1210对中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、 中国春-希尔斯山羊草2S S短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图7.引物MAG4271扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 MAG4271对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG4271对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加 系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG4271对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国 春-希尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图8.引物MAG3512扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 MAG3512对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3512对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加 系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3512对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国 春-希尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图9.引物MAG3798扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 MAG3798对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3798对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加 系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3798对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国 春-希尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图10.引物C0S40扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 C0S40对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物C0S40对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加系 和中国春的扩增结果，C图为引物C0S40对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国春-希 尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图11.引物COS65扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 COS65对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物COS65对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加系 和中国春的扩增结果，C图为引物COS65对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国春-希 尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图12.引物C0S70扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物 C0S70对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、 绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物C0S70对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加系 和中国春的扩增结果，C图为引物C0S70对中国春-希尔斯山羊草2S S附加系、中国春-希 尔斯山羊草2SS短臂和2S s长臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图13为引物MAG3253对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图14.引物MAG3930对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图15.引物BE444521对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图16.引物TNAC1137对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图17.引物TNAC1139对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图18.引物TNAC1210对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图19.引物MAG4271对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图20.引物MAG3512对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图21.引物MAG3798对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中 国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图22.引物C0S40对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中国 春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图23.引物COS65对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中国 春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图24.引物C0S70对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2SS附加系、中国春、中国 春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图； 图25.基因组原位杂交鉴定分子标记鉴定出的部分中国春2B缺体和中国春-希尔斯 山羊草2SS附加系的部分杂交F 2分离群体的杂交图谱，其中，图A、B、C分别为杂交后代植 株AS-17、AS-96和AS-185的基因组原位杂交结果。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0018] 下述实施例中，如无特殊说明，所用PCR体系方法与
【发明内容】
部分的描述的PCR体 系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。所用TA编号的实验材料(表1) 全部由美国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心Gill BS教授惠赠，公众可从美 国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心（http://www. k-state. edu/wgrc/)有偿 获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0019] 下述实施例中的绵阳11小麦（MYll)和中国春（CS) (Liu C，Yang ZJ，Li GR， Zeng ZXj Zhang Yj Zhou JPj Liu ZHj Ren ZL 2008. Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background. Euphytica，159(1-2): 249-258·);绵阳 15 (MY15) (Zhou JP， Zhang HY，Yang ZJ，Li GR，Hu LJ，Lei MP，Liu C，Zhang Y，Zhang Y，Ren ZL 2012. Characterization of a new T2DS. 2DL-?R translocation triticale ZH-I with multiple resistances to diseases. Genet Resour Crop Evol，59(6):1161-1168.)由 电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供，公众可从山东省农业科学院作物所 获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。AeSe-I- AeSe-192为中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2SS附加系杂交F 2群体。
[0020] 表1.供试材料
【权利要求】
1. 一种基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2S 3染色体分子标记，其特征在于 短臂引物对碱基序列如下： MAG3253-EST-SSR ： F :5' - CTGCTGCTTGGGATCATTCT-3'， R: :5, - GCTGGTGAGAGTTGGAAACC-3，， MAG3930-EST-SSR ： F :5, - CCTCCAAAGAGAAGCCATGA-3，， R: :5' - ATGCCCTTGAGGACGAACT-3'， 长臂引物对碱基序列如下： BE444521-EST-STS ： F :5' -CCAATGACTGGCATGTGAAG-3'， R :5' -CTTCGGATCGAGACACTTCC-3'， TNAC1137-PLUG ： F :5, -GCTGAATCACTCAACCATTCC-3，， R :5' -TGCTCGCGCTCTACTTCAC-3'， TNAC1139-PLUG ： F :5' -ATGTTGTCCATGCCTCCACTT-3'， R :5' -:CTGGAATTCTCCGTCTGCTTA-3'， TNAC1210-PLUG ： F :5' -TTGTGACTGACAGCAACATCC-3'， R :5' -AGAGCTTGGCCTTCTCTTCC-3'， MAG4271-EST-SSR ： F :5, - CTGCTGTTAAGGCAAGCACA-3，， R :5' -TACCTCCCCCAATACGTGTC-3'， MAG3512-EST-SSR ： F :5' -ACGCAAAGCCCAAATACATC-3'， R :5' -CAGGCTCCTCCTCTACGTCA-3'， MAG3798-EST-SSR ： F :5, -ATTGCGAGACGGATAACGAA-3，， R :5, -GCTTACGAGCGAACATCAGG-3，， C0S40 ： F :5' -GTGCTGCTGCCATTACTTTAG-3'， R :5, -AGCAGCAGCCAATTGAAG-3，， C0S65 ： F :5' -GTGAGGATTCCTGATTGTGG-3'， R :5, -ACGGTTAACACGAAGAATCG-3，， C0S70 ： F :5' -AACCTTCTGTTTTGGAGGTTC-3'， R :5, -TGGTAAAAAGCCCAGCTTC-3，， 希尔斯山羊草2^染色体分子标记为上述12对引物中的一对以上的组合或者一对以 上的短臂引物对与一对以上的长臂引物对的组合。
2. -种权利要求1所述的希尔斯山羊草2S 3染色体分子标记的应用，其特征在于使用 权利要求1所述的希尔斯山羊草2SS染色体分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含 有希尔斯山羊草2^染色体进行检测或辅助检测。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测或辅助检测步骤如下： (1) 以待测的可能含有希尔斯山羊草2^染色体或染色体片段的小麦背景系的基因组 总DNA为模板，用权利要求1所述的希尔斯山羊草2SS染色体特异分子标记分别对模板和 对照进行PCR扩增，扩增结果使用凝胶电泳进行检测； (2) 如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系 的基因组中含有希尔斯山羊草2^染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有 特异DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有希尔斯山羊草2^染色体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1)中使用希尔斯山羊草、中国春-希 尔斯山羊草2SS附加系为阳性对照，以中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系为阴性 对照。
5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于引物BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、 TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、C0S40、C0S65 和 C0S70 扩增 15 ii L PCR 反应体系为： 25 ng/u L 的模板 DNA 1 u L, 5 U/ u L Ta^DNA polymerase 0. 15iiL,200 u M 的 dNTPs，含Mg2+的10X PCRbuffer 1.5 iiL，10iiM的上、下游引物各1 iiL，用无菌双蒸馏 水补充反应体系至15 yL; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94 °C变性45 S，57 °C退火 45 S，72 °C延伸 2 min，最后 72 °C延伸 10 min，4 °C保存。
6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、 MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR 和 MAG3798-EST-SSR 扩增 15 ii L PCR 反应体系为： 25 ng/u L 的模板 DNA 1 u L, 5 U/ u L Ta^DNA polymerase 0. 15iiL,200 u M 的 dNTPs，含Mg2+的10X PCRbuffer 1.5 iiL，10iiM的上、下游引物各1 iiL，用无菌双蒸馏 水补充反应体系至15 yL; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94 °C变性45 S，52°C退火 45 S，72 °C延伸 2 min，最后 72 °C延伸 10 min，4 °C保存。
7. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、 MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、C0S40、C0S65 和 C0S70 引物 扩增产物进行8 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色；BE444521-EST-STS、 TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG和TNAC1210-PLUG引物的扩增产物进行2%的琼脂让凝胶 电泳，然后用lug/mL的溴化乙锭溶液进行染色。
【文档编号】C12Q1/68GK104498483SQ201410716282
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】刘成, 宫文英, 刘建军, 李根英, 宋健民, 李豪圣, 刘爱峰, 曹新有, 程敦公, 王灿国, 赵振东 申请人:山东省农业科学院作物研究所