专利名称：一种寡糖Globotriose的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种寡糖的制备方法，特别涉及一种利用α-半乳糖苷酶合成寡糖 Globotriose的方法，属于寡糖合成技术领域。
背景技术：
红细胞血型抗原pk((ib3Cer)是一种广泛存在于人体细胞表面的重要糖脂，由 Globotriose糖基配体和神经酰胺构成。一些肠道致病菌如志贺氏菌等可以合成志贺毒素， 并通过毒素与Globotriose特异性结合来识别(A3Cer,入侵人体细胞。一旦毒素进入细胞内循环，将引发一系列临床综合症状，包括溶血尿毒症综合征，多器官功能衰竭等，严重则导致死亡。如果能阻止毒素和(^b3Cer糖基配体的结合，则可以阻止志贺菌入侵细胞。研究发现，单个Globotriose分子对志贺毒素中和能力较弱，而Globotriose聚合分子对志贺毒素表现出了高度的亲和力，可以在毒素进入细胞前中和毒素，使得志贺菌无法与细胞表面 Gb3Cer的糖基配体接合，无法入侵细胞，从而有效防治该类病菌。Globotriose聚合分子已经在基础研究和临床治疗中得到广泛应用，其获得一般需要单个Globotriose分子作为前体物质。Globotriose 是一种中性三糖，化学结构为 Gal α (1 — 4)Gal β (1 — 4)Glc，目前的合成方法主要有三种化学合成、糖基转移酶合成和工程微生物代谢生产。化学合成方法需要反复的添加保护基团和脱保护基团，合成步骤繁琐，得率也较低，而且(^al-α -糖苷键的形成难以控制，该方法难以大规模应用。糖基转移酶可以催化一步转糖基反应特异性合成Globotriose，但它需要昂贵的UDP活化的糖苷作为底物，成本很高。工程微生物代谢生产是利用基因工程对细胞的糖合成和糖代谢途径进行改造，利用这种重组细胞来合成相应的糖苷化合物。通过将合成UDP糖苷的一系列酶和fell α 1，4糖基转移酶重组至细胞， 使重组细胞可以利用低成本底物如乳清酸、果糖和乳糖等合成Globotriose，但细胞内多个酶的连续反应不容易控制，而且合成的产物Globotriose在转运出细胞方面的困难也难以解决，这些限制了它的大规模应用。由于现有的合成方法均存在局限性，使得Globotriose 的商品价格一直非常昂贵，迫切需要寻找新的经济有效的合成方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种寡糖Globotriose的制备方法。发明概述本发明的技术要点是利用α -半乳糖苷酶以对硝基苯_α -D-半乳糖苷为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应合成寡糖Globotriose。发明详述术语解释活力单位⑶取酶液30μ 1，加2mM对硝基苯-α-半乳糖苷溶液150μ 1(ρΗ 5.5、 50mM醋酸缓冲液配制)，37°C反应lOmin，加入1. 05ml,0. 2M、pH 10. 5硼酸缓冲液终止反应，测0D400。以每分钟水解对硝基苯-α -D-半乳糖苷底物释放1 μ M硝基苯酚的酶量为1个酶活单位⑶。一种寡糖Globotriose的制备方法，步骤如下(1)分别用磷酸缓冲液配制浓度为0. IM的对硝基苯-a -D-半乳糖苷溶液、浓度为 0. IM 0. 5Μ的乳糖溶液和浓度为5 20U/ml的α -半乳糖苷酶溶液；(2)将步骤(1)制得的对硝基苯-a-D-半乳糖苷溶液、乳糖溶液和α -半乳糖苷酶溶液按体积比1 1 8的比例混合，37°C水浴中反应1 5小时，100°C煮沸，得 Globotriose 反应液 I ；(3)将步骤(2)制得的Globotriose反应液I用等体积的乙酸乙酯萃取1 2次， 收集下层水溶液，在35°C 45°C的条件下旋转蒸发30分钟去除乙酸乙酯，得去除对硝基苯酚的Globotriose反应液II ；(4)将步骤(3)制得的Globotriose反应液II按照6 8%质量体积比的接种量加入酵母菌细胞，在观 30°C、150 180转/分培养M 36小时，离心，取上清，得去除对硝基苯酚、半乳糖和乳糖的Globotriose反应液III ；(5)将步骤(4)制得的Globotriose反应液III按每毫升反应液1_2毫克的用量加入活性炭，室温搅拌1小时，0. 4 μ m的滤膜过滤，去上清，然后加入与Globotriose反应液 III等体积的3% (质量百分比)乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μπι的滤膜过滤，去上清， 再按反应液III 二分之一体积加入20% (质量百分比)乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μπι 的滤膜过滤，收集上清，冷冻干燥，即得寡糖Globotriose产品。所述步骤(1)中的α-半乳糖苷酶溶液由具有α (1 — 4)糖苷键合成活性的 α-半乳糖苷酶配制。上述α -半乳糖苷酶选用专利ZL200510044898. 3所述基因序列或GenBank登录号为AF406640的基因序列按照专利ZL200510044898. 3所述方法制得。所述步骤(1)中的磷酸缓冲液浓度为0. 05Μ 0. 5Μ，ρΗ值为5. 5 8. 0 ；优选的， 所述步骤(1)中的磷酸缓冲液是浓度为0. 05Μ的磷酸钠缓冲液，PH值为8. 0。所述步骤(1) 中的乳糖溶液浓度为0. 5Μ。所述步骤O)中100°C煮沸后，还包括12000转/分离心10分钟的离心步骤。所述步骤中的酵母菌细胞通过如下方法制得采用YPD培养基培养乳酸克鲁维酵母细胞，该菌株在美国标准菌种收藏所编号为ATCC N0. 8563，在培养30 40小时，12000转/分离心3 10分钟，即得。上述YPD培养基组分如下，均为重量百分数2%葡萄糖，2%蛋白胨，酵母粉， PH自然。本发明提供了一种经济有效的利用糖苷酶合成Globotriose的方法，所采用的 α -半乳糖苷酶催化合成Globotriose的反应避免了化学合成中基团保护和脱保护，条件温和，工艺简单，易于操作，更重要的是该酶所用到的底物便宜，来源广泛，容易获取，大大降低了酶法合成Globotriose的生产成本，适合于Globotriose的大规模合成，具有潜在的应用前景。
图1为本发明采用的糖苷酶法合成Globotriose的反应示意图；其中，1、乳糖；2、对硝基苯-α -D-半乳糖苷；3、α -半乳糖苷酶；4、对硝基苯酚； 5、Globotriose0图2为α -半乳糖苷酶以乳糖为受体合成产物的质谱图。图3为α -半乳糖苷酶以乳糖为受体合成产物的GC图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例中所述乳酸克鲁维酵母购自美国标准菌种收藏所，菌种编号为ATCC NO. 8563。实施例1一种寡糖Globotriose的制备方法，步骤如下1. α-半乳糖苷酶的制备按专利ZL200510044898. 3所述方法制备α -半乳糖苷酶。2. α -半乳糖苷酶催化合成寡糖Globotriose测定上述α -半乳糖苷酶酶液以对硝基苯-α _D_半乳糖苷为底物的酶活，用 pH8. 0、50mM磷酸钠缓冲液将其稀释到10U/ml。用pH8. 0、50mM磷酸钠缓冲液配制0. IM的对硝基苯-α -D-半乳糖苷溶液和0. 5Μ的乳糖溶液。取10U/ml的酶液5ml，0. IM的对硝基苯- a -D-半乳糖苷溶液5ml, 0. 5M的乳糖40ml，在37°C反应3小时后，100°C煮沸10分钟， 终止反应，得Globotriose反应液I。3.寡糖 Globotriose 的纯化用盐酸将获得的50mlGlObOtriOSe反应液I调至pH5. 5，然后转移至250ml的分液漏斗，加入50ml的乙酸乙酯，萃取后收取下层水溶液，在35°C下旋转蒸发30分钟，用NaOH 调整反应液至PH7. 0，然后加入IOOml水将反应液的总糖含量稀释到6 % (质量百分比)，得 Globotriose 反应液 II。将乳酸克鲁维酵母接种至900ml的YPD培养基培养30h，12000转/分离心3 分钟获得6g酵母细胞。将6g酵母细胞加入到上述150naGlObOtriOSe反应液II中，在37°C 处理观小时，12000转/分离心10分钟去掉酵母细胞，收取上清，得Globotriose反应液III。在酵母处理后的150naGlObOtriOSe反应液III中加入200毫克的活性炭颗粒，室温搅拌处理1个小时，用0. 4μπι的滤膜过滤，除去上清。然后向活性炭颗粒中加入150ml 的3%乙醇，室温低速搅拌处理1个小时，用0. 4μπι的滤膜过滤，除去上清。然后向活性炭颗粒中加入75ml的20%乙醇，室温低速搅拌处理1个小时，用0. 4 μ m的滤膜过滤，收集上清。冷冻干燥成白色粉末，即得寡糖Globotriose产品。4.寡糖Globotriose的结构鉴定和含量分析取上述白色粉末用水稀释成质量体积百分比为的溶液，并取Globotriose 的标准品配制成的水溶液，薄层层析板点样，在展层剂(正丁醇无水乙醇水= 5:3:2)中展开，雾喷显色剂(20%硫酸溶液+0.5%的3，5-二羟基甲苯)，于120°C烘烤 5分钟，糖斑点显色后，目标产物的迁移率和Globotriose标准品迁移率一致。
取上述的水溶液进行质谱分析，目标产物的分子离子峰(m/ζΚΜ-ΗΓ为 503. 4 (如图2所示)，判断产物分子量为504，为三糖分子。取1毫克获得的白色粉末，进行甲基化衍生，然后通过红外光谱检测甲基化程度。完全甲基化的样品用浓盐酸进行酸解，之后进行乙酰化。乙酰化完全的样品进行气质 (GC-MS)分析，判断产物糖苷键型和含量。GC-MS中GC分析结果见图3，GC中保留时间为 12. 1 分钟的质谱碎片峰，与文献报道的三糖非还原端1，4连接的半乳糖峰一致，据此判断主要产物为Globotriose。根据GC图谱的峰面积积分结果，Globotriose含量为51. 3%0上述质谱分析所用仪器为API 4000质谱仪，Applied Biosystems MDS kiex(加拿大)；气质分析所用仪器为安捷伦气质联用仪Agilent 5975C (美国)。实施例2如实施例1所述寡糖Globotriose的制备方法，不同之处在于1)利用GenBank登录号为AF406640的基因，按照专利ZL200510044898. 3所述方法制得α-半乳糖苷酶。2)所述的磷酸缓冲液均含有5% (质量百分比)的甘油。
权利要求
1.一种寡糖Globotriose的制备方法，步骤如下(1)分别用磷酸缓冲液配制浓度为0.IM的对硝基苯-a -D-半乳糖苷溶液、浓度为 0. IM 0. 5Μ的乳糖溶液和浓度为5 20U/ml的α -半乳糖苷酶溶液；(2)将步骤(1)制得的对硝基苯-a-D-半乳糖苷溶液、乳糖溶液和α-半乳糖苷酶溶液按体积比1 1 8的比例混合，37°C水浴中反应1 5小时，100°C煮沸，得Globotriose 反应液I ；(3)将步骤(2)制得的Globotriose反应液I用等体积的乙酸乙酯萃取1 2次，收集下层的水溶液，在35°C 45°C的条件下旋转蒸发30分钟去除乙酸乙酯，得Globotriose 反应液II ；(4)将步骤(3)制得的Globotriose反应液II按照6 8%质量体积比的接种量加入酵母菌细胞，在观 30°C、150 180转/分培养M 36小时，离心，取上清，得 Globotriose 反应液 III ；(5)将步骤(4)制得的Globotriose反应液III按每毫升1 2毫克的用量加入活性炭，室温搅拌1小时，0. 4μπι的滤膜过滤，去上清，然后加入与Globotriose反应液III等体积的3% (质量百分比)乙醇重悬，室温搅拌1小时，0.4μπι的滤膜过滤，去上清，再按 Globotriose反应液III的二分之一体积加入20% (质量百分比)乙醇重悬，室温搅拌1 小时，0. 4μ m的滤膜过滤，收集上清，冷冻干燥，即得寡糖Globotriose产品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的α-半乳糖苷酶溶液由具有α (1 — 4)糖苷键合成活性的α -半乳糖苷酶配制。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，α-半乳糖苷酶通过专利 ZL200510044898. 3所述基因序列或GenBank登录号为AF406640的基因序列按照专利 ZL200510044898. 3所述方法制得。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的磷酸缓冲液浓度为 0. 05Μ 0. 5Μ, ρΗ 值为 5. 5 8. O。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的磷酸缓冲液是浓度为 0. 05Μ的磷酸钠缓冲液，ρΗ值为8. O。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的乳糖溶液浓度为 0. 5Μ。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤O)中100°C煮沸后，还包括 12000转/分离心10分钟的离心步骤。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的酵母菌细胞通过如下方法制得采用YPD培养基培养乳酸克鲁维酵母细胞，该菌株在美国标准菌种收藏所编号为=ATCC NO. 8563，在培养30 40小时，12000转/分离心3 10分钟，即得。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，上述YPD培养基组分如下，均为重量百分数2%葡萄糖，2%蛋白胨，酵母粉，ρΗ自然。
全文摘要
本发明涉及一种寡糖的制备方法，特别涉及一种利用α-半乳糖苷酶合成寡糖Globotriose的方法，属于寡糖合成技术领域。本发明利用α-半乳糖苷酶以对硝基苯-α-D-半乳糖苷为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应合成寡糖Globotriose。该方法所需要的底物价格便宜，易于获得，且反应条件温和，操作简便，大大降低了Globotriose的生产成本，适合于Globotriose的大规模合成，具有潜在的应用前景。
文档编号C12P19/14GK102154411SQ201110002979
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者卢丽丽, 张丽丽, 肖敏, 范树泉 申请人:山东大学