一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法
【专利摘要】本发明公开了一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，是将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物。每个双向基因表达载体均包括双向终止子和双向启动子；除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达载体双向终止子的3’末端和下一个双向基因表达载体双向终止子的5’末端具有相同的同源臂，第一个双向基因表达载体双向终止子的5’末端及最后一个双向基因表达载体双向终止子的3’末端均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。通过该方法，建立了一种将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来的新技术。
【专利说明】-种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的 方法。
【背景技术】
[0002] 微生物DNA的改造，包括目标基因的敲除与过表达是基因工程领域的核心内容。 一个或两个基因在目标微生物中的表达通过现有技术不难实现，然而，多基因（两个以上） 的表达依据现有技术尚存在许多难题，如克隆周期长、工作量大、成功率低、基因表达数量 上限低等。尤其是真核生物的基因表达，一般每个基因都需要单独的启动子与终止子，使得 一个基因表达就需要进行3次克隆，若进行多基因表达，如6个基因表达，就需要进行18次 基因克隆，这种情况对于使用传统方法来说很难实现且极为费时。
[0003] 目前，一些新兴的克隆技术，如Gateway重组技术、Gibson组装技术和Golden gate技术等虽然能够在一定程度上提高克隆的效率，但其在应用上也各自存在一定的短板 或限制。更为重要的是，这些新方法只是针对基因克隆这一个技术环节，在序列设计、表达 设计以及转化宿主细胞等方面并未提供任何帮助。因此，需要一种新技术将整个基因表达 过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程有机地组合起来，实现多基因的快速、 高效表达，同时能够降低操作入门门槛，减少培训学习时间，降低操作成本。
[0004] 目前许多涉及基因表达的专利技术或工具载体（质粒）能够实现一到两个基因的 快速表达。但是这些专利中的载体一般是发明人构建好的带有固定启动子或其它转录元 件，只能以固定的强度进行目标基因的表达。而当前基因工程改造工作中经常需要多基因 的协调配合，即需要各基因表达强度依据设计者意愿产生差别，这是现有工具载体或技术 难以实现的，而本技术将解决这一难题。
[0005] 另外，芹菜素具有抗肿瘤、改善心脑供血、抗炎症、降血压、抗焦虑、抗菌抗病毒以 及抗氧化等生理功能。酿酒酵母自身不能产生芹菜素，转化芹菜素合成基因（PAL、C4H、4CL、 CHSXHI及FSII)后即可由苯丙氨酸合成芹菜素。因此，需要一种能够将芹菜素合成基因 快速导入酿酒酵母的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种将多个外源基因同时克隆到 微生物基因组，实现多基因表达及微生物基因改造的方法。
[0007] 本发明提供了一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，包括如下步 骤：将多个外源基因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入 宿主微生物，得到表达多个外源基因的重组微生物；
[0008] 所述每个双向基因表达载体均包括一个双向终止子和一个双向启动子；每个双向 基因表达载体导入两个外源基因；
[0009] 除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因 表达载体的3'末端和下一个双向基因表达载体的5'末端具有相同的同源臂，所述第一个 双向基因表达载体的5'末端具有同源臂甲，所述最后一个双向基因表达载体的3'末端具 有同源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。 [0010] 进一步，所述宿主微生物为酵母；优选为酿酒酵母，更优选为酿酒酵母W303。
[0011] 所述多个外源基因为4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，其基因序列依次如序列 表 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11 所示。
[0012] 所述双向基因表达载体有三个，第一双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID N0:l所示的双向终止子Tl(TPIl-PGIt)，及序列表中SEQIDN0:4所示的双向启动子 P1(TDH3-ADH1);第二双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID N0:2所示的双向终止子 T2(ADHlt-CYClt)，及序列表中SEQ ID N0:5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2);第三双向 基因表达载体包括如序列表中SEQ ID勵:3所示的双向终止子了3&?8八1-切0(：1)，及序列表 中SEQ ID勵:4所示的双向启动子？1〇1)!13-40!11)。
[0013] 其中，第一双向基因表达载体的双向终止子Tl (TPIl-PGIt)，如序列表SEQ ID NO: 1所示，自5'末端第1131位至1180位的核苷酸，与第二双向基因表达载体的双向终止 子T2 (ADHlt-CYClt)，如序列表SEQ ID NO: 2所示，自5'末端第1位至150位的核苷酸均为 同源臂L2。
[0014] 第二双向基因表达载体的双向终止子T2(ADHlt-CYClt)，如序列表SEQ ID N0:2 所示，自5'末端第627位至776位的核苷酸，与第三双向基因表达载体的双向终止子 T3(tFBAl-troCl)，如序列表SEQ ID N0:4所示，自5'末端第1位至150位的核苷酸均为同 源臂L3。
[0015] 所述第一双向基因表达载体还包括所述4CL、CHS基因；所述第二双向基因表达载 体还包括所述CHI、FSII基因；所述第三双向基因表达载体还包括所述PAL、C4H基因。 [0016] 上述方法中，第一双向基因表达载体、第二双向基因表达载体、第三双向基因表达 载体的制备包括以下步骤：
[0017] (1)、合成序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3所示的双向终止 子 Tl (TPII-PGIt)、双向终止子 T2 (ADHlt-CYClt)、双向终止子 T3 (tFBAl-tPDCl)，分别由 1180、776、963个碱基组成；合成序列表中SEQ ID N0:4所示的双向启动子P1(TDH3-ADH1)、 序列表中SEQ ID NO: 5所示的双向启动子P2(PGK1-TEF2)，分别由1418、1312个碱基组成。
[0018] (2)、将双向终止子Tl (TPII-PGIt)、双向终止子T2 (ADHlt-CYClt)、双向终止子 T3 (tFBAl-tPDCl)分别连接在pUC57-Kan质粒上，得到重组表达载体P-Tl (TPIl-PGIt)、 P-T2 (ADHlt-CYClt)、p-T3(tFBAl-tPDCl);将双向启动子 Pl (TDH3-ADH1)、双向启动 子P2 (PGK1-TEF2)连接到PMD18-T质粒上得到重组表达载体PMD-Pl (TDH3-ADH1)、 PMD-P2(PGK1-TEF2)。
[0019] (3)、合成序列表中 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID勵:11所示的4(^、0^、011、？511、？六1^、〇4!1基因，上述基因都来自于菊 科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz，其优化后具有酿酒酵母偏爱密 码子的基因序列，分别由1624、1199、718、1562、2136、2136个碱基组成。
[0020] (4)、以步骤⑵所得的重组表达载体P-Tl (TPIl-PGIt)、p-T3(tFBAl-tPDCl)及宿 主微生物酿酒酵母基因组为模板，构建同源臂甲LU同源臂乙L4,整合位点Sitel、Site2， 标记基因 HIS片段及重叠片段Sitel-His-Ll和Site2-L4。
[0021] (5)、构建第一双向基因表达载体P-Tl (4CL-CHS)、第二双向基因表达载体 P-T2 (CHI-FSII)和第三双向基因表达载体p-T3(PAL-C4H);
[0022] 将双向终止子Tl (TPIl-PGIt)、双向启动子Pl (TDH3-ADH1)和4CL、CHS基因连接 构成第一双向基因表达载体P-Tl (4CL-CHS);
[0023] 将双向终止子T2 (ADHlt-CYClt)、双向启动子P2(PGK1-TEF2)和CHI、FSII基因连 接构成第二双向基因表达载体P-T2 (CHI-FSII);
[0024] 将双向终止子T3(tFBAl-tPDCl)、双向启动子P1(TDH3-ADH1)和PAL、C4H基因连 接构成第三双向基因表达载体P-T3 (PAL-C4H)。
[0025] 进一步，所述三个双向基因表达载体同时导入宿主微生物酿酒酵母《303,得到重 组微生物命名为重组酿酒酵母W303-1。
[0026] 所述重组酿酒酵母W303-1为表达核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:6-ll所示的 DNA片段的重组酿酒酵母。
[0027] 本发明提供了一种在微生物体内将多个外源基因一步整合到基因组上的方法，通 过同源重组的原理，利用双向基因表达载体，将所需要的多个基因表达载体同时导入宿主 细胞中，建立了一种将整个基因表达过程，包括表达设计、克隆设计、宿主细胞改造等过程 有机地组合起来的新技术，实现了多基因的快速、高效表达，避免了多次转化及载体构建所 带来的麻烦。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图 1 为 PUC57-Kan 质粒。
[0029] 图2为重组表达载体P-Tl (TPIl-PGIt)质粒。
[0030] 图3为重组表达载体ρ-Τ2 (ADHlt-CYClt)质粒。
[0031] 图4为重组表达载体ρ-Τ3 (tFBAl-tPDCl)质粒。
[0032] 图 5 为 PMDl8-T 质粒。
[0033] 图6为重组表达载体PMD-Pl (TDH3-ADH1)质粒。
[0034] 图7为重组表达载体PMD-P2 (PGK1-TEF2)质粒。
[0035] 图8为实施例4中同源臂LI、L4,整合位点Sitel、Site2,标记基因 HIS片段PCR 扩增后的琼脂糖凝胶电泳纯化的结果。
[0036] 图9为实施例5中重叠片段Sitel-His-Ll和Site2_L4PCR扩增后的琼脂糖凝胶 电泳结果。
[0037] 图10为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后PAL、C4H基因 PCR扩增后的琼脂糖 凝胶电泳结果。
[0038] 图11为实施例6中引入酶切位点PCR扩增4CL、CHS、CHI、FSII基因的琼脂糖凝 胶电泳结果。
[0039] 图12为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后双向终止子基因 Tl (TPIl-PGIt)、 T2 (ADHlt-CYClt)、T3 (tFBAl-tPDCl)的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0040] 图13为实施例6中引入酶切位点PCR扩增后双向启动子基因 Pl (TDH3-ADH1)、 P2 (PGK1-TEF2)的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0041] 图14为实施例6中大肠杆菌PCR扩增4CL、CHS基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0042] 图15为实施例6中大肠杆菌PCR扩增CHI、FSII基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0043] 图16为实施例6中大肠杆菌PCR扩增PAL、C4H基因的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0044] 图 17 为实施例 6 中扩大培养后 P-Tl (4CL-CHS)、p-T2 (CHI-FSII)、p-T3 (PAL-C4H) 的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0045] 图18为实施例7中PCR扩增后Tl (4CL-CHS)、T2 (CHI-FSII)的琼脂糖凝胶电泳结 果。
[0046] 图19为实施例7中PCR扩增后Τ3 (PAL-C4H)的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0047] 图20为实施例9中重组酿酒酵母W303-1基因组PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果。
【具体实施方式】
[0048] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0049] 实施例1双向终止子、双向启动子的合成
[0050] (1)双向终止子的合成
[0051] 合成序列表中SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID Ν0:3所示的双向终止子 Tl (ΤΡΙ I-PGIt)、双向终止子 Τ2 (ADHlt-CYClt)、双向终止子 Τ3 (tFBAl-tPDCl)，分别由 1180、776、963个碱基组成。其中，第一双向基因表达载体的双向终止子Tl(TPIl-PGIt)In 序列表SEQ ID NO: 1所示，自5'末端第1031位至1180位的核苷酸，与第二双向基因表达 载体的双向终止子T2 (ADHlt-CYClt)，如序列表SEQ ID NO: 2所示，自5'末端第1位至150 位的核苷酸均为同源臂L2。第二双向基因表达载体的双向终止子T2 (ADHlt-CYClt)，如序 列表SEQ ID NO:2所示，自5'末端第627位至776位的核苷酸，与第三双向基因表达载体 的双向终止子T3(tFBAl-troCl)，如序列表SEQ ID N0:4所示，自5'末端第1位至150位的 核苷酸为均同源臂L3。
[0052] (2)双向启动子的合成
[0053] 合成序列表中SEQ ID NO:4所示的双向启动子Pl (TDH3-ADH1)、序列表中SEQ ID NO: 5所示的双向启动子P2 (PGK1-TEF2)，分别由1418、1312个碱基组成。
[0054] 实施例 2 构建 P-Tl(TPIl-PGIt)质粒、ρ-Τ2 (ADHlt-CYClt)质粒、 p-T3(tFBAl-tPDCl)质粒、PMD-Pl (TDH3-ADH1)质粒、PMD-P2(PGK1-TEF2)质粒
[0055] 将双向终止子Tl (TPIl-PGIt)、双向终止子T2 (ADHlt-CYClt)、双向终止子 T3 (tFBAl-tPDCl)分别连接在pUC57-Kan质粒（如图1所示）上，得到重组表达载体 P-Tl (TPI I-PGIt)(如图 2 所示）、ρ-Τ2 (ADHlt-CYClt)(如图 3 所示）、ρ-Τ3 (tFBAl-troCl) (如图4所示）。将双向启动子Pl (TDH3-ADH1)、双向启动子P2 (PGK1-TEF2)连接到 PMD18-T质粒（如图5所示）上得到重组表达载体PMD-Pl (TDH3-ADH1)(如图6所示）、 PMD-P2 (PGK1-TEF2)(如图 7 所示）。
[0056] 实施例3目的基因的合成
[0057]合成序列表中 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11所示的4(^、〇^、〇11、？511、？41^、04!1基因，上述基因都来自于菊科植 物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz，其优化后具有酿酒酵母偏爱密码子 的基因序列，分别由1624、1199、718、1562、2136、2136个碱基组成。
[0058] 实施例4同源臂LI、L4,整合位点Sitel、Site2,标记基因 HIS片段的构建
[0059] ⑴引物设计：
[0060] LI -Fo: 5 ' -TCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGCCCCGGTCCGTTTGTTCTAT-3 '
[0061] LI -Ro: 5 ' -CTCGAGAGGCAATTTTAGAGGGGACTTC-3 '
[0062] L4-Fo: 5，-CCAGACGATACAGAGGCTAAGA-3，；
[0063] L4-Ro: 5 ' -CCACTTTTGTTGGGGACGATTAGGTTCCAACTGCTCTTACTGT-3 '
[0064] Sitel-Fo:5, -GTCGGTCGACTGTGCACAAAGGCCATAATAT-3，
[0065] Sitel-Ro:5' -TCGGAAGAGGTTTTGTCATCCGAAGGCATGAGTTATGGTTGCACA-3'
[0066] Site2-Fo: 5，-TACAGTAAGAGCAGTTGGAACCTAATCGTCCCCAACAAAAGTGGGCT-3'
[0067] Site2-Ro: 5，-AAAGCTGGCTCCCCTTAGACAAATACGCTA-3'
[0068] HI S-Fo: 5，-AACCATAACTCATGCCTTCGGATGACAAAACCTCTTCCGATAAAAACA-3 '
[0069] HI S-Ro: 5，-TAGAACAAACGGACCGGGGCTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGA-3，
[0070] (2) PCR 反应体系：
[0071]
【权利要求】
1. 一种将多个外源基因同时克隆到微生物基因组的方法，其特征在于：将多个外源基 因先导入多个双向基因表达载体，再将多个双向基因表达载体同时导入宿主微生物，得到 表达多个外源基因的重组微生物； 所述每个双向基因表达载体均包括一个双向终止子和一个双向启动子；每个双向基因 表达载体导入两个外源基因； 除第一个双向基因表达载体和最后一个双向基因表达载体外，其他每个双向基因表达 载体的3'末端和下一个双向基因表达载体的5'末端具有相同的同源臂，所述第一个双向 基因表达载体的5'末端具有同源臂甲，所述最后一个双向基因表达载体的3'末端具有同 源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以与宿主微生物的基因组发生同源重组。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主微生物为酵母；优选为酿酒酵母， 更优选为酿酒酵母W303。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双向基因表达载体有三个，第一双向基 因表达载体包括如序列表中SEQ ID N0:1所示的双向终止子T1，及序列表中SEQ ID N0:4 所示的双向启动子PI ;第二双向基因表达载体包括如序列表中SEQ ID N0:2所示的双向终 止子T2,及序列表中SEQ ID N0:5所示的双向启动子P2;第三双向基因表达载体包括如序 列表中SEQ ID N0:3所示的双向终止子T3,及序列表中SEQ ID N0:4所示的双向启动子P1。
4. 如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述多个外源基因为4CL、CHS、 〇11、？511、？41、〇411基因，其基因序列依次如序列表5￡0 10勵:6、5￡0 10勵:7、5￡0 10 N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:lim*。
5. -种DNA片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5的任一项的全部或部分。
6. 携带并表达核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5的任一项所述DNA片段的重组表达载体。
7. 所述权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于： 所述重组表达载体是由序列表中SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所述 DNA片段连接在pUC57-Kan质粒上得到的； 或者，所述重组表达载体是由序列表中SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5所述DNA片段连 接在PMD18-T质粒上得到的。
8. 如权利要求3中所述方法中得到的第一双向基因表达载体或第二双向基因表达载 体或第三双向基因表达载体。
9. 如权利要求1-4中任一项所述方法得到的重组微生物。
【文档编号】C12N15/81GK104404077SQ201410621447
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】江会锋, 阮江星, 丁文涛, 许则滩, 马永硕, 卢丽娜, 董扬, 马延和 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所