兔白介素 1 β重组蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种兔白介素1beta(IL-1β)重组蛋白的制备方法，属于分子生物领域。本发明的制备兔白介素1β的方法，包括以下步骤：1)引物设计：引物序列如SEQ ID NO：2-3所示；2)PCR扩增，获得扩增产物；3)重组质粒的构建；4)蛋白的诱导表达；5)蛋白纯化及蛋白复性。本发明通过基因重组、重组蛋白表达纯化和复性技术获得可溶性兔白介素1β重组蛋白；用重组蛋白免疫母鸡后产生高效价的抗体：血清抗体效价为1：64000，卵黄抗体效价为11.5ng/ml，可见本发明获得的重组蛋白具有理想生物学活性，在国内属首创。
【专利说明】兔白介素1β重组蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种白介素重组蛋白，尤其涉及一种兔白介素1β重组蛋白，属于分 子生物领域。
【背景技术】
[0002]白细胞介素-I(IL-I)，是一种主要由单核细胞、巨噬细胞合成分泌的蛋白质多肽。 人的IL-I相对分子量为15KDa?17KDa，根据其分子结构和等电点的差异，可将其分为两个 分子亚型（IL-1alpha、IL-Ibeta)，这两个亚型之间氨基酸序列有很大差别，但他们可识 别同一个受体IL-1R。
[0003]IL-I具有广泛的免疫调节作用：促进胸腺细胞、T细胞的活化增殖和分化；诱导单 核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNFalpha;协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的增殖和分 化；通过提高NK细胞对IL-2等细胞因子的敏感性增强其杀伤活性；促进IL-2、IL-3、IL-4 等多种免疫分子基因的表达。白介素1β还具有影响消化吸收等功能。
[0004]目前国内对动物细胞因子的研究较少，兔白介素1β尚无人研究，缺乏重组蛋白 产品。兔子是常用的实验动物之一，具有重要的医学价值；由于其重要的临床医学价值，白 介素Ιβ已成为研究热点之一。重组蛋白经常以包涵体形式表达，不能以可溶性蛋白形式 存在，从而降低了其应用价值，而复性技术是亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0005] 本专利根据已发表的兔白介素Ibeta(li3)基因序列，设计针对兔白介素1β基 因的特异引物，通过PCR扩增和基因重组技术，经原核系统表达获得了兔白介素1β重组蛋 白，采用亲和吸附柱纯化技术获得了生物纯兔白介素1β重组蛋白，由于该重组蛋白以包 涵体形式表达，本发明发明出蛋白复性技术将包涵体还原为可溶性蛋白。该兔白介素1β 重组蛋白可以用于相关研究也可作为标准品用于ELISA等酶联免疫分析和疾病诊断，也可 应用于抗体的制备。
[0006] 本发明首先公开了一种制备兔白介素1β重组蛋白的方法，包括以下步骤：
[0007] 1)引物设计：设计并合成扩增兔白介素1β的引物，引物序列如SEQIDNO:2_3 所示；
[0008] 2)PCR扩增：以含有SEQIDNO:1所示基因序列的DNA为模板进行扩增，PCR扩 增程序为：95°C预变性15min;94°C45s，58°C45s，72°C60s，共30个循环；最后72°C延续 lOmin，获得扩增产物；
[0009] 3)重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的 原核表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序；
[0010]4)蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a-rabbitIL-Iβ，转化感 受态细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达；
[0011] 5)蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白 介素1β重组蛋白。
[0012] 优选的，步骤5)所述蛋白纯化具体包括以下步骤：
[0013]Α.包涵体处理：采用裂解液裂解菌体后离心弃上清，采用BufferBl溶解沉淀并 离心，上清含有兔白介素1β包涵体蛋白用于下一步的分离纯化；
[0014]Β.分离纯化：分离纯化采用镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以20ml灭菌水清 洗Ni-NTA预装柱，然后用IOmlBufferB2平衡Ni-NTA预装柱后上样；再用IOmlBuffer B2和20mlWashBuffer清洗Ni-NTA预装柱；最后用IOmlBufferE洗脱Ni-NTA预装柱， 收集洗脱液，获得纯化的兔白介素1β包涵体蛋白；
[0015] C.蛋白复性：将兔白介素1β包涵体蛋白稀释到浓度在0.Iyg/μ 1以下，经TGE 缓冲液透析，浓缩，收集获得复性后的兔白介素1β蛋白。
[0016] 更优的，步骤A所述裂解液的配方为：50mMNaH2P04、300mMNaCUlOmM咪唑、0. 5mM PMSF，pH8.0;所述BufferBI的配方为：100mMNaH2P04、10mMTris、6M盐酸胍，ρΗ8·0。
[0017]更优的，步骤B所述BufferΒ2 的配方为：100mMNaH2P04、10mMTris、8M尿素， ρΗ8· 0 ;所述WashBuffer的配方为：IOOmMNaH2PO4UOmMTris、20mM咪唑、8M尿素，ρΗ8· 0 ; 所述BufferE的配方为：100mMNaH2P04、10mMTris、250mM咪唑、8Μ尿素，ρΗ8· 0。
[0018]更优的，步骤C所述TGE缓冲液的配方为：50mMTris-HCl、50mMNaCl、0. 5mM EDTA、5%甘油、1%甘氨酸、ΙΟπιΜβ-巯基乙醇、0· 5mMPMSF，pH8. 0。
[0019] 对重组蛋白免疫原性进行测定，用重组蛋白免疫母鸡后产生高效价的抗体（血清 抗体效价为1 =64000,卵黄抗体效价为11. 5ng/ml)，表明所获得的重组蛋白具有理想生物 学活性。
[0020] 本发明第二方面公开了一种用于扩增兔白介素1β的引物序列，包括上游引物Fl 和下游引物F2,上游引物Fl的序列如SEQIDNO:2所示，下游引物F2的序列如SEQIDNO: 3所示。
[0021] 进一步的，前述引物扩增的模板为含有SEQIDNO:1所示基因序列的DNA。
[0022] 更进一步的，前述引物扩增的模板为pUC57_rabbitIL-Iβ质粒。
[0023] 本发明第三方面公开了前述制备兔白介素1β的方法以及用于扩增兔白介素1β 的引物对在兔白介素1β重组蛋白生产中的应用。
[0024] 本发明公开了制备兔白介素1β的方法以及纯化复性技术，制备的高纯度产品可 用于ELISA酶联免疫分析，疾病诊断，或白介素1β抗体制备等领域。
[0025] 本发明的有益效果是：本专利通过基因重组、重组蛋白表达纯化和复性技术获得 可溶性高纯度的兔白介素1β重组蛋白，所获得的重组蛋白具有理想的免疫原性（生物活 性），在国内属首创。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为兔白介素1β基因PCR扩增结果，其中M为Marker，1为PCR扩增出的兔白 介素1β基因；
[0027] 图2为PCR扩增兔白介素1β基因双酶切和原核表达载体pET32a双酶切结果。其 中M为Marker，1为pET32a双酶切后条带，大小为5. 9kb;2为PCR扩增兔白介素1β基因 双酶切条带基因大小为807bp;
[0028] 图3为兔白介素1 β原核表达载体的克隆筛选及鉴定结果；
[0029] 图4为编号①的阳性克隆测序结果和NCBI公布的目的基因序列比对；
[0030] 图5为兔白介素1 β蛋白表达和检测结果，其中1为阴性对照，2为诱导表达后的 裂解液上清，3为诱导表达后的裂解液沉淀（包涵体）；
[0031] 图6为兔白介素1β蛋白镍柱纯化结果，其中1为Marker, 2-15分别代表纯化收 集的1-14管兔白介素1β重组蛋白；
[0032] 图7为兔白介素1β蛋白的复性结果，其中1为包涵体兔白介素1β蛋白经透析 复性后的结果；
[0033] 图8为兔白介素1β蛋白活性检测结果；其中，A为鸡血清中抗体效价（血清稀释 64000倍），B为卵黄抗体效价；血清和卵黄均显示随着免疫次数增加，抗体滴度增加。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0035] 实施例1重组质粒的构建
[0036]LPCR扩增
[0037] 根据已知的兔白介素1β基因序列（SEQIDNO: 1所示）设计PCR上游引物和下 游引物如下：
[0038]上游引物Fl5' -CGGGATCCATGGCAACAGTACC-3' (SEQIDNO: 2)
[0039]下游引物F2 5, -CCGCTCGAGTTAGGAAGACACG-3' (SEQIDNO: 3)
[0040] 以pUC57_rabbitIL-Ιβ质粒（购自烟台基诺莱斯生物科技有限公司，商品 RabbitILbetacDNAPlasmid)为模板，采用上游引物Fl和下游引物F2,在PCR仪中扩增 兔白介素1β基因。PCR扩增程序见下表1，基因扩增结果见图1，目的基因为807bp。
[0041] 表IPCR扩增程序
[0042]
【权利要求】
1. 一种制备兔白介素10重组蛋白的方法，包括以下步骤： 1) 引物设计：设计并合成扩增兔白介素10的引物，引物序列如SEQ ID NO :2-3所示； 2. PCR扩增：以含有SEQ ID NO : 1所示基因序列的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩 增程序为：95°C预变性15min ;94°C 45s，58°C 45s，72°C 60s，共30个循环；最后72°C延续 lOmin，获得扩增产物； 3) 重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的原核 表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5 a，筛选重组质粒并测序； 4) 蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a-rabbit IL-1 0，转化感受态 细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达； 5) 蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白介素 重组蛋白。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述蛋白纯化具体包括以下步 骤： A. 包涵体处理：采用裂解液裂解菌体后离心弃上清，采用Buffer B1溶解沉淀并离心， 上清含有兔白介素10包涵体蛋白用于下一步的分离纯化； B. 分离纯化：分离纯化采用镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以20ml灭菌水清洗 Ni-NTA预装柱，然后用10ml Buffer B2平衡Ni-NTA预装柱后上样；再用10ml Buffer B2 和20ml Wash Buffer清洗Ni-NTA预装柱；最后用10ml Buffer E洗脱Ni-NTA预装柱，收 集洗脱液，获得纯化的兔白介素10包涵体蛋白； C. 蛋白复性：将兔白介素10包涵体蛋白稀释到浓度在0. ly g/yl以下，经TGE缓冲 液透析，浓缩，收集获得复性后的兔白介素10蛋白。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤A所述裂解液的配方为：50mM NaH2P04、300mM NaCl、10mM 咪唑、0? 5mM PMSF, pH8. 0 ;所述 Buffer B1 的配方为：100mM NaH2P04、10mM Tris、6M 盐酸胍，pH8. 0。
4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述Buffer B2的配方为：100mM NaH2P04、10mM Tris、8M 尿素，pH8. 0 ;所述 Wash Buffer 的配方为：100mM NaH2P04、10mM Tris、20mM咪唑、8M尿素，pH8.0 ;所述Buffer E 的配方为：100mM NaH2P04、10mM Tris、250mM 咪唑、8M尿素，pH8. 0。
5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤C所述TGE缓冲液的配方为： 50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.5mM EDTA、5% 甘油、1% 甘氨酸、lOmMP-巯基乙醇、0.5mM PMSF，pH8. 0。
6. -种用于扩增兔白介素 IP的引物序列，包括上游引物F1和下游引物F2,上游引物 F1的序列如SEQ ID NO :2所示，下游引物F2的序列如SEQ ID NO :3所示。
7. 如权利要求6所述的引物序列，其特征在于，所述弓丨物扩增的模板为含SEQ ID NO: 1所示序列的质粒或基因片段。
8. 如权利要求7所述的引物序列，其特征在于，所述引物扩增的模板为pUC57-rabbit IL-1P质粒。
9. 权利要求1-5任一权利要求所述制备方法以及权利要求6-8任一权利要求所述引物 在兔白介素10重组蛋白生产中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104357473SQ201410529417
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】陈金文, 李文静, 张文文, 陈凌燕, 路雅丽, 姜自彬 申请人:烟台基诺莱斯生物科技有限公司