的抗原模拟表位及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及针对伏马菌素B1的抗原模拟表位，其氨基酸序列为TTLQMRSEMADD。本发明FB1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的FB1标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于FB1的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然FB1分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了FB1对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。
【专利说明】针对伏马菌素I的抗原模拟表位及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及伏马菌素8工抗原模拟表位及其应用。
【背景技术】
[0002]伏马菌素8丨，1?)是一种常见的真菌毒素，主要由串珠镰刀菌(^11881-111111产生研究表明，即丨对人类及动物具有较强的毒性作用，包括神经毒性、生殖毒性、胚胎毒性及致畸致癌等，国际癌症研究中心已把即工化分为28组，即对人类可能的致癌物。目前，多数国家已经对谷物、粮食及食品中？8工的残留含量设定了限量标准，如联合国粮农组织(1^0)规定每日最大允许摄入总量为2吒/匕体重；瑞士规定粮食中和？82总残留限量为1000吒/匕
[0003]目前，检测食品中1?的方法主要有高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱及免疫学检测等方法，免疫学检测方法以其灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势在的检测中得到了广泛的应用。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必须使用即工标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，不仅价格昂贵而且具有极强的致癌性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。有鉴于此，人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。
[0004]本发明通过用噬菌体展示肽库技术，从肽库中筛选出能与靶分子(抗1?单克隆抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位),该抗原模拟表位具有与天然分子相似的免疫反应特性，通过获得的1?抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的1?标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于？8工的免疫学检测。
【发明内容】
[0005]本发明以抗1?单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行亲和淘选，获得了七种？8工的抗原模拟表位。它们的氨基酸序列如下:
丽八舰 1321^0、'邠預、1^21^111(03？、
1^01(33 祖^ 鼎？。
[0006]本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，分别对应为: ^1^1606606^161^11066^16601^016^, 1111^1^01^61006661066^06^610^11^1^16
、^110^10^66^61160611^1^01^66^1101006,6666^16666160^1^61060^16^1^10061666,八。1^060110^6^16061^616^6^166016^16^1、、^0X0666^1^6106106^161166^6061166006 上述抗原模拟表位(多肽)结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然型氨基酸残基或其0-型异构体的一种，0代表半胱氨酸残基，0代表天冬氨酸残基，？代表脯氨酸残基，I？代表精氨酸残基，X代表赖氨酸残基，代表组氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，V代表缬氨酸残基，^代表酪氨酸残基，8代表丝氨酸残基，？代表苯丙氨酸残基，2代表谷氨酸残基，I代表甲硫氨酸残基，6代表甘氨酸残基，I代表亮氨酸残基，0代表谷氨酰胺残基，I代表色氨酸残基，^代表天冬酰胺残基，^代表丙氨酸残基，X代表苏氨酸残基。
[0007]本发明提及的抗原模拟表位(多肽)可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有？81抗原模拟表位(多肽)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有？81抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的抗原模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码？81抗原模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行抗原模拟表位的大量制备。
[0008]本发明还涉及所述伏马菌素8工抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
[0009]本发明伏马菌素8工抗原模拟表位(剛八舰132嫩10、吖13？⑶13册1、1^20^11(03？、⑶11?謝32嫩00、3祖10罚0打1！1、1801(33祖^鼎？)在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替即工标准品来进行免疫学检测分析。
[0010]还涉及伏马菌素8工抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
[0011]还涉及伏马菌素8工抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
[0012]前述伏马菌素8工抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的即工标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于？8工的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然1?分子相似的免疫反应特性，效果非常好。
[0013]本发明的有益效果是:本发明伏马菌素8工抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于1?的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然1?分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了 1?对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为以？81抗原模拟表位建立的间接竞争此标准曲线。标准曲线的线性回归方程为7 = -144.5111(^) + 196.18，尺2 = 0.9609，1匕。值为0.562耶?[，线性检测范围为0.171?2.420叩/爪[，最低检测限为0.121叩/齓。
【具体实施方式】
[0015]实施例1.抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定 1)1?抗原模拟表位的亲和淘选:具体方法为:用10禮？88 (邱7.4)稀释抗1?单克隆抗体，并以终浓度100 ^8/1111包被96孔酶标板，41孵育过夜。第二天用1831 (50禮^01,邱7.5包含0.1% 1^6611-20卜八))洗涤10次后，加入300 988^？88? 41孵育2小时。2小时后弃封闭液，用1831洗涤5次，每孔加入100 ^ 1噬菌体肽库(噬菌体展示十二肽库，购自肥8公司，用183 10倍稀释噬菌体原液，约1.0^10111^11),22-261振荡反应1小时。弃去未结合的噬菌体，用1831洗涤10次，结合上的噬菌体用 0.2 1 61^01116-1101 (邱 2.2)洗脱，并立即用 15 ^111 11-18-1101 (邱 9.1)中和。取10 ^1洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20 III[生长至对数前期的X 0011 ￡82738菌株进行扩增。第三天用？％7^乂1沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。
[0016]在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗？8工单克隆抗体浓度分别为75 4 [和50 11 所用的丁83丁浓度为0.25%和0.5%，其余步骤同上。
[0017]2)阳性噬菌体克隆的鉴定:从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个曬菌体斑,进行曬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法￡112711161111^6(1 1111111111108801-136111: 88887,3八)进行阳性卩遼菌体克隆的鉴定，具体方法为:首先，用10禮？88 (邱7.4)稀释抗1?单克隆抗体，10呢/此包被96孔酶标板，41孵育过夜。第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的？83进行封闭，371孵育1小时；投入100耵噬菌体斑扩增液(1.0 X 1011时10，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37 I孵育1小时；加入1:5000倍稀释的！II？？标记抗113噬菌体二抗100沿，37。。孵育1小时；加入10041 118底物液，避光显色5-11,酶标仪8016111:1^10 11111:18^811 ？0读取450 11111处的吸收值。选取0045。大于阴性对照2倍的卩遼菌体克隆为阳性克隆。
[0018]3) 抗原模拟表位的鉴定:采用间接竞争此的方法进行1?抗原模拟表位的鉴定，具体方法为:用10禮？88 (邱7.4)稀释抗1?单克隆抗体，10呢/111[包被酶标板，41孵育过夜；第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的？83进行封闭，371孵育1小时；投入50沿经间接此鉴定为阳性的丨邀菌体克隆(1.(^1011时11)和50耵1?标准品(浓度范围为0-20
时；加入1:5000稀释册？标记的抗肌3噬菌体二抗100沿，371孵育1小时；加入100沿118底物液，避光显色5111111，读取0045。，能结合抗叩工单克隆抗体，且能被1?标准品所阻断的噬菌体，鉴定为1?的抗原模拟表位。
[0019]实施例2.抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接竞争此鉴定展示有？81抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的0嫩测序模板。简要过程如下:进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800沿含噬菌体上清转入一新离心管。加入200耵[郎/似口沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100耵碘化物缓冲液(10禮11-18-1101 (邱8.0), 1禮￡01^, 4 I耵无水乙醇沉淀0嫩，离心后再用70%乙醇洗涤沉淀(0嫩测序模板沉淀最终重悬于20耵灭菌水，取2沿进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5叱噬菌体模板进行0嫩测序，其-96 8111测序引物为:5,-0?^^ 1^6 11^ 606 06~3\依据0嫩测序结果及密码子表可获得1?抗原模拟表位的氨基酸序列。它们的氨基酸序列如下:
丽八舰 1321^10、？打3？训！'邠預、1^21^111(03？、
1^01(33 祖^ 鼎？。
[0020]实施例3.1?抗原模拟表位作为竞争抗原在此13八中的应用 (1)样品提取
称取如样品(谷物及其相关食品),加入25毫升60 %的甲醇-？83溶液，200印111振荡5分钟；将提取液用—￡1饱册1号滤纸进行过滤后，取1毫升滤液加入4毫升？83 (磷酸盐缓冲液，邱=7.2)混匀后，即为样品提取液，待用。
[0021](2)包被及封闭
用10禮？88 (邱7.4)稀释抗1?单克隆抗体，10吒/此包被酶标板，41孵育过夜。第二天用？831 (10 1111 ^88, 0.05% 1^6611-20卜八))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的？88进行封闭，371孵育1小时后，用洗板6次待用。
[0022]( 3 )标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50沿展示有1?抗原模拟表位的噬菌体(1.(^1011时11)和一系列不同浓度的50耵即工标准品，371孵育1小时。加入1:5000稀释！II？？标记的抗113噬菌体二抗，371孵育1小时。然后用118底物显色，读取0045。。以浓度对数为横坐标，结合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的00450父100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈3型，线性相关性较好(图0。如图1，以？81抗原模拟表位(氨基酸序列为剛—鮮32嫩10)建立的间接竞争此13八标准曲线。标准曲线的线性回归方程为 7 = -144.5111^) + 196.18，尺2 = 0.9609，1(350^^ 0.5621^/01，线性检测范围为0.17广2.420叩/^，最低检测限为0.121叩/齓。
[0023](4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50沿展示有1?抗原模拟表位的噬菌体(1.(^1011 口血)和待测样品提取液，371孵育1小时。加入1:5000稀释册？标记的抗113噬菌体二抗，371孵育1小时。然后用118底物显色，读取0045。，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中？^工的含量。
[0024]实施例4.抗原模拟表位作为固相抗原在此13八中的应用 (1)样品提取
称取如样品(谷物及其相关食品),加入25毫升60 %的甲醇-？83溶液，200印111振荡5分钟；将提取液用—￡1饱册1号滤纸进行过滤后，取1毫升滤液加入4毫升？83 (磷酸盐缓冲液，邱=7.2)混匀后，即为样品提取液，待用。
[0025](2)包被及封闭
用10禮？88 (邱7.4)稀释展示有即工抗原模拟表位的噬菌体(2.0^1011时11), 100微升包被于酶标板，41孵育过夜。第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的？83进行封闭，371孵育1小时后，用洗板6次待用。
[0026](3)标准曲线的建立
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50耵抗1?单克隆抗体(0.5叩/“)和一系列不同浓度的50耵标准品，371孵育1小时。加入1:2000稀释！！！？？标记的羊抗鼠I姊二抗，371孵育1小时。然后用118底物显色，读取0045。。以1?浓度对数为横坐标，结合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的0045。父100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
[0027](4)样品的检测
取出经步骤(2)处理好的板条，每孔分别投入50耵抗1?单克隆抗体(0.5叩/“)和一系列不同浓度的50耵标准品，371孵育1小时。加入1:2000稀释！！！？？标记的羊抗鼠I姊二抗，371孵育1小时。然后用118底物显色，读取0045。。以1?浓度对数为横坐标，结合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的0045。父100%)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
[0028]实施例5.1?抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用 (1)样品提取
称取如样品(谷物及其相关食品),加入25毫升60 %的甲醇溶液，200印111振荡5分钟；将提取液用—￡1饱册1号滤纸进行过滤后，取1毫升滤液加入4毫升？83 (磷酸盐缓冲液，邱=7.2)混匀后，即为样品提取液，待用。
[0029](2)噬菌体及控制线的点阵
用10禮？88 (邱7.4)稀释展示有本发明即工抗原模拟表位的噬菌体(2.(^1011口血)，用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上(孔径0.2-0.45微米),作为检测线；将0丨5呢/“的册？标记的羊抗鼠I姊二抗，用点阵仪或微量移液划线于同一张硝酸纤维素膜上(位于检测线的上方，距离大于5毫米),作为控制线。
[0030]( 3 )胶体金标记1?抗体
将抗体逐滴加入胶体金溶液(邱=8.2)中，边滴边搅拌，30分钟后，取1% ？26加入上述溶液中，继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的10% 8“溶液，搅拌15分钟后，静置30分钟，离心后去上清，得到胶体金标记的1?抗体溶液。
[0031](4)胶体金检测卡的组装
将胶体金标记的抗体点喷于胶金垫上(1.0微克/毫升),将样品垫、胶金垫，点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装，切成试纸条，装入检测卡中待用。
[0032](5)样品的检测
将样品提取液加入样品垫中，静置10分钟，若样品中含有1?且超过胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域不显色，而控制线区域显色；若样品中不含有？8工且低于胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域显色，控制线区域也显色。若控制线区域不显色，表明试纸条失效。
[0033]实施例5 抗原模拟表位的大量制备
(1)以曬菌体扩增的方式
将展示有？81抗原模拟表位的噬菌体加入至20 “接种有21？ 2738的培养物中，37度220 11)111振荡培养4.5卜。将培养物转入另一离心管中，4 V 10000 1~卿离心10 ―!!，将上清的上部80 %转入一新鲜管中，加入1/6体积的？I下静置120砧!!。400 10000印111离心？郎/似⑶静置溶液15旧!!。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1此188进行重悬，即为噬菌体扩增液。
[0034](2)以1?抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备八.扩增抗原模拟表位的外源编码基因
反应体系:(50虬) 10 X ？71~013681:(1^2+ ￠1118)5 此
伽丁？ 11x1:111-6 (68011 ？01~ 2.5 禮)4 1^-1
1131(2 111861-1: 6X1:61181011 ^1~111161~ (10 1111)1 1^-1
-96 ^111 86^116110111? ^1~111161~ (10 1111)1 1^-1
噬菌体0嫩模板1此
？71~013681: 0嫩？01齊61~已860.5 1^-1
灭菌(1(1112037.5 虬
？邙反应条件:95。0 5 111111，接着 951 30 860, 5500 30 860, 7200 40860，720010 111111 共 30 070168。
[0035]采用产物回收试剂盒纯化产物，微量核酸定量仪定量。？81抗原模拟表位的编码基因序列分别对应为:
^1^1606606^161^11066^16601^016^, 1111^1^01^61006661066^06^610^11^1^16、^110^10^66^61160611^1^01^66^1101006,6666^16666160^1^61060^16^1^10061666,八。1^060110^6^16061^616^6^166016^16^1、、^0X0666^1^6106106^161166^6061166006
8.外源编码基因及表达载体的双酶切
分别采用八￠^651^2^ I酶对外源编码基因和表达载体㈧嫩1-1)111，肥8公司，可表达18？融合蛋白)进行双酶切。
[0036]0.酶切后产物的连接及转化
将质粒？此1-？111和目的片段以1: 10(摩尔比)混匀，于16 00水浴连接12卜，取10 连接产物加至100 ^ [感受态细胞181中，充分混匀。冰浴30 ―!!后，42 V水浴热激90 8，立即冰浴5 111111后补加600 111 18液体培养液，37 00, 200印111培养1 11,10000印111离心2 111111，吸去上清留取约200 9 I，涂布于03-八固体(八卹1~)培养基中，37 过夜培养，得到阳性克隆。
[0037]0.抗原模拟表位-18？融合蛋白的表达
将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5 18-^,0.2%蔗糖中，371，220 17111111，振荡培养过夜，将过夜培养物按1 %接种量“八)接种于50 III[的18-八，0.2 %蔗糖培养基中，分别接种3瓶，371，220 1-/111111振荡培养，当培养物细菌浓度00600达到0.6时，向三瓶培养物中加入1？%至终浓度为0.2 11111101/1,220 1-/111111振荡培养，将诱导物(户郎溶液)于4 00,4000 8，离心20爪化收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400此30禮11~18-此1，20%蔗糖，邱8.0 (80齓/8细胞湿重)，加入八至1禮，室温下震荡5-10111111,8000 8，41^,离心20 0111,弃上清，沉淀重悬于400 1111预冷的5禮1妨04，冰上震荡10111111, 8000 8，4。。，离心 20 111111,保留上清，向上清液中加入 8 1111 1 I 11-18-1101,邱 7.4，获得？81抗原模拟表位-18？融合蛋白。
【权利要求】
1.针对伏马菌素Bi的抗原模拟表位，其特征在于氨基酸序列为:TTLQMRSEMADD。
2.编码权利要求1所述针对伏马菌素&的抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸。
3.如权利要求2所述的核苷酸，序列对应为: ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGATo
4.权利要求1所述针对伏马菌素&的抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于针对伏马菌素&的抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
6.如如权利要求4所述应用，其特征在于针对伏马菌素&的抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104311635SQ201410529360
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年3月6日 优先权日:2013年3月6日
【发明者】何庆华, 许杨 申请人:南昌大学