一种长牡蛎白介素il17n重组蛋白及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种长牡蛎白介素IL17N重组蛋白及其制备和应用。长牡蛎白介素IL17N重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。本发明获得的重组蛋白可用于抗菌的饲料添加剂和治疗肿瘤蛋白类药物的研发。
【专利说明】一种长牡蛎白介素 I LI 7N重组蛋白及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种长牡蛎白介素 IL17N重组蛋白及 其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 白介素17是高等动物中一类重要的炎症细胞因子，在机体免疫调节系统中发挥 着重要的作用，目前已在高等哺乳动物中发现了五大类白介素亚家族成员，其中IL17A及 IL17F的功能研究的比较清楚，其他成员的功能还有待进一步的研究。白介素17可以上调 免疫相关基因的表达，加速体内病原的清除。白介素17的失调会造成机体的许多炎症反应 以及自身免疫性疾病，诸如牛皮癣，风湿性关节炎及脑脊髓炎等。
[0003] 目前研究发现白介素17存在于肿瘤组织中，对肿瘤组织的微环境起到了调节作 用。高等动物中白介素17对肿瘤组织起到了双重作用，一方面可以通过激活细胞毒性T细 胞、自然杀伤细胞等对肿瘤起到抑制的作用，另一方面白介素17可以激活IL6和STAT3信 号通路，诱导VEGF及TGF- β的表达，利于肿瘤细胞的转移和生长。
[0004] 贝类是我国重要的海水养殖生物，近年来养殖贝类病害频发，对我国海水养殖业 造成重大的经济损失。从贝类自身的免疫防御系统入手，阐明其白介素17等细胞因子的分 子功能及其对机体的免疫调节作用，将为病害防治和良种选育提供新思路。由于贝类进化 地位较原始，其分子功能分化不完全，同一个蛋白往往兼具多种生物学功能，因此贝类的功 能基因具有诱人的开发利用潜力。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种长牡蛎白介素 IL17N重组蛋白及其制备和应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种长牡蛎白介素 IL17N重组蛋白，长牡蛎白介素 IL17N重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。
[0008] -种长牡蛎白介素 IL17N基因重组蛋白的制备方法，
[0009] (1)以长牡蛎白介素基因编码区为模板，采用Pl和P2引物进行PCR扩增，待用；
[0010] (2)上述PCR扩增产物与PMD19-T Simple载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴 定重组子；
[0011] (3)采用NdeI、BamHI对上述的重组子及PMAL-C5X进行酶切，酶切片段通过T4连 接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
[0012] (4)将上述构建重组子转入Transetta DE3表达菌株中进行诱导培养，而后纯化， 即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白IL17N;
[0013] 所述引物Pl和P2分别为：
[0014] Pl :5, -GACATATGATGAATGCCCCTGTCTGGCT-3,；
[0015] P2 :5 ' -GAGGATCCTTAGCTGGGTCTCTGGACGG-3 '。
[0016] 一种长牡蛎IL17N基因重组蛋白的应用，所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列 所示的重组蛋白IL17N用于制备抑菌剂或饲料添加剂。
[0017] 所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重组蛋白IL17N用于制备抑制革兰 氏阴性菌或革兰氏阳性菌的的抑菌剂。
[0018] 一种长牡蛎IL17N基因重组蛋白的应用，所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列 所示的重组蛋白IL17N用于制备抗肿瘤的药物。
[0019] 所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重组蛋白IL17N用于制备抗小鼠肺 纤维瘤细胞的药物。
[0020] 本发明所具有的优点：
[0021] 本发明利用体外重组表达技术获得了长牡蛎白介素 IL17N重组蛋白，该重组蛋白 能抑制大肠杆菌和藤黄微球菌的生长，并对小鼠肺纤维瘤细胞L929具有明显的杀伤作用。 同时在开发广谱抗菌类药物、饲料添加剂和抗肿瘤药物等方面具有潜在应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例提供的长牡蛎IL17N基因重组蛋白对小鼠肺纤维瘤细胞L929 生长的抑制作用图。
[0023] 图2为本发明实施例提供的长牡蛎IL17N基因重组蛋白对大肠杆菌和藤黄微球菌 生长的抑制作用图。
【具体实施方式】
[0024] 下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0025] 实施例1
[0026] 长牡蛎IL17N基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：
[0027] 1、重组载体的构建
[0028] 本发明中采用的重组载体为NEB公司的pMAL-C5X原核表达载体。
[0029] 以长牡蛎白介素基因编码区为模板，通过PCR技术，使用基因特异性引物Pl (5'_G ACATATGATGAATGCCCCTGTCTGGCT-3'）和 P2(5' -GAGGATCCTTAGCTGGGTCTCTGGACGG-3'）扩增 长牡蛎IL17N基因的编码区片段。反应条件为：首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循 环：94°C变性30秒，68°C退火30秒，68°C延伸30秒，共进行30个循环，最后72°C延伸10分 钟。将PCR产物纯化回收，与pMD19-T simple载体连接，NdeI和BamHI双酶切，与相同酶 切的PMAL-C5X连接。转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成载体的构建。
[0030] 2、重组蛋白的表达
[0031] 以Transetta DE3为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表达宿主菌 中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于IOmL LB液体培养 基中，37°C震荡摇床中培养12-16小时，然后将培养液以体积比I :100的比例接种至200mL LB液体培养基中，37°C培养至0D600 = 0. 4-0. 6。加入IPTG，使终浓度达到0. 8mM mL-1， 28°C继续培养6h。4°C，10000rpm，离心lOmin，收集菌体，于-20°C冻存备用。取ImL菌液离 心，弃去上清后，加入80yL水和20yL 5X蛋白上样缓冲液（250mMTris-HCL，10% (W/V) SDS，0· 5% (W/V)BPB，50% (V/V)甘油，5% (W/V) β -巯基乙醇），100°C沸水煮沸 10 分钟， 稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。
[0032] 3、重组蛋白的纯化
[0033] 将上述所得蛋白采用Amylose Resin纯化获得可溶重组蛋白。
[0034] 具体操作步骤如下：
[0035] Amylose Res in色谱分离带MBP标签的重组蛋白
[0036] (I)Amylose Resin 装柱，I. 6 X 20cm，柱床体积为 20mL ;
[0037] (2)用缓冲液 1 (缓冲液 1 为 20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, ImM EDTA)平衡 5 个床 体积，流速为2mL min-1 ;
[0038] (3)将 20ml 缓冲液 I (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, ImM EDTA) 0· 22 μ m 滤膜过滤， 上样，流速为ImL min-1 ;
[0039] (4)用缓冲液1再洗5个床体积，流速为2mL min-1 ;
[0040] (5)用含IOmM麦芽糖的缓冲液1进行阶段洗脱，流速为ImL min-1，收集洗脱后溶 液，用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；
[0041] (6)用纯水流洗5个柱床体积，0. 1%的SDS流洗3个柱床体积，流速为2mL min-1， 再用纯水流洗5个柱床体积，20%乙醇封柱，置于4°C环境中保存。纯化蛋白置于超纯水中 透析，去除盐离子及麦芽糖。透析超低温冻干，即得到SEQ ID NO. 1所示的长牡蛎IL17N基 因重组蛋白。
[0042] SEQ ID NO. 1
[0043] MNAPVWLTLVLALLTRCCLPHPVSRCRGCHIFDPPFRGLDYSDYDDSERLDTQSICPWSTIMVEDNDRV PRQLPSTTCTKSSVVFQLNGTPVEYACELVEVTVSVLKYHPSGYWERSDELVPVACTAVQRPS
[0044] 序列特征：
[0045] 长度：132个氨基酸
[0046] 类型：氨基酸
[0047] 链型：单链
[0048] 拓扑结构：线型
[0049] 特性：分子量为14. 89kDa，等电点为5. 04,具有保守的cysteine-knot折叠结构 域。
[0050] 来源：长牡蛎
[0051] 实施例2
[0052] 长牡蛎IL17N原核重组蛋白的抑菌活性分析
[0053] 对大肠杆菌或藤黄微球菌的生长抑制实验：在平底96孔板（Costar，Fisher)中每 孔加入200 μ L LB液体培养基和10 μ L对数生长期的菌液（大肠杆菌或藤黄微球菌），再 分别加入10 μ g，100 μ g的上述重组蛋白IL17N，另设MBP蛋白对照组和PBS空白对照组。 220rpm，37°C振荡培养，每隔Ih用酶标仪分别检测记录各孔0D600值。每个样品设四个重 复，根据4次测定结果取平均值作图。实验表明重组IL17N蛋白能够抑制革兰氏阴性菌和 革兰氏阳性菌的繁殖（参见图2)。
[0054] 同时结合附图给出相应的结论500 μ g/ml重组的IL17N蛋白能够明显的抑制革兰 氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长。表明了重组的IL17N蛋白可作为抑菌剂用于饲料添加 剂。
[0055] 实施例3
[0056] 长牡蛎IL17N原核重组蛋白对肿瘤增殖抑制活性分析
[0057] 对小鼠肺纤维瘤细胞L929增殖抑制实验：在平底48孔板（Costar，Fisher)中 每孔加200 μ I DEME培养基重悬的L929细胞，重悬液中细胞数目约为5000,而后置37°C， 5% C02培养箱中培养12h ;吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入浓度为100ng/ml、500ng/ ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml 的上述重组蛋白 IL17N，0· 2ml/ 孔，各设双复孔，并设 培养液阴性对照及标签蛋白MBP空白对照；置37°C，5% C02培养箱中培养24h，每孔加入 20μ 1碧云天生产的CCK8,450nm测定吸光度，评价细胞存活率（参见图1)。
[0058] 同时结合附图给出相应的结论1000ng/ml重组的IL17N蛋白对小鼠纤维瘤细胞系 产生了较为明显的抑制作用，表明了重组的IL17N蛋白可应用与抗肿瘤药物的研发。
【权利要求】
1. 一种长牡蛎白介素IL17N重组蛋白，其特征在于：长牡蛎白介素IL17N重组蛋白为 序列表SEQ ID NO. 1中氣基酸序列所不。
2. -种根据权利要求1所述的长牡蛎白介素IL17N基因重组蛋白的制备方法，其特征 在于： (1) 以长牡蛎白介素基因编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用； (2) 上述PCR扩增产物与pMD19-T Simple载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重 组子； (3) 采用Ndel、BamHI对上述的重组子及pMAL-C5X进行酶切，酶切片段通过T4连接 酶连接，转化，测序鉴定重组子； (4) 将上述构建重组子转入Transetta DE3表达菌株中进行诱导培养，而后纯化，即得 到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白IL17N; 所述引物P1和P2分别为： P1 :5, -GACATATGATGAATGCCCCTGTCTGGCT-3,； P2 :5' -GAGGATCCTTAGCTGGGTCTCTGGACGG-3'。
3. -种按权利要求1所述的长牡蛎IL17N基因重组蛋白的应用，其特征在于：所述序 列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重组蛋白IL17N用于制备抑菌剂或饲料添加剂。
4. 按权利要求3所述的长牡蛎IL17N基因重组蛋白的应用，其特征在于：所述序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重组蛋白IL17N用于制备抑制革兰氏阴性菌或革兰氏阳 性菌的的抑菌剂。
5. -种按权利要求1所述的长牡蛎IL17N基因重组蛋白的应用，其特征在于：所述序 列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重组蛋白IL17N用于制备抗肿瘤的药物。
6. 按权利要求5所述的长牡蛎IL17N基因重组蛋白的应用，其特征在于：所述序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重组蛋白IL17N用于制备抗小鼠肺纤维瘤细胞的药物。
【文档编号】A61K38/20GK104402987SQ201410687340
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】宋林生, 辛鲁生, 王玲玲, 刘瑞 申请人:中国科学院海洋研究所