专利名称：共表达prrsv orf5和pcv2 orf2双价核酸疫苗的制备方法
共表达PRRSV 0RF5和PCV2 0RF2双价核酸疫苗的制备方法技术领域：
本发明猪繁殖与综合症病毒和猪圆环病毒双价核酸疫苗的制备方法属于生 物技术高新科技领域，可以由一种核酸疫苗同时预防猪繁殖与呼吸综合征猪圆 环病毒病的免疫保护作用。 2、背景技术猪繁殖与呼吸综合征可引起妊娠母猪流产、死产等繁殖障碍和仔猪呼吸道 症状。自2006年6月初以来，在我国湖北、湖南、江西、安徽等十几个省份相 继出现高致病性PRRSV为主要病原的猪"无名高热综合征"，给我国的养猪业 造成了严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，长约 15kb。 0RF5编码约25ku的糖蛋白GP5，能诱导机体产生中和抗体及特异性细胞 免疫。猪圆环病毒是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状 DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及 全基因组序列，可分为两个血清型:PCV-1与PCV-2 。 PCV-2含有两个主要阅读 框0RF1和0FR2。其中0RF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构 蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。目前在一些猪场，常发生此两种病毒的混合感染，且毒株的同源性极高，本 试验旨在构建同时含有此两种病毒的主要结构蛋白的真核表达载体，为进一歩 研究PCV 0RF2及PRRSV 0RF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环和猪繁殖与 呼吸综合征病毒双价核酸疫苗奠定了基础，其应用解决了在生产中防制猪圆环 病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒混合感染要分别注射二种疫苗的麻烦，减少了注 苗应激，降低了劳动强度，具有极大的研究意义。3、发明内容本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒 病的共表达pIRES-0RF2/0RF5双价核酸疫苗，使猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环 病毒病容易混合感染并难以防治的现状得以突破。本发明的目的是这样实现的共表达PRRSV 0RF5和PCV2 0RF2双价核酸疫苗的制备方法，是在哺乳动物 真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了 PRRSV 0RF5和PCV2 ORF2完整基 因，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV GP5蛋白和PCV2 Cap蛋白。上述核酸疫苗通过以下方法构建而成1) 0RF2及0RF5的扩增 扩增PCV 0RF2的引物为Hl: 5， -ATCGCTAGCg07ga^aTGACGTATCCAA-3 ， 脸IH2: 5' - GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3 ， fcoR I预期扩增长度为702bp。(注加粗部分为Kozak序列)扩增PRRSV 0RF5的引物为 Yl: 5， -AATCTAGAg07gCaTGTTGGA-3 ， 勘IY2: 5， -GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3 ， 淑I预期扩增长度为702bp。(注加粗部分为Kozak序列)分别以PRRSV SD1株的cDNA和PCV2SD1株的DNA为模板，通过引物Yl/Y2 扩增PRRSV 0RF2，通过HI/ H2扩增PCV2 0RF2基因。2) pIRES-0RF2/0RF5真核重组表达载体的构建将PCR产物0RF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-0RF2 ， RT-PCR产物0RF5经双酶切回收后插入pIRES-0RF2构建成重组质粒 pIRES-0RF2/0RF5。经PCR、 RT-PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移 载体pIRES-0RF2/0RF5。3) pIRES-0RF2/0RF5真核重组质粒的转染将构建成功的pIRES-0RF20RF5重组质粒用脂质体法转染真核细胞 Marc-145，经G418加压筛选获得稳定表达的细胞株，以PCR、 RT-PCR、和间接 免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明经PCR、 RT-PCR检测到两种目 的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到目的蛋白在细胞浆和细胞核中观察到 了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。
图1转移载体的构建示意图；图2: SD1株PCV- 0RF2的PCR扩增示电镜图；附图2说明1.DNA标准DL2000; 2.阴性对照；3. 0RF2基因扩增产物图3: SD1株0RF5的PCR扩增电镜图； 图4: pIRES转移载体的双酶切鉴定电镜图。 具体实施方式
1)引物设计根据pIRES MCSA MCSB多克隆位点的序列和PCV-2及PRRSV 0RF5的核酸序 列，同时考虑外源基因的表达量在基因起始密码子的前面加入Kozak序列，分 别设计了针对PCV-0RF2和PRRSV-0RF5的引物Hl/H2和Yl/Y2，并分别加入了相应的酶切位点。HI: 5， -ATCGCTAGCgCCgdaTGACGTATCCAA-3， 顺e IH2: 5， - GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3 ， ￡b。R IYl: 5， -MTCTAGA6m7daTGTTGGA-3， 勘IY2: 5， -GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3 ， 淑I(注加粗部分为Kozak序列)2) 模板的制备 (1) PCR模板将死亡猪组织病料充分研磨制成悬浮液，冻融3次，离心取上清.加入蛋 白酶K至终浓度500l^g/mL、 SDS终浓度P/。， 55。C水浴2-3小时，用苯酚、苯酚 氯仿(1: 1)及氯仿各抽提一次，吸取水相，加入1A0体积的3mol/LNaAc及 2. 5倍体积的无水乙醇沉淀30min， 12 000rpm、 4。C离心15min。沉淀用70%洗涤 烘干后溶解于超纯水中备用。 (2 ) RT-PCR模板取经反复冻融的细胞病毒液加TRIzol裂解液，充分震荡后，静置5min。继 续加入氯仿(彻底混匀)4°C 12000rpm离心15min。将上清转移至新的经DEPC 水处理的试管中，加异丙醇，混匀后室温静置15-30min 4°C 12000rpm离心 15min。用75%的乙醇洗涤沉淀一次，4°C 12000rpm离心5min。倒掉上清，在 印pendorf抽真空机上抽真空，沉淀溶于15叱DEPC水中备用。3) 目的基因扩增 (1) PCR扩增0RF2反应体系(总体积50^)如下超纯水30. 5HL ， 10XPCR buffer 5PL， dNTP Mixture 4PL， MgC12 3叱，引物各l叱，模板5ML， Taq酶0. 5叱，充分混匀。0RF2基因扩增条件:预变性95。C 5min;变性94°C lmin;退火52°C lmin; 延伸72°C lmin，共30 Cycles,最终延伸72°C 10min。 (2 ) RT-PCR扩增反转录为cDNA:取RNA7^L+oligo(dT) l叱70°C温育10min，冰育lOmin; 力口入5XReaction buffer机，d證Mixture 3^L， Ribo匿lease Inhibitor l叱，ddH20 3叱，M-MLV 1叱42°C水浴60-90min -2(TC保存。0RF5基因扩增条件预变性95。C 5min;变性94°C lmin;退火50°C lmin; 延伸72。C lmin，共30 Cycles,最终延伸72°C 10min。 4 )真核表达载体pIRES 0RF2/0RF5的构建 (1) pIRES—0RF2转移载体的构建 (1.1) pIRES和0RF2的双酶切将纯化后的载体及片段按如下体系进行双酶切EcoR 1...........................1)^1 EcoR 1...........................1WNhe 1...........................114 Nhe I............................ . ll^l10 XM Buffer...............2^1 10 XM Buffer...............2l4pIRES...........................514 0RF2...........................51^1ddH20........................11^1 ddH20........................11^137°C酶切lh(1. 2) pIRES和0RF2电泳鉴定并胶回收纯化双酶切产物，按照上海生工 胶回收试剂盒说明书进行(1.3) pIRES -0RF2的连接 pIRES...............21^10RF2...............Solution I............,12014 16°C保温90min(1.4) pIRES -0RF2的转化 (1. 4. 1) DH5 a感受态细胞制备以无菌接种环取冻存的DH5a菌种划线接种LB Amp-平板37'C培养过夜， 该菌悬液以1: 100比例接种于LB液体培养基，37'C培养2-3h， 0D600=0. 5左右。〈1〉无菌条件下，将细菌转移至50ml冰预冷的聚丙烯离心管中，冰上放置 lOmin， 4°C 4000rpm离心lOmin。〈2>弃上清，将管倒置lmin，用10ml冰预冷的0. lmol/L的CaCI2重悬沉淀， 冰上放置15 —30min后，4°C 4000rpm离心lOmin。〈3>弃上清，将管倒置lmin，加入4ml冰预冷的0. lmol/L的CaCI2，轻轻 悬浮细胞，加无菌甘油至终浓度为15%，混匀，分装，每管200W，直接转化或 一7(TC冰箱冻存备用。(1. 4. 2) pIRES — 0RF2的转化从一70。C冰箱中取20014感受态细胞悬液，室温下解冻，立即置冰上，解 冻后取l(Hil连接产物加入20(mi感受态细胞DH5a中，混匀，冰浴30min， 42°C 热休克90s，再冰浴l一2min，之后加入800W LB(Amp-)液体培养基，37。C振 荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 将上述菌液摇匀后，室温离心30s，取100W涂布于含Amp+的筛选平板上，正面朝上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37t:培养24h((1.5) pIRES-0RF2质粒的提取 按照上海生工质粒提取试剂盒说明书进行。(1.6) pIRES - 0RF2转移载体的PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定10 X PCR buffer...............5pldNTP Mixture ..................糾HI.................................214H2.................................pIRES - 0RF2..................0. 5rtrTaq E........................0. 5^1ddH20...........................EcoR 1...........................114Nhe I...........................lHl10XM Buffer...............2)^1PIRES - ORF2..................5(4ddH20........................37°C酶切4h(1. 6) pIRES—ORF20RF5转移载体的构建 构建过程参照pIRES—0RF2转移载体的构建，并进行PCR鉴定、双酶切鉴 定和测序鉴定。 5)测序测序由Takara公司完成。应用合成引物对重组质粒中的插入片段进行序列 测定，将所测序列与GenBank中其他毒株的相应基因核苷酸序列进行比较，并 对由核苷酸序列推导出来的氨基酸序列进行同源性比较.以确定扩增片段的可 靠性。结果1) PCR扩增产物鉴定提取重组质粒，用引物Hl/H2对PCV SD1株0RF2基因进行PCR鉴定，可见 一条702bp目的片段，与预期的扩增片段相符(图2)。用引物Y1/Y2对SD1株 0RF5进行PCR扩增鉴定，同样有702bp目的片段(图3)。1. DNA标准DL2000; 2. 0RF5基因；3.阴性对照图3: SD1株ORF5的PCR扩增。2) 重组质粒双酶切鉴定通过Amp抗性及双酶切连接筛选后，获得重组质粒pIRES-0RF20RF5，并通 过双酶切鉴定〈1.DNA标准DL2000; <2. pIRES - 0RF20RF5 fcoR I + vV力e I; <3. pIRES -0RF20RF5 Xba I + Not I; 〈4.重组质粒pIRES - 0RF20RF5; <5. DNA标准 入- 飽d III digest。3)插入片段的序列测序及分析pIRES-0RF20RF5转移载体0RF2经测序其基因长702bp，编码233个氨基酸 与测序后的SD1株PCV全长(DQ346683)中的0RF2相吻合，符合预期结果。将 其与Genbank中PCV毒株0RF2进行同源性比较。结果表明，不同毒株PCV-2的 0RF2核苷酸序列同源性介于91. 9%~100%，推导氨基酸同源性为90. 2%~100%。本 实验扩增的ORF2与AY484416 (英国)，AF201897 (德国)，AY682990 (中国) 等国内外代表株核苷酸同源性均为99%。pIRES—ORF20RF5转移载体ORF5基因702bp (DQ265739)的核苷酸推导氨 基酸与北美洲原型(VR-2332株)氨基酸同源性为99%，与DQ474992, DQ476795 两支美洲株的同源性亦为99%，其中第10位的半胱氨酸被替换为精氨酸，第151 位的精氨酸被替换为甘氨酸，第13位、151位的精氨酸被认为是强毒的标志之 一，该位置的替换可能引起病毒的毒力改变。SEQUENCE LISTING<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所<120> 共表达PRRSV 0RF5和PCV2 0RF2双价核酸疫苗的制备方法 <160> 4<170〉 Patentln version 3.3<210> 1<211> 31<212> 薩<213>人工序列<220><223>引物<400> 1atcgctagcg ccgccaccat gacgtatcca a 31<210> 2 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 2gccgcggaat tctcacttag ggttaagt 28<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 〈400〉 3aatctagagc cgccaccatg ttgga 25<210> 4 <211> 24 <212> 飄 <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 4gcgcggccgc tcactggcgt gtag 2权利要求
1.共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法，其特征在于在哺乳动物真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了PRRSV ORF5和PCV2ORF2完整基因，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV GP5蛋白和PCV2Cap蛋白；上述核酸疫苗通过以下方法构建而成1)ORF2及ORF5的扩增扩增PCV ORF2的引物为H15’-ATCGCTAGCGCCGCCACCATGACGTATCCAA-3’Nhe IH25’-GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3’ EcoR I预期扩增长度为702bp；加粗部分为Kozak序列扩增PRRSV ORF5的引物为Y15’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’ Xba IY25’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’Not I预期扩增长度为702bp；加粗部分为Kozak序列在每条引物的5’端均含有限制性内切酶酶切位点，分别以PRRSV SD1株的cDNA和PCV2SD1株的DNA为模板，通过引物Y1/Y2扩增PRRSV ORF2，通过H1/H2扩增PCV2 ORF2基因；以PCV SD1株的DNA为模板，应用RT-PCR技术扩增ORF2全基因，通过每对引物的限制性酶切位点，把ORF5及ORF2分别插入pIRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-ORF2/ORF5重组质粒，该质粒经酶切及PCR鉴定 id="icf0001" file="A2008100140540002C1.tif" wi="2" he="4" top= "166" left = "28" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>2)pIRES-ORF2/ORF5真核重组表达载体的构建将PCR产物ORF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建成重组质粒pIRES-ORF2/ORF5，经PCR、RT-PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES-ORF2/ORF5；3)pIRES-ORF2/ORF5真核重组质粒的转染将构建成功的pIRES-ORF2ORF5重组质粒用脂质体法转染真核细胞Marc-145，经G418加压筛选获得稳定表达的细胞株，以PCR、RT-PCR、和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，证明经PCR、RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到目的蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。
全文摘要
本发明猪繁殖与综合症病毒和猪圆环病毒双价核酸疫苗的制备方法，简称共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法，本发明根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCSA MCSB多克隆位点的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD1株的ORF2基因阅读框架，同时考虑外源基因的表达量在基因起始密码子的前面加入Kozak序列，分别设计了针对ORF5、ORF2的引物Y1/Y2，H1/H2。将PCR产物ORF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建成重组质粒pIRES-ORF2/ORF5。经PCR、RT-PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES-ORF2/ORF5。
文档编号A61P15/00GK101401936SQ20081001405
公开日2009年4月8日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者任慧英, 吴家强, 顺 周, 张秀美, 俊 李, 温建新, 王金宝, 赵鸿雁 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所