专利名称：一种植物双元表达载体pMHZ111及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体地说是一种植物双元表达载体pMHZlll及其在改变人参皂苷含量的应用。
背景技术：
人参(Panax ginseng C. A. Mey.)为我国古老而名贵的药用植物，系五加科(Araliaceaae)人参属植物，是一种具有潜力的药用植物，在人类保健和医疗上应用广泛。医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分之一，
人参阜苷(Ginsenoside, GS )是人参主要的药理活性成分,至今人们已经从人参植物中分离出至少40多种人参皂苷单体，按人参皂苷在薄层色谱中Rf值的大小，由小到大命名为
R0> Ra, Rb1, Rb2, Rb3> Re, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3等。人参皂苷均属于三萜类皂苷，可分为三大类第一类二醇型，如人参皂苷Rbp Rb2, Re、Rd、Rh2等；第二类三醇型，如人参皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1等；第三类齐墩果酸型，如人参皂苷&、Rh3等。其中二醇型和三醇型皂苷占绝大多数，被认为是人参的最主要活性成分。人参皂苷除单体皂苷外还含有蛋白质、酶类、多肽、氨基酸、人参多糖、人参挥发油、人参二醇、人参三醇等。人参皂苷属于三萜类皂苷。四环三萜类物质是以异戊二烯为基本结构单元，其合成符合异戊二烯合成途径。近年来研究表明，植物类异戊二烯的生物合成至少存在2条途径，即甲羟戊酸途径和丙酮酸/磷酸甘油醛途径。大量文献报道，甲羟戊酸途径是皂苷三萜苷元合成必要途径。目前对三萜皂苷的生物合成途径已有一些了解，研究证明三萜皂苷的合成首先通过甲轻戍酸途径合成2, 3-氧化S烯，随后在氧化S烯环化酶(squalene oxidecyclase, 0SC)的作用下形成各种三職类。最后经细胞色素P450、糖基转移酶(GT)和β-糖苷酶的作用，形成各种类型的三萜皂苷(Dong et al.，2005)。三萜皂苷的生物合成途径至少存在两条，一条一般以甲羟戊酸为前体，即甲羟戊酸途径，它在细胞质中进行，并以糖酵解产物乙酰辅酶A作为初供体。留体类和倍半萜化合物通过这一途径合成。主要分为三个阶段①活性异戊二烯单位一异戊烯焦磷酸酯(isopentenyl一pyrophosphate, IPP)和 Y, Y —二甲基丙烯基焦憐酸酯(dimethylallypyrophosphate, DMAPP)的生物合成！②藍烯(squalene)的生物合成及环化；③环上复杂的官能团的反应过程，最后形成完整的三萜皂苷分子。整个三萜皂苷的生物合成过程包括S烯合酶(squalene synthase, 5 )、藍烯环氧酶(squalene epoxidase, 5Z )、法呢基焦憐酸合酶(famesyl pyrophosphate synthase,/7/ )、单加氧化酶(monooxygenase,#(9)、氧化S烯环化酶(oxidosqualene cyelase, flSiC)、羊毛脂留醇合酶(lanosterol synthase,LSS) > β 一香树素合酶(β —Amyrin Synthase, bAS)、环阿屯醇合酶(CyeloartenolSynthase,以50、达玛烧型合酶(dammarenediol synthase,iM )和羽扇豆型合酶(Iupeolsynthase, LS)等一系列酶的催化。其环上官能团的合成主要有细胞色素P45tl(CytoehromeP450)、糖基转移酶(glyeosyltransferase, β 一 glyeosylase)、β — 糖苷酶(β —glyeoside hydrolase, β 一 glyeosidase)等多种酶的催化,使三職的种类更多样化,并形成复杂的糖苷化合物。鲨烯是三萜、留醇、胆固醇等物质生物合成重要的共同前体，是鲨烯合酶5 催化合成的产物。5 在鲨烯后续生物合成支路中处于关键地位。5 所催化的反应在三萜生物合成途径中，位于碳源从类异戊二烯途径流向萜类、留醇合成途径的分支上，是生物合成三萜、留醇、胆固醇等萜烯类重要物质过程中的一个关键酶，其含量和活性决定了后续产物的合成[66]。目前己有酵母(AF092497，AB012604)、小鼠(NM_010191)、大鼠(M95591)、人(L06105，X69141)及 12 科 17 属 41 条植物 5 的 cDNA 序列已在 GenBank登录(至 2008 — 03 一 01), Panax ginseng ABI22078、AB010148, Cen tel la asia ticaAY787628, Artemisia annua AF302464, Arabjdopsis thalisna D29017, Oryza sa tivaAB007501 等。藍烯环氧酶(squalene epoxidase, SQE)是一种单加氧酶,它是三職阜苷生物合成途径中的关键酶之一，其基因所编码的酶可催化鲨烯(squalene)生成2，3_氧化鲨烯。SQE主要作用于单氧态氧化鲨烯生成2，3-氧化鲨烯，2，3-氧化鲨烯是植物体内留体、皂苷、倍半萜等许多萜类衍生物质的合成前体，这些物质在植物的生长发育或抗病过程中具有重要 作用。据目前研究表明，基因在不同物种中均有表达。RNA干扰(RNAi)主要是通过双链RNA的介导，特异性地降解相应序列的靶mRNA，从而阻断相应基因表达，是一种转录后水平的基因沉默方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物双兀表达载体和一种植物双兀干扰表达载体。一种植物双元表达载体pMHZlll，它是将基因插入了基础载体pCLD04541中； 所述的/ 况基因，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. I所示。一种植物双元表达载体pCLD04541_/ f制备方法，它包括
O以克隆载体pHANNIBAL为模板，用引物
Pl :5’ -AGCGAA77TTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3，
P2 :5’ -ATGg^rr^CAATCCAAATGTAAGATC-3，
进行PCR扩增；获得其碱基序列如序列表SEQ ID NO. I所示的基因；插入pMD218T载体中克隆；
2)采用限制性内切酶I分别酶切基础载体PCLD04541和pMD18T_/ f，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。一种植物双元干扰表达载体pMHZlll，它是在PCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 4所示的-5 -说。一种植物双元干扰表达载体pMHZlll - SQE-SA,它是在pCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示的一种植物双元干扰表达载体pMHZl 11 -SQS-SA制备方法，它包括
I)利用Trizol法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，分别用引物 正义基因上游引物(5 -Sl) :5’- TCTAGACTTGACACTGTTGAGGATG- 3’
正义基因下游引物(5 -S2) :5’- GGAr^TTGTAGCCAAATCTTCTGCC- 3’
反义基因上游引物(5 -Α1) :5’- CTtK^TTGACACTGTTGAGGATGA- 3’
反义基因下游引物(5 -A2) :5’_ AAGCTT TCTGTAGCCAAATCTTCTG- 3’克隆5 基因的正义SQS-S及反义片段SQS-A，分别连接到pMD18T上，获得pMD18T-5 -S 和 pMD18T- SQS-A ；
2)采用限制性内切酶I和BeuMI分别酶切一种植物双元表达载体pCLD04541-/ f和pMD18T-5 -^，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接；
3)采用限制性内切酶沿οI和历fli/III分别酶切pMHZlll-5 -S和pMD18T-5^U，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。一种植物双元干扰表达载体pMHZl 11 -SQE-SA制备方法，它包括
1)利用Trizol法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，分别用引物 正义基因上游弓 I 物 iSQE-SI) : 5 ’ -TGCTTT^gJCACTTTTATTAGGGGATGC-3 ’
正义基因下游引物 iSQE-Sl) : 5 ’ -CGCGGAr<XAAGAAGTGGAGAAATAGGC~3，
反义基因上游引物(Χβδ'-ΑΙ) :5’ -CCGCTCGAGCACTITTATTAGGGGATGC-3’
反义基因下游引物 iSQE-k2 ) : 5 ’ -CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3，
克隆货万基因的正义SQE-S及反义片段SQE-A，分别连接到pMD18T上，获得ΡΜ 18 -SQB-S 和 pMD18T_ SQE-A ；
2)采用限制性内切酶I和I分别酶切一种植物双元表达载体pMHZlll和pMDlST-^O^-^，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接；
3)采用限制性内切酶沿οI和历fli/III分别酶切pMHZlll-5^-^和pMDlST-^O^-儿试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。本发明的又一目的是提供一种转基因人参的制备方法。一种转基因人参的制备方法，它包括以人参叶片，制备人参愈伤组织；将一种植物双元干扰表达载体pMHZlll -SQS-SA，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。一种转基因人参的制备方法，它包括以人参叶片，制备人参愈伤组织；将一种植物双元干扰表达载体pMHZl 1，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。本发明提供了一种植物双元表达载体pMHZl 11、植物双元干扰表达载体pMHZl 11-SQS-SA和pMHZl 11 -SQESA,转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，获得了人参主要的药理活性成分，人参皂苷的含量及构成发生了改变的转基因人参植株，为中医药行业提供特殊类型的中药资源。同时也深入地了解了人参皂苷的生物合成途径及其所调控的分子遗传学基础，从而在分子水平上实现皂苷生物合成的人工调控，是发展生物技术大量生产人参皂苷的打下了基础。
图I. 基因PCR扩增结果；
图2 .基础载体pCLD04541图谱；
图3.载体pMHZlll图谱；
图4.基础载体PSLJ1711图谱；
图5.载体pMHZ112图谱；
图6.植物双元表达载体pMHZlll和pSLJ1711-PDK酶切验证；其中，1-5.pMHZlll,6. PDK PCR prodrct,7-1. pSLJ1711-PDK,12. Uncut pMHZlll, 13. UncutPSLJ1711-PDK, 14. λ /Hind III ；
图7. SQS基因正义及反义片段的PCR扩增结果；M: D2000maker; I.水为模板阴性对昭.
2: 5 正义基因片段{SQS-S、;3:5 反义基因片段(鄉-A)；
图 8. pMD18T-5 -S 和 pMD18T-5^U 酶切鉴定结果；M: D2000maker; I.pMD18T-5 -S酶切鉴定结果；2: pMD18T_5O j酶切鉴定结果；
图9. pMHZl 1载体构建策略；
图 10. ρΜΗΖ111-5 -5^ 交叉双酶切结果；M: D2000maker; I. pMHZlll-^-^Xba I /Hind III酶切鉴定结果；2: pMHZlll-^-^ Xho I /BamH I 酶切鉴定结果；·
图11. pMHZlll-^-^人参愈伤组织转化后PCR鉴定结果；
图12.实时定量PCR的电泳检测；1-3:非转化愈伤组织的SQS基因表达量；4_6:阳性愈伤组织的SQS基因表达量；
图13. 5 1基因正义及反义片段的PCR扩增结果；M: D2000maker; I: 5 1正义基因片段iSQE-S) ;2:5 反义基因片段、SQE-A、；
图 14. A φΜ ΙδΤ-Χβδ'-Χ 和 B pMm8T-SQB-A 酶切鉴定结果；
图15. pmZll2-SQE-SA载体构建策略；
图 16. pMHZ112-5^^-5 交叉双酶切结果；M: D2000maker; I. pSLJlTll-PDK-^-^Xba I /Hind III酶切鉴定结果；2: pSLJlTll-PDK-^-^ Xho I /BamH I 酶切鉴定结果；图17. pmZlU-SQB-SA人参愈伤组织转化后PCR鉴定结果。
具体实施例方式实施例I 基因片段的克隆
(1)根据GenBank登录的基因序列(AJ311872.1)，采用Primer 5. O软件设计上下游引物，并引入&oR I酶切位点。上游引物(PDK-PI): 5 ’ -AGCGMZZCTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3 ’
下游引物(PDK-P2 ) : 5 ’ -ATG^MIZ^CAATCCAAATGTAAGATC-3 ’
(2)以克隆载体pHANNIBAL(购自GATEWAY公司)为模板，采用Ex Taq DNA聚合酶对 基因进行PCR扩增。PCR反应体系
权利要求
1.一种植物双元表达载体pMHZlll，它是将基因插入了基础载体PCLD04541中；所述的/ Γ基因，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. I所不。
2.一种植物双元表达载体pCLD04541-/ f制备方法，它包括 O以克隆载体pHANNIBAL为模板，用引物Pl :5’ -AGCG^77CTAGTATAAAATAGTTAAGTG-3，P2 :5’ -ATGG^77TCAATCCAAATGTAAGATC-3， 进行PCR扩增；获得其碱基序列如序列表SEQ ID NO. I所示的基因；插入pMD218T载体中克隆； 2)采用限制性内切酶I分别酶切基础载体PCLD04541和pMD18T_/ f，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。
3.一种植物双元干扰表达载体pMHZlll，它是在pCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 4所示的-SQS-SA。
4.一种植物双元干扰表达载体pMHZlll -，它是在pCLD04541中插入了其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 7所示的-SQE-SA。
5.一种植物双元干扰表达载体pMHZlll制备方法，它包括 1)利用Trizol法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，分别用引物 正义基因上游引物(5 -Sl) :5’- TCTAGACTTGACACTGTTGAGGATG- 3’ 正义基因下游引物(5 -S2) :5’- ^iTtrrGTAGCCAAATCTTCTGCC- 3’ 反义基因上游引物(5 -Α1) :5’- CTtK^TTGACACTGTTGAGGATGA- 3’ 反义基因下游引物(5 -A2) :5’_ AAGCTT TCTGTAGCCAAATCTTCTG- 3’ 克隆5 基因的正义SQS-S及反义片段SQS-A，分别连接到pMD18T上，获得pMD18T-5 -S 和 pMD18T- SQS-A ； 2)采用限制性内切酶I和BeuMI分别酶切一种植物双元表达载体pCLD04541-/ f和pMD18T-5 -^，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接； 3)采用限制性内切酶沿οI和历fli/III分别酶切pMHZlll-5 -S和pMD18T-5^U，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。
6.一种植物双元干扰表达载体pMHZlll制备方法，它包括 1)利用Trizol法提取人参总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，分别用引物 正义基因上游弓 I 物 iSQE-SI) : 5 ’ -TGC7t7HGiCACTTTTATTAGGGGATGC-3 ’ 正义基因下游引物 iSQE-Sl) : 5 ’ -CGCGGAr<XAAGAAGTGGAGAAATAGGC~3， 反义基因上游引物(Χβδ'-ΑΙ) :5’ -CCGCTCGAGCACTITTATTAGGGGATGC-3’ 反义基因下游引物 iSQE-k2 ) : 5 ’ -CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAATAGGC-3， 克隆货万基因的正义SQE-S及反义片段SQE-A，分别连接到pMD18T上，获得ΡΜ 18 -SQB-S 和 pMD18T_ SQE-A ； 2)采用限制性内切酶I和I分别酶切一种植物双元表达载体pMHZlll和pMDlST-^O^-^，试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接； 3)采用限制性内切酶沿οI和历fli/III分别酶切pMHZlll-5^-^和pMDlST-^O^-儿试剂盒回收纯化目的基因，采用T4 DNA连接酶进行连接。
7.—种转基因人参的制备方法，它包括以人参叶片，制备人参愈伤组织；将一种植物双元干扰表达载体pMHZlll- SQS-SA，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。
8. —种转基因人参的制备方法，它包括以人参叶片，制备人参愈伤组织；将一种植物双元干扰表达载体pMHZl1，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，培育人参种苗。
全文摘要
本发明公开了一种植物双元表达载体pMHZ111、植物双元干扰表达载体pMHZ111-SQS-SA和pMHZ111-SQE-SA，转化到农杆菌GV3101中，再将农杆菌GV3101转染人参愈伤组织，获得了人参主要的药理活性成分，人参皂苷的含量及构成发生了改变的转基因人参植株，为中医药行业提供特殊类型的中药资源。同时也深入地了解了人参皂苷的生物合成途径及其所调控的分子遗传学基础，从而在分子水平上实现皂苷生物合成的人工调控，是发展生物技术大量生产人参皂苷的打下了基础。
文档编号C12N15/82GK102888423SQ201210340289
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者张美萍, 王 义, 蒋世翠, 孙春玉, 王康宇, 任丽, 崔学政, 刘天巍, 张洪斌 申请人:吉林农业大学