一种药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系及其制备方法
【专利摘要】本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及一种药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系及其制备方法。该株系首先通过克隆一个硬紫草中的关键转录因子基因(LeMYC)并构建其植物过表达载体，然后将该载体转入发根农杆菌ATCC15834后，侵染硬紫草的无菌苗而获得。该转基因株系所产紫草宁及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草无菌苗所获得的毛状根株系的3.37倍。同时，该株系易于繁殖、生长迅速。本发明不仅可有效解决我国野外硬紫草资源日益短缺、人工栽培周期长、受气候及地理条件等因素制约问题，并且可高效大量生产硬紫草药用天然产物。该高产株系将为利用硬紫草毛状根工厂化生产硬紫草药用天然产物提供材料支撑，具有广阔的开发应用前景。
【专利说明】一种药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系及其制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及一种药用天然产物的硬紫草转基因毛状 根株系及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 紫草属紫草科多年生草本植物，为药典收载临床常用传统中药。1990年以后的 《中华人民共和国药典》中收录了紫草科（Boraginaceae)3种植物，即软紫草属（Arnebia Forsk)的新疆紫草[A. euchroma (Royle) Johnst.]，主产地为新疆；蒙紫草（黄花软紫 草，A. guttata Bunge)，分布于我国西北至华北地区；紫草属（Lithospermum)的硬紫草 (Lithospermum erythrorhizon)，在我国分布车交广。漬紫草（Onosma paniculatum Bur. et Franch)在云南也常作紫草入药。
[0003] 紫草的活性成分主要分布于根，因而药用价值最高，被称为绿色黄金，成为行销海 内外的"道地药材"，其主要活性成分紫草素亦称紫草宁及其衍生物为萘醌类化合物，具有 抗免疫缺血、抗肿瘤，治疗风湿性关节炎、多硬化症、艾滋病、过敏性紫癜、银肩病以及保肝 护肝、降血糖、降血粘度、降压、解热、镇痛止痛等功效；多糖能增强机体特异性和非特异性 免疫能力；紫草油具有治疗烧伤、烫伤、急慢性脓耳、口腔溃疡、褥疮、痔疮、急慢性湿瘆以及 促进伤口愈合等功效；紫草色素具有抗真菌作用，可作为生物毒素用于番茄叶霉病的防治。 此外紫草素还可作为天然色素，被联合国食品添加剂法典委员会列入食品、化妆品、药品添 加剂范围，广泛用于化妆品、防晒制品（如塑料制品）、食品、药品等着色以及印染、洗涤剂 的添加剂等，被国际誉为红色素之王。紫草根油可直接入药，制成软胶囊可达药用标准，籽 油具降糖、降压、降血脂等功效，还可作工业用油。因此，紫草已逐渐成为医疗、食品色素和 化妆品及防病治病开发新药研宄的热点。
[0004] 随着现代生物技术的发展，采用植物基因工程技术生产并提高人类所需的紫草 宁，成为一种非常重要的替代手段。上世纪70年代，日本即已成功运用两阶段培养体系，即 在光照条件下B5固体培养基上繁殖紫草细胞，然后在黑暗条件下利用M9液体生产培养基 中培养紫草细胞进行工业化生产紫草宁。然而在植物细胞培养过程中普遍存在细胞系不稳 定细胞生长缓慢，不耐剪切及代谢物产量低等问题又成为其实现规模化生产的瓶颈。
[0005] 紫草毛状根体系的建立可为大量生产天然活性物质提供有效的手段。发根农杆菌 (Agrobacteriumrhizogenes)是属于根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，能侵染绝大多数双 子叶植物和少数单子叶植物诱发被侵染植物受伤部位产生毛状根。发根农杆菌之所以具有 这种致根特性是由于它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒，Ri质粒是发根农杆菌染色体外 的一个大质粒，带有冠瘿碱合成基因和生长素合成基因。毛状根培养是较细胞培养产生天 然产物具有更优越的实验材料。此外，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到 寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛 状根体系，提高毛状根中次生代谢物的产量，在定向植物分子育种方面具有广泛应用前景。 近年来利用发根农杆菌已转化大约160多种植物，在40多种植物建立了毛状根培养体系， 特别是一些药用植物建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用天然产物生产及遗传育 种研宄。
[0006] 具有bHLH结构域的MYC蛋白是调节植物次生代谢物合成的一类重要转录因子，通 常又称bHLH转录因子。它们在调节玉米、拟南芥、各种观赏植物及园艺植物花青素的生物 合成方面具有重要作用。如玉米中编码bHLH转录因子的基因R1具有调节谷粒糊粉层着色， 调节花药及胚芽鞘着色功能。拟南芥中参与调控花青素合成的bHLH蛋白主要包括TT8、GL3 和EGL3,通过调节花青素原代谢途径中的DFR和ANS/LDOX的表达而促进花青素原的合成。 各种观赏植物及园艺植物花青素的合成也是受bHLH转录因子调控的，如非洲菊（Gerbera hybrida) GMYC1编码的bHLH蛋白调节花冠和心皮中DFR的表达促进花青素的合成。bHLH 蛋白通常与R2R3类MYB转录因子和WD40蛋白形成转录复合体MBW共同调节花青素代谢途 径中各种酶基因的表达，进而促进花青素等苯丙素类化合物的合成。
[0007] 本课题组在前期工作中对在M9培养基上生产紫草宁及其衍生物的紫草细胞转录 组深度测序发现一个高丰度的具有编码bHLH结构域的转录本，结合文献的相关报道，我们 推测bHLH转录因子可能在紫草宁及其衍生物的合成调节方面具有重要作用。
[0008] 通过转基因技术将紫草本身的MYC基因转入紫草中过表达，提高紫草毛状根中紫 草宁的含量，从中筛选出高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，在理论上是完全 可行的。
[0009] 通过转基因技术获得高产药用天然产物的紫草毛状根株系，不仅在系统研宄紫草 药用天然产物生物合成途径及其分子调控机制方面具有重要的理论意义，并在商业化生产 紫草药用天然产物方面具有非常重要的应用前景和价值。尽管目前国内外有利用毛状根为 材料对紫草宁合成调控进行的相关研宄，但并无将紫草bHLH类MYC蛋白的相关基因转入发 根农杆菌，诱导出能高效合成紫草药用天然产物的紫草转基因毛状根并藉此提高紫草宁合 成的相关报道。
【发明内容】
[0010] 本发明需要解决的问题是通过转基因技术获得一个高产药用天然产物的硬紫草 转基因毛状根株系及其制备方法。本发明根据实验室前期M9培养基上生产紫草宁及其 衍生物的紫草细胞转录组深度测序信息，通过RACE技术（rapid amplification of cDNA ends)克隆出具有bHLH结构域的LeMYC转录因子基因（基因登录号N0.KC818627)，将所选 择的LeMYC基因构建植物过表达载体并转入发根农杆菌，然后侵染硬紫草无菌苗，高效诱 导出含目的基因LeMYC的硬紫草毛状根株系，对获得的转基因毛状根扩大培养并进行分子 鉴定和药用天然产物含量检测。
[0011] 本发明所述硬紫草转基因毛状根株系的制备方法包括如下步骤：
[0012] (1)提取在M9紫草宁色素生产培养基上紫草细胞总RNA并反转录为cDNA作为模 板，根据实验室前期M9培养基上生产紫草宁及其衍生物的紫草细胞转录组深度测序信息 设计引物，通过RACE技术克隆出具有bHLH结构域的LeMYC转录因子基因的全长序列。高 保真酶扩增目的基因LeMYC，将获得的目的片段与真核表达载体pEGAD-eGFP (购自北京天 根生化科技有限公司）连接，将连接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC15834(购自北京中 国农业微生物菌种保藏管理中心）感受态细胞；挑取阳性克隆。
[0013] (2)将硬紫草种子表面清洗干净，低温浸泡在自来水中两天，此间换水2-3次，然 后用湿砂和种子混匀后放入4°C冰箱层积处理1个月左右，种子出芽后，用自来水冲洗掉沙 子，用0. 1 %升汞消毒发芽的种子5分钟，然后用无菌水冲洗5-7次，将水空干接种在1/2MS 无激素的固体培养基上于25°C，16小时光照8小时暗培养2周。待幼苗长至2-4cm高度并 伸展出第2-3对真叶时用作被侵染材料。
[0014] (3)转基因侵染菌液制备：挑取阳性克隆菌落，用YEB液体培养基扩增至0D600 = 0. 8时，添加乙酰丁香酮（AS)，作为转基因侵染菌液。
[0015] (4)针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根：用无菌针浸蘸上述活化的具有侵染特 性的菌液，用针尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2对真叶的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，穿刺茎 节处一下，共穿刺2-3次。然后将侵染的幼苗转移到MS固体培养基上于25°C弱散射光培 养。针刺一周左右即可发现侵染部位出现白色突起，随后在侵染部位的白色突起首先变成 绒毛状，然后长出一条或多条白色的毛状根。将诱发的毛状根从侵染点部位剪切下来，培养 在含有头孢霉素500mg/L的B5培养基上，每周转接一次，直至除完菌后，移到不含抗生素B5 培养基上培养。
[0016] (5)硬紫草转基因毛状根的培养：将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基扩大培 养；将固体扩大培养的毛状根转入B5液体培养基扩大培养。
[0017] (6)转基因毛状根分子鉴定：取野生型和预计为转基因毛状根材料提取其DNA作 为模板，运用PCR方法同时检测农杆菌Ri质粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因， 判断是否为硬紫草转基因毛状根。
[0018] (7)紫草宁合成及测定：将鉴定的转基因紫草毛状根经B5液体生长培养15天后 转入M9生产紫草宁液体培养基，置于26°C黑暗培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓 度；用石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫草宁的M9液体，提取紫草宁，紫外分光光度计测定 紫草宁含量，以野生型紫草毛状根（只用不含外源基因的ATCC15834侵染而获得的硬紫草 毛状根）为对照，计算转基因毛状根中紫草宁含量变化。
[0019] 本发明与现有技术相比，其有益效果是：
[0020] 如前所述，野生紫草资源的日益匮乏及缺乏真正高效的人工合成紫草宁的培养体 系，已经成为紫草宁药用研宄及大量商业化应用的一个制约因素。至今未见通过诱导出转 入LeMYC基因的毛状根，藉此提高紫草宁合成产量的相关文献报道。本发明首次将一个紫 草bHLH类MYC家族蛋白的关键转录因子基因LeMYC转入植物表达载体，将该载体转入发根 农杆菌后再转入紫草无菌苗，诱导出紫草转基因毛状根；获得的硬紫草转基因毛状根中紫 草宁含量较野生型紫草毛状根大大提高。该方法可克服紫草愈伤细胞诱导、培养困难，细胞 易于老化褐化、紫草宁产量不高、产量不稳定、夏季难产或不产紫草宁等诸多问题；解决了 利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长，转化效率偏低等问题，转基因毛状根诱导和繁 殖不受外界环境、季节和紫草花期等因素制约，大大提高紫草转基因效率；转入的LeMYC基 因有助于紫草药用天然产物合成的分子调控机制研宄，对紫草功能基因鉴定和研宄及植物 分子育种具有重要指导意义，对其他转基因困难的木本植物提供了可靠的借鉴方法；获得 的转基因毛状根紫草宁高产株系，具有广阔的开发应用前景和商业价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1用RACE技术克隆LeMYC基因的全长序列
[0022] 图2针刺茎节法诱导出的转LeMYC基因的硬紫草毛状根
[0023] 图3转基因毛状根在B5固体培养基培养
[0024] 图4转基因毛状根在B5液体培养基培养
[0025] 图5转LeMYC基因硬紫草毛状根RolC基因，35S-eGFP-LeMYC融合基因检测
[0026] 图6转基因毛状根在M9液体培养基培养
[0027] 图7转基因毛状根紫草宁及其衍生物含量测定及比较
【具体实施方式】
[0028] 实施例1、LeMYC基因全长序列克隆及载体构建
[0029] (l)LeMYC基因全长序列克隆：基于硬紫草细胞两阶段培养即在B5培养基上细 胞增殖生长和在M9培养基上生产紫草素，我们对M9细胞的转录组进行了深度测序发现 存在一条与MYC基因高度保守的cDNA片段，序列长度为1653bp。根据这一序列信息我们 设计了用于 3' RACE 与 5' RACE 的引物。3' RACE FI :TCTATGCTCTTAGAGCAGTAGITCC ;3' RACE F2 ：TTCAGCTCCACCAACATCGCGTGGG ；5'RACE FI ：AAAGTGCCTGACCCGGAAGCCCGG ；5'RACE F2 ： TTCTTGCTCAGCCATGAAGGCAGG.利用该引物和试剂盒中的相应引物进行末端巢式PCR扩增， 分别得到该基因的5'和3'的基因片段大小分别为483bp、480bp (图1)，经克隆测序后得到 了该基因的全长序列命名为LeMYC，基因的0RF框为191 lbp，编码636个氨基酸。
[0030] ⑵过表达载体构建：根据已克隆的紫草LeMYC 5'和3'序列设计克隆该基因 的全长序列引物 LeMYC-ORF-F :5' -ATGATGAACTTCTGGAACAATACTACACC-3' ；LeMYC-〇RF-R : 5' -TTAGGCAGTTTCGGCTACTCTTGATGTC-3'，高保真酶扩增目的片段；将获得的目的片段切胶 回收，并与pEGAD-eGFP载体连接，构建pEGAD-eGFP-LeMYC质粒；将pEGAD-eGFP-LeMYC质粒 用冻融法转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞，挑取阳性克隆。
[0031] 实施例2、转硬紫草LeMYC基因毛状根的诱导
[0032] (1)硬紫草无菌苗培养：选取饱满的硬紫草种子，无菌水清洗后置于4°C环境中 黑暗培养1-2个月，直至种子发芽；挑取刚发芽的种子，清水洗干净；用0. 1 %的升汞消毒 5min，再用无菌水清洗5-7次；置于MS基本培养基，26°C -28°C光照培养，获得一定数量的 紫草无菌苗。一个月后，当紫草无菌苗长出两片真叶后，作为诱导毛状根的外植体。
[0033] (2)转基因侵染菌液制备：将获得的阳性克隆菌落，转入YEB液体培养基，在 26-28°C，lOOrpm的摇床中扩增至0D600 = 0. 8时，添加100 y M的AS，作为转基因侵染菌液。
[0034] (3)针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根：用接种针蘸上述活化的具有侵染特性 的转基因菌液，用针尖穿刺紫草无菌苗的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，刺茎节处一下，每 株共穿刺2-3次；将侵染的无菌苗转移到MS固体培养基上于26°C黑暗培养。10-15天左右 即可发现侵染部位出现白色突起，2天后在侵染部位的白色突起长出绒毛状根系，然后长出 一条或多条毛状根（图2);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法， 诱导出紫草野生型毛状根，作为对照材料。
[0035] 实施例3、转硬紫草LeMYC基因毛状根的培养
[0036](1)毛状根除菌培养：诱导出来的毛状根经过一星期的生长，剪取长度约1cm的毛 状根，转入B5+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入B5+250mg/L头孢霉 素，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基培养（图3);
[0037] (2)毛状根扩大培养：将固体扩大培养的毛状根转入B5液体培养基，lOOrpm的摇 床中光照扩大培养（图4)。
[0038] 实施例4、转硬紫草LeMYC基因毛状根的鉴定
[0039] 取一定数量毛状根，CTAB法提取毛状根DNA为模板，设计检测RolC与 35S-eGFP-LeMYC融合基因的引物分别为RolC-F:5' -ACAAGCCACTTCTGITTCCC-3' ；RolC-R: 5' -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3'，CaMV35S-F:5'-CACTATCCTTCGCAAGACCCT-3' ；LeMYC-R-115 7:5' -ATCTCCCCTTCACCTCCAAATACTG-3'用PCR方法扩增，扩增产物测序比对，检测转基因毛 状根中农杆菌Ri质粒中RolC基因存在与否，随机选取的3个扩大培养硬紫草毛状根株系， 均检测到RolC基因的存在，说明获得的均为毛状根；同时检测35S-eGFP-LeMYC融合基因 (图5)，表明用含有构建载体的发根农杆菌侵染紫草获得的毛状根为转基因毛状根。
[0040] 实施例5、转硬紫草LeMYC基因毛状根紫草宁含量测定
[0041] (1)将验证为转入目的基因的转基因硬紫草毛状根及野生型毛状根转入M9液体 培养基，置于26°C、100rpm的摇床中黑暗培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓度（图 6) 〇
[0042] (2)用石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫草宁的M9液体，提取紫草宁，紫外分光光 度计测定紫草宁含量，以野生型紫草毛状根为对照，计算转基因毛状根中紫草宁含量含量 (图7)。紫草宁含量总量包括紫草细胞或毛状根和分泌到M9培养基中的紫草宁含量总和。 具体方法如下：称取在M9培养体系中的毛状根，并取含有分泌的紫草宁的M9培养基，用石 油醚浸泡，反复提取紫草宁，直到提取液无色，合并提取液，紫外分光光度计测定0D520的 吸光值，由下列方程得到紫草宁含量：紫草宁含量（mg/gFW) = 41. 66X0D520X稀释倍数。
[0043] (3)紫草宁含量测定显示，所得到的这一个转LeMYC基因的硬紫草毛状根中紫草 宁含量比野生型毛状根中的含量提高3. 37倍，而且该株系具有生长速度快、繁殖容易的特 点，适于商业化生产所用，命名为LeMYC-1ine-001。
【权利要求】
1. 一种药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，其特征是硬紫草转LeMYC基因毛状 根株系。
2. 根据权利要求1所述药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系的制备方法，其特征 是由以下步骤构成： (1) 提取在M9紫草宁色素生产培养基上紫草细胞总RNA并反转录为cDNA作为模板，通 过RACE技术克隆出具有bHLH结构域的LeMYC转录因子基因的全长序列。高保真酶扩增目 的基因 LeMYC，将获得的目的片段与真核表达载体pEGAD-eGFP连接，将连接产物用冻融法 转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞，挑取阳性克隆； (2) 将硬紫草种子表面清洗干净，低温浸泡在自来水中两天，此间换水2-3次，然后 用湿砂和种子混匀后放入4°C冰箱层积处理1个月，种子出芽后，用自来水冲洗掉沙子，用 0. 1 %升汞消毒发芽的种子5分钟，然后用无菌水冲洗5-7次，将水空干接种在1/2MS无激 素的固体培养基上于25°C，16小时光照8小时暗培养2周，待幼苗长至2-4cm高度并伸展 出第2-3对真叶时用作被侵染材料； (3) 转基因侵染菌液制备：挑取阳性克隆菌落，用YEB液体培养基扩增至0D600 = 0. 8 时，添加乙酰丁香酮，作为转基因侵染菌液； (4) 针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根：用无菌针浸蘸上述活化的具有侵染特性的 菌液，用针尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2对真叶的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，穿刺茎节处 一下，共穿刺2-3次，然后将侵染的幼苗转移到MS固体培养基上于25°C弱散射光培养。针 刺一周即可发现侵染部位出现白色突起，随后在侵染部位的白色突起首先变成绒毛状，然 后长出一条或多条白色的毛状根，将诱发的毛状根从侵染点部位剪切下来，培养在含有头 孢霉素500mg/L的B5培养基上，每周转接一次，直至除完菌后，移到不含抗生素 B5培养基 上培养； (5) 硬紫草转基因毛状根的培养：将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基扩大培养， 将固体扩大培养的毛状根转入B5液体培养基扩大培养； (6) 转基因毛状根分子鉴定：取野生型和预计为转基因毛状根材料提取其DNA作为模 板，运用PCR方法同时检测农杆菌Ri质粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因，判断 是否为硬紫草转基因毛状根； (7) 紫草宁合成及测定：将鉴定的转基因紫草毛状根经B5液体生长培养15天后转入 M9生产紫草宁液体培养基，置于26°C黑暗培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓度，用 石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫草宁的M9液体，提取紫草宁，紫外分光光度计测定紫草宁 含量，以野生型紫草毛状根即不含外源基因的ATCC15834侵染而获得的硬紫草毛状根为对 照，计算转基因毛状根中紫草宁含量变化。
【文档编号】C12Q1/68GK104450772SQ201410657429
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】杨永华, 赵胡, 戚金亮, 吴凤瑶, 朱煜, 杨荣武, 庞延军 申请人:南京大学