一个高产药用天然产物的硬紫草转LeMYB1基因毛状根株系的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个能高产紫草药用天然产物(紫草宁及其衍生物)的硬紫草转LeMYB1基因毛状根株系。该株系通过构建一个受茉莉酸甲酯高效诱导表达的关键转录因子基因LeMYB1的植物过表达载体，然后将该载体转入发根农杆菌ATCC15834后，侵染硬紫草的无菌苗而获得。该株系易于繁殖、生长迅速，所产紫草宁及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草无菌苗所获得的毛状根株系的2.88倍。本发明不仅可有效解决我国硬紫草资源的日益短缺、人工栽培周期长、受气候及地理条件制约等问题，并且可高效大量生产硬紫草药用天然产物。该高产株系将为利用硬紫草毛状根工厂化生产硬紫草药用天然产物提供材料支撑，具有广阔的开发应用前景。
【专利说明】一个高产药用天然产物的硬紫草转LeMYBI基因毛状根株系
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物【技术领域】，涉及将携带编码转录因子基因的植物表达载体转入发根农杆菌，然后再侵染硬紫草无菌苗而诱导出高产药用天然产物的转基因毛状根株系O
【背景技术】
[0002]紫草属紫草科多年生药用草本植物，主要包括新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.) > 内蒙紫草(Arnebia guttata Bunge.)、硬紫草(Lithospermumerythrorhizon Sieb.et Zucc)和漠紫草(Onosma paniculatum Bur.et Franch)等。其根系可产生紫草宁及其衍生物等药用天然产物活性成分，具有抗免疫缺血、抗肿瘤，治疗风湿性关节炎、多硬化症、艾滋病、过敏性紫癜、银屑病以及保肝护肝、降血糖、降血粘度、降压、解热、镇痛止痛等功效[1_4]。另外，紫草的多糖成分能增强机体特异性和非特异性免疫能力；紫草油具有治疗烧伤、烫伤、急慢性脓耳、口腔溃疡、褥疮、痔疮、急慢性湿疹以及促进伤口愈合等功效[5_7]。紫草色素的抗真菌作用还可作为生物毒素用于番茄叶霉病的防治[8’9]。此外，紫草素还可作为天然色素，被联合国食品添加剂法典委员会列入食品、化妆品、药品添加剂范围，广泛用于化妆品、防晒制品(如塑料制品)、食品、药品等着色以及印染、洗涤剂的添加剂等，被国际誉为红色素之王[1°_12]。因此，紫草已逐渐成为医疗、食品色素和化妆品及防病治病开发新药研究的热点。
[0003]随着现代生物技术的发展，采用细胞培养工程技术生产并提高人类所需的紫草宁及其衍生物，成为一种非常重要的生物技术手段。上世纪70年代，日本即已成功运用两阶段培养体系，即在光照条件下B5固体培养基上繁殖紫草细胞，然后在黑暗条件下利用M9液体生产培养基中培养紫草细胞进行工业化生产紫草宁[13]。然而在植物细胞培养过程中普遍存在细胞系不稳定，细胞生长缓慢，不耐剪切及代谢物产量低等问题，成为其实现规模化生产的瓶颈。
[0004]毛状根体系的建立可为大量生产天然活性物质提供有效的手段。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是属于根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌,能侵染绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物，诱发被侵染植物受伤部位产生毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根特性是由于它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒，Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个大质粒，带有冠瘿碱合成基因和生长素合成基因。毛状根培养是较细胞培养产生天然产物更优越的实验材料M。此外，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，提高毛状根中次生代谢物的产量，在定向植物分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已成功转化多种药用植物并建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用天然产物得生产及遗传育种研究。
[0005]茉莉酸是一种能调控植物生长发育、抗逆境、创伤胁迫反应及植物次生代谢合成等多个生理过程的激素。茉莉酸类物质能诱导植物细胞生产更多的次生代谢产物，如茉莉酸可诱导植物产生尼古丁、芥子油苷、苜蓿碱、异类黄酮等生物碱和酚酸类次生代谢产物。紫草宁同样受到茉莉酸及其甲酯类衍生物的高效诱导合成[15_17]。在茉莉酸类物质调节植物次生代谢产物合成中的过程中，转录因子起到相当重要的作用。
[0006]在本实验室室前期研究外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导紫草宁合成的功能蛋白质组学过程中，我们发现了一个受到外源MeJA诱导表达的R2R3类MYB转录因子蛋白，结合其他植物中已有的对R2R3类MYB转录因子的研究结果_，推测其很可能参与介导了 MeJA促进紫草宁及衍生物合成的生物学过程。
[0007]紫草的LeMYBl是本实验室克隆的一个编码R2R3类MYB转录因子蛋白基因[19]。紫草细胞从B5转入M9中后，LeMYBl受诱导表达，且受到MeJA的高效调控；而且该基因在紫草根部(紫草宁合成的特异性部位)高表达，推测该基因参与茉莉酸介导的对紫草宁的合成调控[19]。
[0008]通过转基因技术将紫草本身的LeMYBl基因转入紫草中过表达，提高紫草毛状根中紫草宁的含量，从中筛选出高产药用天然产物的硬紫草转基因毛状根株系，在理论上是完全可行的。
[0009]通过转基因技术获得高产药用天然产物的紫草毛状根株系，不仅在系统研究紫草药用天然产物生物合成途径及其分子调控机制方面具有重要的理论意义，并在商业化生产紫草药用天然产物方面具有非常重要的应用前景和价值。尽管目前国内外有利用毛状根为材料对紫草宁合成调控进行的相关研究，但并无将紫草R2R3类MYB蛋白的相关基因转入发根农杆菌，诱导出能高效合成紫草药用天然产物的紫草转基因毛状根并藉此提高紫草宁合成的相关报道。
【发明内容】
[0010]本发明需要解决的问题是通过转基因技术获得一个高产药用天然产物(紫草宁及其衍生物)的硬紫草转基因毛状根株系，主要是通过将所选择的LeMYBl基因构建植物过表达载体并转入发根农杆菌ATCC15834，然后侵染硬紫草无菌苗，诱导出含目的基因的硬紫草转基因毛状根，对获得的转基因毛状根扩大培养并进行分子鉴定和药用天然产物含量测定。
[0011]本发明的技术方案包括如下步骤:
[0012](I)将硬紫草种子表面清洗干净，低温浸泡在自来水中两天，期间换水2-3次，然后用湿砂和种子混匀后放入4°C冰箱层积处理约I个月左右，种子出芽后，用自来水冲洗掉沙子，用0.1 %升汞消毒发芽的种子5分钟，然后用无菌水冲洗5-7次，将水吸干后接种在1/2MS无激素的固体培养基上于25°C，16小时光照8小时黑暗培养2周。待幼苗长至2_4cm高度并伸展出第2-3对真叶时用作被侵染材料。
[0013](2)转基因侵染菌液制备:高保真酶扩增目的基因LMYB1，将获得的目的片段与真核表达载体pBI121-eGFP连接，将连接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞；挑取阳性克隆，用YEB液体培养基扩增至0D600 = 0.8时，添加乙酰丁香酮(AS)，作为转基因侵染菌液。
[0014](3)针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根:用无菌针浸蘸上述活化的具有侵染特性的菌液，用针尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2对真叶的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，穿刺茎节处一下，共穿刺2-3次。然后将侵染的幼苗转移到MS固体培养基上于25°C弱散射光培养培养。针刺一周左右即可发现侵染部位出现白色突起，随后在侵染部位的白色突起首先变成绒毛状，然后长出一条或多条白色的毛状根。将诱发的毛状根从侵染点部位剪切下来，培养在含有头孢霉素500mg/L的B5培养基上，每周转接一次，直至彻底除菌后，移到不含抗生素的B5培养基上扩大培养。
[0015](4)硬紫草转基因毛状根的液体培养基培养:将固体扩大培养的毛状根转入B5液体培养基扩大培养。
[0016](5)转基因毛状根分子鉴定:提取野生型和转基因毛状根材料的DNA，运用PCR方法同时检测农杆菌Ri质粒中RolC基因和35S-LeMYBl-GFP融合基因，判断硬紫草转基因毛状根是否为真正的转基因株系。
[0017](6)紫草宁合成及测定:将鉴定的转基因紫草毛状根经B5液体生长培养基培养15天后转入M9生产紫草宁液体培养基，置于26°C黑暗条件下摇动培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓度；用石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫草宁的M9液体，提取紫草宁及其衍生物，紫外分光光度计测定含量，以野生型紫草毛状根(只用不含外源基因的ATCC15834侵染而获得的硬紫草毛状根)为对照，计算转基因毛状根中紫草宁含量变化。
[0018]本发明与现有技术相比，其有益效果是:
[0019]如前所述，野生紫草资源的日益匮乏及缺乏真正高效的人工合成紫草宁及其衍生物的培养体系，已经成为紫草宁药用研究及商业化应用的一个制约因素。至今未见通过诱导出转入LeMYBl基因的毛状根，藉此提高紫草宁及其衍生物产量的相关文献报道。本发明首次将一个紫草R2R3类MYB家族蛋白的关键转录因子基因LeMYBl转入植物表达载体，将该载体转入发根农杆菌后再转入紫草无菌苗，诱导出紫草转基因毛状根；获得的硬紫草转基因毛状根中紫草宁含量较野生型紫草毛状根显著提高。该方法可克服紫草愈伤细胞诱导、培养困难，细胞易于老化褐化、紫草宁产量不高、产量不稳定、夏季难产或不产紫草宁等诸多问题；解决了利用愈伤细胞进行遗传转化存在的技术难度高、周期长、转化效率偏低等问题，转基因毛状根诱导和繁殖不受外界环境、季节等因素制约，大大提高了紫草转基因效率；转入的LeMYBl基因有助于紫草药用天然产物合成的分子调控机制研究，对紫草功能基因鉴定和研究及植物分子育种具有重要指导意义，对其他转基因困难的木本植物提供了可靠的借鉴方法；获得的紫草宁高产转基因毛状根株系具有广阔的开发应用前景和商业价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1针刺茎节法诱导出的转LeMYBl基因的硬紫草毛状根
[0021]图2转LeMYBl基因毛状根在B5固体培养基中培养
[0022]图3转LeMYBl基因毛状根在B5液体培养基中扩大培养
[0023]图4转LeMYBl基因毛状根RolC基因、35S_LeMYBl-GFP-R融合基因的检测
[0024]图5转LeMYBl基因毛状根在M9液体培养基中培养时大量产生药用天然产物(紫草宁及其衍生物)
[0025]图6转LeMYBl基因毛状根与野生型毛状根中紫草宁及其衍生物含量的测定及比较
【具体实施方式】
[0026]实施例1、硬紫草转LeMYBl基因毛状根的诱导
[0027](I)硬紫草无菌苗培养:选取饱满的硬紫草种子，无菌水清洗后置于4°C环境中黑暗培养1-2个月，直至种子发芽；挑取刚发芽的种子，清水洗干净；用0.1 %的升汞消毒5min，再用无菌水清洗5-7次；置于MS基本培养基，26°C _28°C光照培养，获得一定数量的紫草无菌苗。一个月后，当紫草无菌苗长出两片真叶后，作为诱导毛状根的外植体。
[0028](2)过表达载体构建及转基因侵染菌液制备:根据本实验室已克隆的紫草LeMYBl序列(Genbank Access1n N0.KC818628)设计引物 LeMYBl-OM-F:5' -GACTCTAGAATGGTGAGAGCACCATGTTGTG-3 ' ；LeMYB1-OM-R:5 ' -GGTGGATCCCGGGCCCGCTACTGATTTTCCAGC-3 ',高保真酶扩增目的片段；将获得的目的片段切胶回收，并与pBI121-eGFP载体连接，构建PB 1121 -LeMYB 1-eGFP质粒；将pB 1121 -LeMYB I _eGFP质粒用冻融法转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞；挑取阳性克隆，转入YEB液体培养基，在26_28°C，10rpm的摇床中扩增至0D600 = 0.8时，添加100 μ M的AS，作为转基因侵染菌液。
[0029](3)针刺茎节法诱导硬紫草转基因毛状根:用接种针蘸上述活化的具有侵染特性的转基因菌液，用针尖穿刺紫草无菌苗的茎节处，针尖每浸蘸菌液一次，刺茎节处一下，每株共穿刺2-3次；将侵染的无菌苗转移到MS固体培养基上于26°C黑暗培养。一周左右即可发现侵染部位出现白色突起，2天后在侵染部位的白色突起长出绒毛状根系，然后长出一条或多条毛状根(图1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法，诱导出紫草野生型毛状根 ，作为对照材料。
[0030]实施例2、硬紫草转LeMYBl基因毛状根的培养
[0031](I)毛状根除菌培养:诱导出来的毛状根经过一星期的生长，剪取长度约Icm的毛状根，转入B5+500mg/L头孢霉素的固体培养基除菌，再过一星期转入B5+250mg/L头孢霉素，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基扩大培养(图2)；
[0032](2)毛状根液体培养基扩大培养:将固体扩大培养的毛状根转入B5液体培养基，10rpm的摇床中光照扩大培养(图3)。
[0033]实施例3、硬紫草转LeMYBl基因毛状根的分子鉴定
[0034]取一定数量毛状根，提取毛状根DNA，设计检测RolC与35S-LeMYB1-eGFP融合基因的引物分别为 RolC-F:5’ -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3’ ；RolC-R:5’ -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3’，35S-F-50:5/ -CACTATCCTTCGCAAGACCCT-3' ；GFP-R-100:5' -GCTGAACTTGTGGCCGTTT-3'，用PCR方法扩增，扩增产物测序比对，检测毛状根中农杆菌Ri质粒中RolC基因存在与否，野生型和转LeMYBl基因毛状根均检测到RolC基因的存在，说明获得的均为毛状根；但35S-LeMYBl-GFP-R融合基因只在转LeMYBl基因毛状根中检测到(图4)，表明其确实为转LeMYBl基因的毛状根。
[0035]实施例4、硬紫草转LeMYBl基因毛状根紫草宁含量测定
[0036](I)将硬紫草转LeMYBl基因毛状根及野生型毛状根转入M9液体培养基，置于260CUOOrpm的摇床中黑暗培养，一周后紫草宁含量即可达到很高浓度(图5);
[0037](2)用石油醚浸泡紫草毛状根及含有紫草宁及其衍生物的M9液体，紫外分光光度计测定含量，以野生型紫草毛状根为对照，计算转LeMYBl基因毛状根中紫草宁含量(图6)。紫草宁含量总量包括紫草细胞或毛状根和分泌到M9培养基中的紫草宁及其衍生物含量总和。具体方法如下:称取在M9培养体系中的毛状根，并取含有分泌的紫草宁及其衍生物的M9培养基，用石油醚浸泡，反复提取，直到提取液无色，合并提取液，紫外分光光度计测定0D520的吸光值，由下列方程得到紫草宁及其衍生物含量:含量(mg/gFW)=41.66X0D520X 稀释倍数。
[0038](3)紫草宁及其衍生物含量测定显示，所得到的这一个转LeMYBl基因的硬紫草毛状根(0M3)中紫草宁含量比野生型毛状根中的含量提高2.88倍，而且该株系具有生长速度快、繁殖容易的特点，适于商业化生产所用，命名为LeMYB 1-0M3。
[0039]参考文献
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【权利要求】
1.一个高产药用天然产物(紫草宁及其衍生物)的硬紫草转LeMYBl基因毛状根株系。
2.权利要求1中所 述的硬紫草转基因高产株系的商业化应用。
【文档编号】C12N15/82GK104178510SQ201410366272
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】戚金亮, 杨永华, 赵胡, 方荣俊, 赵华, 韩秋敏, 朱煜, 吴凤瑶, 张东霞, 葛素囡, 王小明, 陆桂华, 杨荣武 申请人:南京大学