一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法。
【背景技术】
[0002]紫草，别名:硬紫草、软紫草。是中国药典收录的草药，药用来源为紫草科植物新疆紫草、紫草或内蒙紫草的干燥根。紫草根中最重要的是紫草萘醌类化合物，主要包括紫草素，乙酰紫草素，β，β_ 二甲基丙烯酰紫草素，异戊酰紫草素，异丁酰紫草素等，其中β，β -二甲基丙烯酰紫草素含量最高，乙酰紫草素次之，紫草素含量最低。紫草萘醌类化合物已被美国国家癌症研究所确定为具有抗肿瘤活性的物质，具有广发的生物活性包括:抗菌、抗艾滋病、促进烧伤创口愈合、抗肿瘤等，备受研究者关注。紫草素是这类化合物的典型代表。
[0003]目前紫草素提取方法有超临界C02萃取的方法、溶机溶剂提取法，其中超临界C02萃取法设备成本高，较难工业化大生产，如公开号CN1334103A、CN1556087A等中国专利；溶机提取法紫草素收率低，杂质多，其他紫草素酯化衍生物无法利用；有专利报强碱水解法，如公开号CN103373913A、CN 1607199Α、CN 1607199 A的专利，实现了紫草素酯化衍生物水解转化提取紫草素，但在强碱溶液中，处理时间过长，紫草素容易出现降解和异构化等问题，导致副产物多，纯化难度加大，产品纯度不高。因此近年来，高纯度的紫草素价格依然很高，在我国中药国际化战略下，无法适应新药开发和国际化推广的需要。本发明要解决的问题是提供一种可以产业化从紫草中制备高纯度紫草素的方法。
[0004]离子液体(1nic liquids)是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的液体。离子液体作为离子型化合物一般由有机阳离子和无机阴离子组成。由于离子液体本身所具有很多的物理和化学性质，与有机溶剂相比，离子液体获得了 “绿色”溶剂的称呼，被广泛应用于催化化学、有机反应、高分子合成、有报道表明，以离子液作为介质，许多反应可取得较分子溶剂更好的结果，如:高的反应速率，好的选择性，催化剂更温和，可循环使用等。目前尚无文献和专利报道利用离子液体催化水解紫草素(或异紫草素)酯类衍生物制备紫草素。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术问题，本发明的目的在于提供一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法。
[0006]本发明所述从紫草中制备高纯度紫草素的方法，是在水解反应过程中，使用离子液体中和稀氨水组成的非均相为催化剂水解紫草提取物(主要成分为β，二甲基丙烯酰紫草素，异戊酰紫草素，异丁酰紫草素等紫草素酯化物)。该水解过程在低水比的条件下进行，用稀氨水弱碱替代了氢氧化锂、氢氧化钠等强碱，且具有较高的选择性，能够重复使用而且保持较高活性，副产物少，具有很强的工业应用前景。
[0007]本发明采用的技术方案为:
[0008]—种从紫草中制备高纯度紫草素的方法，包括以下步骤:
[0009](I)提取:将紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，5?20°C下加4?12倍重量的60?90°C石油醚渗漉提取，35?45°C减压浓缩回收石油醚，得到紫草石油醚提取物；
[0010](2)水解:将步骤(I)得到的紫草石油醚提取物投入4?10倍重量的离子液体中，添加0.5?2.5倍重量的稀氨水，在25?45°C下搅拌水解，控制转速在50?200rpm，2?7h后水解完毕，水解后分离下层水解液，下层水解液加入0.2?5.0M硫酸中和至酸性，过滤得到紫草素粗品；
[0011](3)中压硅胶柱层析:将步骤(2)得到的紫草素粗品，用乙酸乙酯溶解，硅胶拌样，挥干乙酸乙酯，上中压硅胶柱层析，石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，HPLC同步检测，收集纯度>90%的目标流份；
[0012](4)结晶:将纯度>90%的目标流份减压浓缩，放置结晶，真空干燥，得到针状结晶，纯度>98%。
[0013]所述步骤(2)中离子液体的阳离子为吡啶类离子、季铵类盐离子、季鱗类盐离子、咪唑类盐离子中的一种。离子液阴离子为碱性或中性的阴离子=BF4，PF6，NO3，NO2，SO42，CH3COO，SbF6，ZnCl3，SnCl3，N (CF3SO2)2，N(C2F5SO2)2，N(FSO2)2，C (CF3SO2)3，CF3CO2，CF3SO3 ,CH3SO3中的一种。可以直接采用市售产品，如上海默尼化工科技有限公司生产的纯度>99%的离子液体。
[0014]所述步骤(2)中离子液体加入重量与紫草石油醚提取物总重量比为(4?10);稀氨水的浓度为2?8% (v/v)。
[0015]所述步骤(3)中硅胶为300?500目，拌样硅胶使用量为药材重量的3?8%，柱径高比为1: (7?15)，压力控制在0.6?0.9MPa，石油醚-乙酸乙酯体积比为100: (5?30) ο
[0016]所述步骤(3)和步骤(4)中紫草素纯度的检测方法为反相高效液相色谱法(RP-HPLC) ο检测条件:色谱柱为Lichrosorb C18柱(250_X4.6mm，5um);流动相为甲醇一水(体积比)=75:25 ;流速1.0ml/min ;检测波长516nm ;进样量10ul，柱温:25°C。
[0017]本发明的积极效果为:本发明制备的紫草素素纯度高、纯度>98%，水解选择性高、副产物少、制备量大，易于实现工业化生产。方法简单、易于操作、成本低、水解过程在低水比的条件下进行，用稀氨水弱碱替代了氢氧化锂、氢氧化钠等强碱，且具有较高的选择性，能够重复使用而且保持较高活性，副产物少，具有很强的工业应用前景。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例详细说明本发明。
[0019]实施例1:
[0020](I)提取:将Ikg紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，5°C下加1kg的石油醚渗漉提取，35°C减压浓缩回收石油醚，得到紫草石油醚提取物25g ;
[0021](2)水解:将步骤(I)得到的紫草石油醚提取物投入150g的离子液体1-乙烯基-3-丁基咪唑硝酸盐(EM頂NO3)中，添加50g浓度为5% (v/v)的稀氨水，在25°C下搅拌水解，控制转速在lOOrpm，5h后水解完毕，水解后分离下层水解液，下层水解液加入0.2M硫酸中和至酸性，过滤得到紫草素粗品16g ;
[0022](3)中压硅胶柱层析:将步骤(2)得到的紫草素粗品，用50g乙酸乙酯溶解，硅胶拌样，挥干乙酸乙酯，上300?500目中压硅胶柱层析(柱径高比为1:10)，依次用体积比100:5，100:25的石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，压力控制在0.6?0.9MPa，HPLC同步检测，收集纯度>90 %的目标流份；；
[0023](4)结晶:将纯度>90%的目标流份减压浓缩，放置结晶，真空干燥，得到针状结晶8.5g，纯度为 98.4%。
[0024]实施例2:
[0025](I)提取:将Ikg紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，25°C下加8kg的石油醚渗漉提取，40°C减压浓缩回收石油醚，得到紫草石油醚提取物22g ;
[0026](2)水解:将步骤(I)得到的紫草石油醚提取物投入200g的离子液体甲基咪唑六氟锑酸盐(BM頂SbF6)中，添加50g浓度为4% (v/v)的稀氨水，在25°C下搅拌水解，控制转速在90rpm，6h后水解完毕，水解后分离下层水解液，下层水解液加入0.2M硫酸中和至酸性，过滤得到紫草素粗品14g ;
[0027](3)中压硅胶柱层析:将步骤(2)得到的紫草素粗品，用40g乙酸乙酯溶解，硅胶拌样，挥干乙酸乙酯，上300?500目中压硅胶柱层析(柱径高比为1:12)，依次用体积比100:12，100:30的石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，压力控制在0.6?0.9MPa，HPLC同步检测，收集纯度>90 %的目标流份；
[0028](4)结晶:将纯度>90%的目标流份减压浓缩，放置结晶，真空干燥，得到针状结晶6.2g 纯度为 98.6%o
[0029]实施例3:
[0030](I)提取:将Ikg紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，30°C下加8kg的石油醚渗漉提取，42°C减压浓缩回收石油醚，得到紫草石油醚提取物18g ;
[0031](2)水解:将步骤⑴得到的紫草石油醚提取物投入120g的离子液体N-己基吡啶六氟磷酸盐(HpyPF6)中，添加50g浓度为6% (v/v)的稀氨水，在25°C下搅拌水解，控制转速在120rpm，6h后水解完毕，水解后分离下层水解液，下层水解液加入0.2M硫酸中和至酸性，过滤得到紫草素粗品12g ;
[0032](3)中压硅胶柱层析:将步骤(2)得到的紫草素粗品，用36g乙酸乙酯溶解，硅胶拌样，挥干乙酸乙酯，上300?500目中压硅胶柱层析(柱径高比为1:12)，依次用体积比100:5，100:30的石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，压力控制在0.6?0.9MPa，HPLC同步检测，收集纯度>90 %的目标流份；
[0033](4)结晶:将纯度>90%的目标流份减压浓缩，放置结晶，真空干燥，得到针状结晶5.6g 纯度为 98.8%o
[0034]本发明按照上述实施例进行了说明，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法，其特征在于由以下步骤构成: (1)提取:将紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，5?20°C下加4?12倍重量的60?90°C石油醚渗漉提取，35?45°C减压浓缩回收石油醚，压力为-0.09MP，得到紫草石油醚提取物； (2)水解:将步骤(1)得到的紫草石油醚提取物投入4?10倍重量的离子液体中，添加0.5?2.5倍重量的稀氨水，稀氨水的浓度为2?8% v/v,在25?45°C下搅拌水解，控制转速在50?200rpm，2?7h后水解完毕，水解后分离下层水解液，下层水解液加入0.2?5.0M硫酸中和至酸性，过滤得到紫草素粗品； (3)中压硅胶柱层析:将步骤(2)得到的紫草素粗品，用乙酸乙酯溶解，硅胶拌样，挥干乙酸乙酯，上中压硅胶柱层析，石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，HPLC同步检测，收集纯度>90 %的目标流份；所述硅胶为300?500目，拌样硅胶使用量为药材重量的3?8 %，柱径高比为1:7?15，压力控制在0.6?0.9MPa，石油醚-乙酸乙酯体积比为100:5?30 ； (4)结晶:将纯度>90%的目标流份减压浓缩，放置结晶，真空干燥，得到针状结晶，纯度>98%，减压浓缩和真空干燥的压力均为-0.09MPa。2.根据权利要求1所述的一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中离子液体的阳离子为吡啶类离子或季铵类盐离子或季鱗类盐离子或咪唑类盐离子，离子液体的阴离子为碱性或中性的阴离子:BF4或PF 6或NO 3或NO 2或SO /或CH3C00 或 SbF 6 或 ZnCl 3或 SnCl 3或 N (CF 3S02)2 或 N (C 2F5S02)2 或 N (FS0 2)2 或 C (CF 3S02)3 或CF3C02 或 CF 3S03 或 CH 3S03。3.根据权利要求1所述的一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法，其特征在于，所述的离子液体重量与紫草石油醚提取物重量比为4?10:1。
【专利摘要】本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种从紫草中制备高纯度紫草素的方法。本发明所述制备方法为：将紫草粉碎，用60～90℃石油醚渗漉提取，将提取液浓缩，转入离子液体中，添加一定比例的稀氨水进行水解2～7h。水解后分离下层水解液，加入0.2～5.0M硫酸中和至酸性，过滤得到紫草素粗品；再将上述紫草素粗品经中压硅胶柱层析纯化，目标流份浓缩结晶后，得到纯度>98％的紫草素。本发明水解条件温和，具有产率高，副产物少，后处理简单的特点，可应用于工业化的大规模生产。
【IPC分类】C07C50/32, C07C46/10
【公开号】CN105348065
【申请号】CN201510881298
【发明人】杨永华, 杨永安
【申请人】南京大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月4日