专利名称：：一种用稀土元素促进滇紫草细胞紫草素合成的方法
技术领域：
：本发明涉及一种用稀土元素促进滇紫草细胞紫草素合成的方法。
背景技术：
：滇紫草(Ono柳a;am'cw/a化mBur.etFr.)主产云南，是云南省本地常用中草药，属紫草科(Boraginaceae)植物，其根药用。主要有效成分为紫草素及其衍生物，这些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，而且还作为天然色素广泛用于医药、化妆品和印染工业。目前，滇紫草的野生资源破坏严重，市场上供需矛盾凸显。而利用植物细胞大规模培养技术在反应器中直接培养细胞获得药用次生代谢产物是将来生产植物药最直接、最有效的手段。而对于开展细胞培养技术来生产药用次生代谢产物，获得一种能显著促进次生代谢物合成的方法，是保证高生产效率，縮短生长周期，降低生产成本的有效手段。稀土元素在植物生长中的生理作用己经引起植物细胞工程研究人员的重视。例如，在长春花细胞悬浮培养的指数期加入硝酸镧，对细胞的生长和次生代谢物的积累均有促进作用(元英进等，稀土，1993，14(3):38-40)。在发菜细胞培养中加入镧，不但能促进其生长，而且还能改变氨基酸含量(刘世名等，中国稀土学报，1999，17(1):60-64)。在水母雪莲的培养过程中，添加铈或者镧可以明显促进细胞的增殖，同时能增加细胞的黄酮含量(Yuanetal.Biotech.Lett.,2002,24:1889-1892.)。肉灰蓉细胞的培养时，加入镧、铈或钕都能提高细胞的生物量，获得较好的增殖效果(Ouyangetal.J.Biotech.,2003，102:129-134)。我们曾经详细研究了稀土元素对新疆紫草细胞生长的影响，表明多种稀土元素在合适的浓度范围内能显著增加培养细胞的生物量(Geetal.PlantGrowthRegulation,2006,48:283-290;中国发明专利，ZL20310113089.4)。
发明内容本发明的目的是提供一种用稀土元素促进滇紫草细胞紫草素合成的方法。该方法的操作步骤如下1)滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25士1°C，避光培养，培养周期28-30天；2)合成培养基的配制M10培养基+稀土元素，M10培养基的成分如表l所示；稀土元素的种类和浓度为€63+(0-0.2mM)、La3+(0-0.2mM)、Nd3+(0-0.2mM)中的一种。在装有40mL固体培养基的三角瓶中进行，采用继代培养15天的细胞接种，培养温度为25±1°C，pH值5.6，暗培养，该紫草素合成阶段的细胞培养周期为15天。表1M10培养基成分成分浓度(mg/L)成分浓度(mg/L)KN03680NaH2P04'2H2019Na2S042000CuCl2'2H200.15CaCl2500NaFe-EDTAH3B031.6Sucross50000Inositol100Kinetin(KT)13)紫草素含量的测定将培养的滇紫草细胞转移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸点30_60°C)，用超声细胞破碎仪进行细胞破碎，然后在室温下振荡(110r/min)提取24h，提取液用于测定细胞中紫草素的含量。紫草素呈红棕色，用分光光度计测量，在520nm处有最大吸收峰。绘制标准曲线，得到C二187.85X—2.09，相关系数r=0.9995，其中C为石油醚溶液中的紫草素浓度(mg/L)，X为该测定溶液的吸光度值，(紫草素含量的测定方法参见《过程工程学报》2008，8巻第1期，115-119页)S=(CNV/W)X100%;其中，S为紫草素含量(％)，W为愈伤组织干重(mg)，V为萃取液体积(L)，N为稀释倍数。本发明的关键点在于1.添加稀土元素的种类；2.添加稀土元素的浓度。以上关键点如能把握好，可以显著提高细胞紫草素的含量。本发明操作简便，效果良好，本发明可应用到植物细胞大规模培养生产有用次生代谢产物的实际生产过程中。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。实施例h1)滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25土1°C，避光培养；2)将继代培养15天的滇紫草细胞接种在合成培养基中培养，培养基成分为M10培养基+Ce3+(用量见下表)，pH值5.6，培养温度为25土1。C，避光培养，培养周期为15天。3)培养结束后测定细胞紫草素的含量，其结果见表2。表2不同浓度的C^+对滇紫草细胞紫草素含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注对照组为不添加稀土元素的实验组。实施例2:1)滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25土1°C，避光培养；2)将继代培养15天的滇紫草细胞接种在合成培养基中培养，培养基成分为M10培养基+La3+(用量见下表)，pH值5.6,培养温度为25士1。C，避光培养，培养周期为15天。3)培养结束后测定细胞紫草素的含量，其结果见表3。表3不同浓度的L^+对滇紫草细胞紫草素含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注对照组为不添加稀土元素的实验组。实施例3:1)滇紫草细胞的继代培养继代培养基为MS基础培养基+NAA1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25士1°C，避光培养；2)将继代培养15天的滇紫草细胞接种在合成培养基中培养，培养基成分为M10培养基+Nd3+(用量见下表)，pH值5.6，培养温度为25土1°C，避光培养，培养周期为15天。3)培养结束后测定细胞紫草素的含量，其结果见表4。表4不同浓度的NdS+对滇紫草细胞紫草素含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注对照组为不添加稀土元素的实验组。权利要求1、一种用稀土元素促进滇紫草细胞紫草素合成的方法，其特征在于该方法的操作步骤包括1)滇紫草细胞的继代培养使用继代培养基，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25±1℃，避光培养；2)将继代培养15天的滇紫草细胞接种在含稀土元素的M10固体培养基中培养，稀土元素种类和浓度为Ce3+0-0.2mM、La3+0-0.2mM、Nd3+0-0.2mM，其中的一种，培养温度为25±1℃，避光培养，培养周期为15天。全文摘要本发明涉及用稀土元素促进滇紫草细胞紫草素合成的方法。其操作步骤主要包括1.滇紫草细胞的继代培养；2.稀土元素促进滇紫草细胞紫草素的合成；3.紫草素含量测定过程。向培养基中添加稀土元素能提高滇紫草细胞紫草素含量。本发明操作简便，效果良好，本发明可应用到植物细胞大规模培养生产有用次生代谢产物的实际生产过程中。文档编号C12P7/26GK101407783SQ20081023364公开日2009年4月15日申请日期2008年11月26日优先权日2008年11月26日发明者刘迪秋,锋葛,陈朝银,黄文虎申请人:昆明理工大学