专利名称：载体zh-ha固定化粪产碱杆菌青霉素g酰化酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物化工中对酶进行固定化的工艺，具体地说是一种新颖 修饰型环氧基载体ZH-HA固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法。
背景技术：
自从1929年弗莱明发现青霉素以来，青霉素为人类的医疗卫生事业作 出了巨大的贡献。然而伴随着使用以致滥用，细菌对青霉素的耐药性也在 不断增加。研制新型抗生素是解决问题的有效措施。20世纪60年代科研人 员发现了青霉素G酰化酶(PGA; EC 3.5丄11)，并开发了固定化酶技术用来 水解青霉素和头孢菌素G生产6—氨基青霉烷酸(6—APA)和7—氨基脱 乙酰头孢烷酸(7—ADCA)。而6—APA和7—ADCA是半合成抗生素的重 要医药中间体。固定化青霉素酰化酶是半合成(3-内酰胺抗生素的生产得以 进行的重要手段。而随着社会需求的发展需要更好性能、更高效率的催化 剂，来增加工业生产的竞争力。
近年来，人们已从自然界筛选到多种不同性质的青霉素酰化酶，在所 有已知来源的青霉素G酰化酶中，粪产碱杆菌"/^/^"^/flecfl&)青霉 素G酰化酶的基因直到1994年才被克隆(文献l，美国专利5695978)，其 具有许多有工业价值的特点粪产碱杆菌青霉素G酰化酶对底物有更高的 亲和力，其Km比其他青霉素酰化酶都低而其kcat是所有青霉素G酰化酶 中最高的；粪产碱杆菌青霉素G酰化酶是青霉素G酰化酶家族中唯一在一 级结构中具有二硫键的成员，其热稳定性和pH稳定性都很高；对手性分子 的识别能力，粪产碱杆菌青霉素G酰化酶具有更高的选择性；粪产碱杆菌 青霉素G酰化酶在有机溶剂中有很高的稳定性；在催化(3-内酰胺抗生素合 成时合成/水解率高等。所以粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在半合成抗生素工 业中有着更好的应用前景。
固定化能够改善酶的性质，使固定化酶比游离酶具有更好的稳定性和 更高的使用效率，并且使酶能够回收利用，极大节约生产成本。固定化技 术是酶能够应用于工业生产的关键技术之一。经过几十年的研究和发展， 先后开发了多种性能多样的固定化载体和方法，固定化技术取得了长足的 进步，然而仍不能满足理想生物催化剂的所有要求，真正能投入工业应用 的固定化酶却不多，主要原因是固定化使用的试剂和载体成本高，其次是 固定化效率低，稳定性差；并且出于商业保密，很多工艺过程细节没有公 开。我国相关工作起歩较晚，尚需依靠进口来满足半合成抗生素的生产， 因此研究高效的固定化青霉素酰化酶具有重要意义。
近代生物工程的技术进步可以对酶进行分子水平上的改造改善酶的结
构功能获得活力更高的酶，并依靠酶工程的进步将酶固定化获得更适合大 规模工业生产的生物催化剂。我们已将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因， 转化在大肠杆菌中构建了高表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的基因工程 菌，无需诱导即可进行组成型高表达(文献2，袁中一等，中华人民共和国
专利，ZL200310108792.6)。在获得粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的基础上， 申请人:又进行了粪产碱杆菌青霉素G酰化酶固定化酶的研究。
考察一种新载体的固定化条件，其工艺流程为考察酶浓度、pH、盐浓 度、温度等条件，以固定化酶活力、温度稳定性、pH稳定性及使用稳定性 为评价指标。
发明内容
本发明的目的是筛选新的固定化载体应用于粪产碱杆菌青霉素G酰化酶 的固定化，获得固定化酶产品；并以粪产碱杆菌青霉素G酰化酶为模型，建 立起应用新载体对酶进行固定化的一般工艺流程。
为实现上述目的，发明技术方案如下
载体ZH-HA固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法，固定化粪产碱 杆菌青霉素G酰化酶的载体为ZH—HA，于缓冲溶液体系中，以ZH—HA 进行固定化时，酶浓度为为180-240 mg/ml，固定化时l^1 12-18 h， 缓冲溶 液pH7.5 — 10.0，反应体系中盐的1.0-1.5 M，载体与缓冲溶液的重量体积 比例为1 g载体4一6 ml缓冲溶液。
当体系中缓冲溶液的浓度低于1.0-1.5 M，体系中不足i勺离子强度可以 用可溶性盐补充，使反应体系中盐的浓度1.0-1.5 M。如，采用浓度0.05M 的缓冲溶液，补加1.0-1.5 MNaCl。
本发明建立了修饰型环氧载体对粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的固定化。
本发明还对粪产碱杆菌青霉素G酰化酶采用工业化通用载体Eupergit C 进行了固定化，并对其固定化条件进行了研究，确定了以Eu^ergkC进行固 定化时，其最佳条件为80-160 mg/ml，固定化200-320 h， 缓冲溶液pH7.0 一9.5，缓冲溶液浓度0.4-0.8 M。
本发明具有如下特点
1. 本发明采用商业化载体Eupergit C对目前研究较少的粪产碱杆菌青霉 素G酰化酶进行了首次固定化，获得了性能比自由酶大为改善的固定化酶； 并筛选出了适于固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的载体ZH—HA， ZH— HA的价格比Eupergit C低，采用此种载体对酶进行固定化不仅大大降低了生 产成本，所需固定化时间比也比EupergitC大为减少，获得的固定化酶活力 也更高。建立的工艺方法适用于对所有蛋白质分子进行固定化，改善性能， 提高其稳定性及使用效率。
2. 本发明通过对酶浓度、固定化时间、pH以及缓冲溶液浓度等条件的 考察，确定了最优固定化条件，建立了采用新载体固定化的工艺流程。固 定化酶的温度、pH稳定性都比自由酶有了改善。经过连续多批水解青霉素
G钾盐，固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶显示出良好的操作稳定性，表现 出比自由酶的优势。
图1为酶浓度和固定化时间对载体Eupergit C固定化粪产碱杆菌青霉素 G酰化酶的影响；固定化条件pH7.5, 1 M磷酸缓冲液；室温。( ), 10 mg 蛋白质/ml; (口),40 mg蛋白质/ml; (△), 80 mg蛋白质/ml; (x), 120 mg蛋白 质/ml; (+), 160 mg蛋白质/ml.
图2为酶浓度和固定化时间对载体ZH—HA固定化粪产碱杆菌青霉素 G酰化酶的影响；固定化条件pH 7.5, 1 M磷酸缓冲液；室温。(0),10mg 蛋白质/ml; (□), 40 mg蛋白质/ml; (△)， 80 mg蛋白质/ml; (x), 120 mg蛋白质 /ml; (+), 160 mg蛋白质/ml; ( ), 200 mg蛋白质/ml; (一), 240 mg蛋白质/ml
图3为pH对载体Eupergit C和ZH—HA固定化粪产碱杆菌青霉素G 酰化酶的影响；固定化条件100 mg蛋白质/ g载体;室温;固定化时间对 Eupergit C、 ZH-EP和ZH-HA分别为150h和12h。 (O)，Eupergit C; (A),ZH-HA
图4为离子强度对载体Eupergit C和ZH—HA固定化粪产碱杆菌青霉 素G酰化酶的影响；固定化条件100mg蛋白质/g载体；室温；pH8.0;固 定化时间对Eupergit C和ZH-HA分别为150h禾n 12h。 (^),Eupergit C; (A),ZH-HA
图5 pH对自由粪产碱杆菌青霉素G酰化酶和固定化在载体Eupergit C 和ZH—HA上粪产碱杆菌青霉素G酰化酶活力的影响；(O),自由AfPGA; (□)， 固定化AfPGA/Eupergit C; (x)，固定化AfPGA / ZH-HA.
图6温度对自由粪产碱杆菌青霉素G酰化酶和固定化在载体Eupergit C和ZH—HA上粪产碱杆菌青霉素G酰化酶活力的影响；(O),自由AfPGA; (□)，固定化AfPGA/Eupergit C;(x),固定化AfPGA / ZH-HA.
图7自由粪产碱杆菌青霉素G酰化酶和固定化在载体Eupergit C和ZH 一HA上粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的pH稳定性；( ),自由AfPGA; (□)， 固定化AfPGA / Eupergit C; (x)，固定化AfPGA / ZH-HA.
图8自由粪产碱杆菌青霉素G酰化酶和固定化在载体Eupergit C和ZH _HA上粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的温度稳定性；( ),自由AfPGA; (□), 固定化AfPGA / Eupergit C; (x),固定化AfPGA / ZH-HA.
图9固定化在载体Eupergit C和ZH—HA上粪产碱杆菌青霉素G酰化 酶的使用稳定性。(口),固定化AfPGA / Eupergit C; (A),固定化AfPGA / ZH-HA.
具体实施例方式
首先按常规方法培养产粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的菌体，细胞破碎，
提纯，获得粪产碱杆菌青霉素G酰化酶。然后是对选择出的载体进行固定 化条件的研究，获得的固定化酶对其进行性质研究以评价固定化效果及其 工艺应用潜力。 实施例
先进行初步实验筛选出有潜力的载体，再对选择出的载体进行详细的 固定化条件研究，获得固定化酶后研究其性质和溶液酶比较。
1载体的选择经过对多种候选载体的试验，最终筛选出香港GeneRad Biotech Laboratory有限公司开发的新型载体ZH—EP的改进型载体ZH— HA。 ZH-EP，类似已工业化应用的载体EupergitC，具有环氧活性基团；而 ZH—HA，制备于ZH—EP，内表面覆盖有聚乙烯亚胺。作为对照，Eupergit C也被用于固定化。
2固定化条件的考察
2. 1粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的浓度以及固定化时间 一般，共价固定化遵循两步法机理首先是载体和蛋白之间快速的物 理吸附，然后是被吸附的蛋白和载体的活化基团之间发生共价反应。第一 步意味着酶浓度对于固定化是个重要因素。不同性质载体其最适酶浓度不 同，采用最适酶浓度固定化可以在避免浪费酶的情况下获得高活力的固定 化酶。
通常情况下不需要采用纯度高的酶进行固定化，本专利中采用比活334 U/g蛋白的酶进行固定化。固定化体系为lg载体、4 —6ml缓冲溶液。
采用不同的酶浓度体系进行固定化，根据考察结果(图1、图2)，为 获得最高固定化酶活力，确定采用载j^EupergitC，其最适蛋白浓度为120 mg/ml，固定化260h;对于ZH—HA采用200 mg/ml，固定化15h。
2. 2pH
常用的磷酸、Tris盐酸等缓冲溶液缓冲范围不足，因此采用 Britton-Robinson缓冲溶液(1.0M硼酸-1.0M乙酸-1.0M磷酸的混合 液，其pH由NaOH调节)。
在不同pH的体系中对酶进行固定化，通过对获得的固定化酶活力进行 比较(图3)，对于用载体Eupergit C固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶， 其最适固定化pH范围7.5—9.0;对于ZH—HA，其最适固定化pH范围7.5 一8.5。
2. 3离子强度
酶在载体上的两歩法固定化机理第一步要求蛋白和载体表面具有较强 的相互作用力，而蛋白和载体之间的作用力受到引起蛋白和载体表面疏水 作用的盐浓度或者缓冲溶液浓度的影响。
在不同离子强度的体系中对酶进行固定化，通过对获得的固定化酶活 力进行比较(图4)，对于用载体Eupergit C固定化粪产碱杆菌青霉素G酰 化酶，其最适缓冲溶液浓度0.5 M;对于ZH—HA，其最适缓冲溶液浓度
1.5 M。
2 4温度
经考察，温度对于固定化的影响不是十分显著，从经济方便的角度考虑， 采用室温。对于温度敏感型酶可以考虑其适宜的温度。 3固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的性质 3. 1最适pH
采用不同pH的Britton—Robinson缓冲溶液(0.05 M硼酸一0.05 M冰醋 酸—0.05 M磷酸，NaOH调节pH)测定pH对溶液酶及固定化酶活力的影 响。自由酶的最适pH为7.5，固定化酶均向碱性范围发生了偏移， AfPGA/Eupergit C最适pH为8.0， AfPGA/ZH-HA最适pH为10.0-11.0 (图5)。
3. 2最适温度
在不同的温度测定溶液酶及固定化酶的活力。自由酶的最适温度为 50°C，固定化酶的最适温度均有所提高，为55 60。C (图6)。 3. 3pH稳定性
样品在不同pH的缓冲溶液中室温保温1 h后测定其残余活力，和未经 保温的样品活力相比，在整个酸性到碱性范围(pH 4.0-10.0)固定化酶的 pH稳定性明显比自由酶的好(图7)。由于青霉素G酰化酶不仅能在碱性 环境下催化水解反应还能在酸性催化合成反应，因此固定化后在酸性以及 碱性范围内提高了其稳定性有着重要意义。
3. 4温度稳定性
在工业中采用较高的反应温度，有以下一些优势较高的反应速率、改 变反应平衡、更好的底物溶解性、较低的反应介质粘度以及微生物污染可 能性降低等。因此热稳定性的酶对于工业应用具有重要意义。
样品在不同温度保温1 h后，测定其残余活力，和未经保温的样品相比， 评价其温度稳定性。溶液酶及固定化酶均表现出了良好的温度稳定性，而 固定化酶在55"C以上表现出了其稳定作用(图8)。
3. 5使用稳定性
固定化酶在柱式反应器中催化水解青霉素G钾盐产生6-APA和苯乙 酸，NaOH溶液自动加入保持反应体系pH为8.0，固定化酶的活力和NaOH 的初始消耗速率成正比。在反应过程中，青霉素G钾盐的水解速度逐渐降 低，NaOH的加入速率也相应降低，当最终NaOH停止消耗时反应结束， 然后重复操作开始下一批反应。经过连续反应40余批，固定化酶活力没有 明显损失，表现出了良好的使用稳定性(图9)。
实施例1以载体EupergitC固定化
采用比活334 U / g蛋白的粪产碱杆菌青霉素G酰化酶，酶溶解在 pH 8.0的磷酸缓冲液中，浓縮或者稀释酶液至120 mg/ml。 1 g湿载体Eupergit C加入5ml酶液，室温下均匀混合地反应260小时。用沙芯漏斗抽滤，所
得固定化产物用磷酸缓冲液洗涤3_5次,固定化结束。
实施例2以载体ZH—HA固定化粪产碱杆菌青霉^G酰化酶 10 g湿载体ZH—HA加入40 ml 0.02 mol/L磷酸钾缓冲液pH 8.0，室温 充分搅拌洗涤，过滤。加入40 ml 0.02 mol/L磷酸钾缓冲液pH 8.0—2%戊 二醛溶液，室温搅拌30min。过滤，ZH—HA再经磷酸钾缓冲液充分洗涤。 至此，载体ZH—HA活化结束，随时可用。
采用比活334 U / g蛋白的粪产碱杆菌青霉素G酰化酶，酶溶解在pH 9.0的磷酸缓冲液中，浓縮或者稀释酶液至200mg/ml。 lg活化后的湿载体 ZH—HA加入5 ml酶液，室温下均匀混合地反应15小时。用沙芯漏斗抽 滤，所得固定化产物用磷酸缓冲液洗涤3—5次,固定化结束。
权利要求
1. 载体ZH-HA固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法，其特征在于固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的载体为ZH—HA，于缓冲溶液体系中，以ZH—HA进行固定化时，酶浓度为为180-240mg/ml，固定化时间12-18h，缓冲溶液pH7.5—10.0，反应体系中盐的1.0-1.5M，载体与缓冲溶液的重量体积比例为1g载体4—6ml缓冲溶液。
2. 按照权利要求1所述载体ZH-HA固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化 酶的方法，其特征在于当体系中缓冲溶液的浓度低于1.0-1.5 M，体系中 不足的离子强度可以用可溶性盐补充，使反应体系中盐的浓度1.0-1.5 M。
全文摘要
本发明涉及生物化工中对酶进行固定化的工艺，具体地说是载体ZH-HA固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法，固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的载体为ZH-HA，于缓冲溶液体系中，以ZH-HA进行固定化时，酶浓度为为180-240mg/ml，固定化时间12-18h，缓冲溶液pH 7.5-10.0，反应体系中盐的1.0-1.5M，载体与缓冲溶液的重量体积比例为1g载体4-6ml缓冲溶液。本发明固定化酶的温度、pH稳定性都比自由酶有了改善。经过连续多批水解青霉素G钾盐，固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶显示出良好的操作稳定性，表现出比自由酶的优势。
文档编号C12N9/78GK101381719SQ20071001271
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月5日 优先权日2007年9月5日
发明者健 孙, 袁中一, 许国旺 申请人:中国科学院大连化学物理研究所