专利名称：源于芽孢杆菌的热稳定性天然蛋白酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶及其应用，更具体地说用于生产苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
嗜热菌蛋白酶是-种可通过商业途径购买的并在各个领域内广泛使用例如用于去污剂组合物，用于食品加工以及化妆品制剂中的有效的酶。进一步可将其用于合成苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文中简称为Z-APM)，它是一种人工甜味剂天冬苯丙二肽酯的前体。
背景技术：
嗜热菌蛋白酶最初发现于嗜热蛋白酶解芽孢杆菌的培养液中(Endo，S.(1962)J.Fermentation Tech.，40，346-353)并且由此进行了许多调查。因此，例如已阐明了该酶的氨基酸序列(Titani，K.et al.，(1972)NatureNew Biol.，238，35-37)以及三维空间结构(Holmes，M.A.以及Matthews，B.W.，(1982)J.Mol.Biol.160.，623-639)。同时，从嗜热蛋白酶解芽孢杆菌中克隆出该蛋白酶基因(EP-A-0418625)并且发现从所说基因的核苷酸序列推导出的成熟酶的氨基酸序列与Titani证实的原始一级结构在两个位点上不相同。于是，报道了该成熟酶的第37位(从氨基末端起)氨基酸残基不是天冬氨酸而是天冬酰胺，第119位氨基酸不是谷氨酸而是谷氨酰胺。该氨基酸序列与nprM(从嗜热蛋白酶解芽孢杆菌克隆的蛋白酶基因之一)编码的序列相同(Kubo，M.，等人(1988)Journal of General Microbiology 134，1883-1892)。
因此，在本发明说明书中，将该nprM基因或来自嗜热蛋白酶解芽孢杆菌的基因编码的蛋白酶称作为“野生型嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶”。
已经有人报道了嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶比活性及稳定性的改变(Kubo.M.，et al.，(1992)Applied and Environmental Microbiology，58，3779-3783)。在该文章中，已经描述了在一个或多个氨基酸残基尤其是在93、110、114、115、136、137、143、151、157、193、211、217和221位上与一级结构不同的各种突变体。但是在该参考文献中，仅采用酪蛋白消化方法检测活性。但是，这些突变体中没有一种显示与Z-APM合成或消化相关的活性得到实质上改善。(如在以前由本申请人的欧洲专利申请，No.93200773.5的实施例中进一步描述的)现在也已经确定酪蛋白消化活性并不与Z-APM合成相关这表明即使用于酪蛋白消化的比活性增加，用于Z-APM合成的比活性也不总是增加。
另外，以前申请人发现有效的新蛋白酶可能源于具有下面SEQ ID NO1显示的氨基酸序列(野生型)的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶，即采用以不同于原始残基的其他氨基酸残基在特定位置上取代一或多个氨基酸残基得到的，(SEQ ID NO1)。Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly15 10 15Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu20 25 30Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys35 40 45Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn50 55 60Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr65 70 75Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg80 85 90Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His95 100 105Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met110115 120Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly125130 135Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp140145 150Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn155160 165Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala170175 180Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro185190 195Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys200205 210Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln215220 225Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala230235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val245250 255Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala260265 270Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg275280 285Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser290295 300Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val305310 315Lys具体地说，申请人已经提交了一个欧洲专利申请(申请号No.93200773.5)，该申请的内容是通过用一个不同的氨基酸取代至少一个下列氨基酸残基第144位(亮氨酸)，第150位(天冬氨酸)，第187位(谷氨酸)以及第227位(天冬酰胺)氨基酸残基而从所述野生型获得的新的经修饰的蛋白酶。
在所说较早期专利申请(在本申请的申请日未公开)中介绍的并且在第144位，第150位，第187位和第227位之一上具有单个氨基酸取代的经修饰的酶的比活性不大于用于Z-APM合成和消化的野生型酶的2倍。
基于这些观察资料，并且由于在Z-APM的酶促合成中有各种问题，例如由于反应时间长，和/或不利的pH条件使得在产物Z-APM和起始材料L-或D，L-苯丙氨酸甲酯(PM)的浓缩反应和水解期间该酶活性相对较低，酶的失活，仍需要研制具有较高的Z-APM合成活性的改进的酶。当然本申请中提及的PM及其盐也包括在术语PM的含意内。
发明概述现在令人吃惊的是，已经发现在SEQ ID NO1的第150位具有色氨酸残基的经修饰酶的活性增加比以前描述的经修饰蛋白酶的活性要大得多。
根据这些资料，完成了本发明，从而提供了具有上面所示(SEQ ID NO1)氨基酸序列，但至少第150位氨基酸残基从天冬氨酸(野生型)改变为色氨酸的经修饰的蛋白酶。从而使从嗜热脂肪芽孢杆菌衍生的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的Z-APM合成活性得到改善。
因此根据本发明的经修饰的蛋白酶非常适用于大规模生产Z-APM。
附图简述
图1显示了用于从已知质粒pMK4构建命名为pUCTZ37的重组质粒的方案。
图2显示用于从质粒pMK4和质粒pUCTZ37构建命名为pUCTZ47的重组质粒的方案。
图3显示用于从已知质粒pUCTZ47和质粒pUB110构建命名为pUBTZ1的重组质粒的方案。
图4显示用于从质粒pUBTZ1构建命名为pUBTZ2的重组质粒的方案。
图5显示用于从质粒pUBTZ2以及由聚合酶链反应获得的突变DNA片段构建命名为pUBTZ2(D150W)的重组质粒的方案。
图6显示用于从已知质粒pMK1构建命名为pUCTZ55的重组质粒的方案。
图7显示用于从质粒pUCTZ55构建命名为M13TZSp-Bc的重组M13噬菌体的方案。
图8显示用于从质粒pUBTZ2和M13TZSp-Bc(N227H突变体)构建重组质粒pUBTZ2(N227H突变体)的方案。
图9显示用于从质粒pUBTZ2和由聚合酶链反应获得的突变DNA片段构建命名为pUBTZ2(D150W-N227H)的重组质粒的方案。
图10显示用于从质粒pUBTZ2和由聚合酶链反应获得的突变DNA片段构建命名为pUBTZ2(L144S)的重组质粒的方案。
图11显示用于从质粒pUBTZ2(L144S)和质粒pUBTZ2(D150W-N227)构建命名为pUBTZ2(144S-D150W-N227H)的重组质粒的方案。
图12显示经修饰的酶的Z-APM合成活性，简写表示氨基酸的一个字母代码。第150位氨基酸残基的“D”是指野生型嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶。在一秒钟内合成1摩尔的Z-APM的酶活性定义为1开特(kat)。
图13显示经修饰的酶对Z-APM.20的水解活性。
发明的详细描述在上面介绍的较早期专利申请中，公开了在第150位上由天冬氨酸取代为天冬酰胺，组氨酸和赖氨酸的经修饰的蛋白酶。这些用于Z-APM合成或水解的经修饰的蛋白酶的活性至多比野生型嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶活性高2倍。
根据本发明的新的经修饰蛋白酶是用色氨酸残基取代在SEQ ID NO1的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的第150位上天冬氨酸残基得到的衍生物(在下文中被命名为D150W)。尤其是，这些新蛋白酶合成和/或消化Z-APM的活性大大地增加。通过分析检测最终的应用可确定所得蛋白酶的适应性。通常，这可以通过对合成和/或消化Z-APM的活性进行分析，以及将这些活性与按相同方式检测到的野生型嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的活性进行比较来确定。该步骤在下列实施例中将作进一步描述。
经修饰的蛋白酶(D150W)的其他位置可用其他氨基酸残基取代。例如，合成了一个两位点突变体，该突变体是在第150位上由天冬氨酸取代为色氨酸，以及在第227位上由天冬酰胺取代为组氨酸(D150W-N227H)，以及合成了一个三位点突变体，在该突变体的第144位残基由亮氨酸取代为丝氨酸，第150位残基由天冬氨酸取代为色氨酸以及第227位残基由天冬酰胺取代为组氨酸(L144S-D150W-N227H)，并证明这些突变体在Z-APM合成中其活性和稳定性较高。
采用本领域内技术人员熟知的方法可生产这些经修饰的酶。
可用于将突变导入到经克隆的DNA中的各种方法是已知的。例如，通过利用M13噬菌体诱变方法可以制备突变的nprM基因片段(Vandeyar，M.，et al.，(1988)Gene，65，129)。
在该方法中用作为模板的质粒和噬菌体DNA可来源于已知质粒pMK1(Kubo，M.和Imanaka，T.，(1989)J.Bacteriol，171，4080-4082)。可用几种限制性核酸内切酶对nprM基因片段进行消化并将其克隆到另一质粒或克隆到噬菌体载体中。除了经取代的氨基酸残基密码子外，诱变引物应该与含有nprM基因的单链模板DNA互补，为了达到所述目的，可想象得到各种核苷酸序列。通过利用具有经取代的氨基酸残基的不同密码子的这些诱变引物，可以获得任何所需要的氨基酸取代。
另外，采用利用化学合成引物PCR技术(聚合酶链反应)的(Higuchi，R.，Krummel，B.，and Saiki，R.K.，(1988)Nucleic Acids Res.16，7251-7367)可将nprM基因进行诱变。当在诱变位点的附近存在限制性酶位点时，该PCR方法特别有用。例如，由于在野生型嗜热菌蛋白酶类金属蛋白酶的第150位的天冬氨酸密码子附近有一个限制性酶SphI的切割位点，因而含有该SphI位点的诱变引物可用于生产第150位具有突变的突变体。因此可将经诱变引物用作有意义引物。作为逆方向引物(反意义)，可以利用一种寡核苷酸，该寡核苷酸与例如nprM基因的AatI切割位点下游的nprM基因互补。
可采用两种方法在一个以上位点处实现诱变。一种方法包括在所有靶位点处同时进行诱变，而另一种方法包括一个接一个地导入突变。这两种方法实际上在一个以上位点处给质粒带来突变。
在文献(Kubo，M.and Imanaka，T.，(1989)J.Bacteriol.，171，4080-4082)中描述了用于重组嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶制剂的一般性方法，该方法包括将编码经修饰的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的DNA插入表达载体中，利用该载体转化宿主细胞，培养该转化体直到在培养物中积累经修饰的金属蛋白酶，然后从培养物中回收经修饰的酶。但是，在该参考文献中使用的质粒pMK1其大小大于20kb，因此，用所述质粒转化大肠杆菌实质上是困难的。此外，在枯草芽孢杆菌中也发现在培养后期质粒pMK1在相当大的程度上会丢失。
因此，为了克服这个问题，发明人构建了穿梭载体，利用该载体可以转化两种宿主，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，并且该质粒可在这些宿主中表达nprM基因。如图1-图4所示，由此构建了含有该nprM基因的两种穿梭载体(pUBTZ1和pUBTZ2)。当将这些质粒用于转化大肠杆菌的类似HB101和JM103的菌株中，在那些菌株中表达了nprM基因。另外，用这些质粒转化枯草芽孢杆菌的类似DB104，DB117和MT-2菌株时可导致nprM基因的成功表达。在培养后期也没有观察到有质粒丢失。
利用经修饰的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶基因代替该野生型基因可获得使用这些穿梭载体的同样结果以及优点。
在重组细菌中可生产经修饰的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶并将之分泌到培养基中，采用硫酸铵沉淀法可回收这些蛋白酶并可按常规方式例如采用亲水作用层析和/或凝胶过滤将之纯化均匀。
利用该经修饰的蛋白酶能比野生型嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶更有效地合成Z-APM，该Z-APM是天冬苯丙二肽酯的前体。通过将这些经修饰的蛋白酶对Z-APM消化以及Z-APM合成的活性与野生型酶的活性进行比较可证明这一点。结果将发现这些酶的活性比野生型酶和上面介绍的欧洲专利申请(申请号.93200773.5)中描述的经修饰的蛋白酶的活性高得多。在下列实施例中描述了检测到的这些活性值。
如上面介绍的，根据本发明的新的经修饰蛋白酶是SEQ ID NO1的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶，其中第150位的天冬氨酸残基被色氨酸取代(D150W)。
值得注意的是，酪蛋白消化活性并不与Z-APM合成或消化的活性相关联。当将作用于酪蛋白和Z-APM的突变酶的活性进行比较时，清楚地看到即使酪蛋白消化的活性降低，Z-APM合成和/或消化的活性大大地加强。下列实施例仅是为了阐明本发明，并不以任何方式限制本发明。
实施例1第150位氨基酸由天冬氨酸取代为色氨酸(D150W)的经修饰蛋白酶的合成。
a)含有野生型nprM基因的表达质粒pUBTZ2的构建。
将通过用BclI消化从质粒pMK4(Yamada等人，(1991)Gene，99，109-114)获得的含部分nprM基因的约1.0kb DNA片段克隆到质粒pUC9的BamHI位点从而构建一个pUCTZ37质粒(图1)。
质粒pUCTZ37是不具有nprM基因的5′-末端区的一个不完整质粒。用限制性核酸内切酶Hind III消化质粒pUCTZ37，并将pMK4的约1.2kb HindIII片段克隆到较大的pUCTZ37片段从而构建质粒pUCTZ47(图2)。该重组质粒pUCTZ47含有nprM的全长序列以及其转录启动子序列。
为了构建大肠杆菌和枯草芽孢杆菌之间的穿梭载体，如图3所示用EcoRI消化pUCTZ47和pUB110(Keggins，K.M.等人，Proc.Natl.Ac.Sci.USA，(1978)，75，1423-1427)并用T 4 DNA连接酶连接从而构建质粒pUBTZ1。
最后，从如图4所示质粒pUBTZ1中缺失位于SmaI和Pvu II限制性位点之间的DNA片段从而构建质粒pUBTZ2。
质粒pUBTZ2在其nprM基因中有单一的BamHI，SphI和AatI限制性位点。
b)位点150Trp的诱变利用由Applied Biosystems Co.LTD生产的DNA合成仪380B型可合成用于诱变的寡核苷酸。诱变用引物的核苷酸序列是(SEQ ID NO2)5′-AACGCATGCGGTAACCTGGTATACAGC-3′SphI Trp150
此外，合成一个具有下文所述核苷酸序列的反方向引物。(SEQ ID NO3)5′-GAGATACCACTTTATTTCACCCCT-3′将1ng pUBTZ2质粒溶于100μl的PCR反应混合物中(67mM Tris-HCl(pH 8.8)，16.6mM硫酸铵，6.7mM MgCl2，10mM 2-巯基乙醇，0.05mMdATP 0.05mM dTTP，0.05mM dGTP，0.05mM dCTP，1μM诱变引物，1μM反方向引物)，并加入1单位的Tth DNA聚合酶。将一滴矿物油覆盖在该溶液上面。在93℃变性1分钟，在45℃退火一分钟并在72℃延伸45秒，将该过程重复30次。反应之后，回收水层，用苯酚抽提并用乙醇处理以回收经扩增DNA。
在37℃用限制性酶SphI和AatI各5单位对含有一半量的经扩增的DNA的20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，0.1M NaCl，1mM DTT)消化2小时，并在70℃保温5分钟。利用Takara Shuzo DNA连接试剂盒将pUBTZ2的SphI-AatI片段(7.6kb)与该经突变的SphI-AatI片段连接。采用常规方法将该连接混合物用于转化大肠杆菌JM103以便得到转化子JM 103/pUBTZ2(D150W)。通过测定该质粒的核苷酸序列可证实该经取代的氨基酸。
c)从重组枯草芽孢杆菌制备纯化的突变酶采用快速碱-SDS法(Maniatis，T.，Fritsch E.F.，Sambrook，Jr.，(1989)Molecular Cloninga Laboratory manual(2nd Ed.)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA.1.25-1.28)提取上述质粒DNA。采用感受态细胞法转化到枯草芽孢杆菌MT-2菌株中(Hardy，K.G.，(1985)inGlover，D.M.，ed.，DNA CloningVolume II(lst ed.)，IRL Press Limited，Oxford，England，1-17)。
将由此获得的转化子桔草芽孢杆菌MT-2/pUBTZ2(D150W)的单个菌落转移到含卡那霉素(5μg/ml)的5ml LB培养基中并在37℃培养过夜。将该培养物转移到500ml的含卡那霉素(5μg/ml)的2L培养基(2％细菌培养用胰化蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)中，并在37℃培养20小时。将培养液以8,000rpm离心30分钟以便除去细菌，向上清液中加入硫酸铵以达到60％饱和度，将该混合物于4℃搅拌过夜。
通过离心回收沉淀并将其溶于10ml缀冲液A(20mM Tris-HCl，pH9.0，10mM CaCl2)中。将该溶液加到20ml的丁基-Toyopearl，随后以1.5ml/分的流速用缓冲液A进行洗脱。将活性组分合并并用60％饱和的硫酸铵进行盐折。以15,000rpm的转速离心30分钟以收集沉淀，并溶于5ml的缓冲液B(10mMTris-HCl，pH7.0，0.1M NaCl，10mM CaCl2)中。将酶溶液加到凝胶过滤柱(TSK Gel G2000(SW 21.5×300mm))，随后以1ml/分的流速用缓冲液B进行洗脱。将活性组分合并以便得到纯化酶。
图5显示用于构建重组质粒pUBTZ2(D150W)的方案。
实施例2[第150位的氨基酸残基由天冬氨酸取代为色氨酸以及第227位的氨基酸残基由天冬酰胺取代为组氨酸(D150W-N227H)的双重取代的经修饰蛋白酶的合成]如下所述构建嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的D150W-N227H双位点突变。
a)227位点His诱变在20μl的反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10m MgCl2，0.1MNaCl，1mM DTT)中，于37℃用各5单位的限制性酶PstI和BamHI对1μg含来自嗜热脂肪芽孢杆菌MK 232的嗜热菌类中性金属蛋白酶基因nprM的质粒pMK1(Kubo，M.和Imanaka，T.，(1989)J.Bacteriol 171，4080-4082)进行2小时的消化。将该样品加到1％琼脂糖凝胶电泳上，并利用Bio-101 Gene Clean DNA纯化试剂盒分离和纯化约3.5kb的DNA片段。
单独地，在20μl上面介绍的相同反应混合物中，于37℃用各5单位的限制性酶PstI和BamHI将1μg的pUC9质粒消化2小时。
利用Takara Shuzo DNA连接试剂盒将nprM基因的PstI-BamHI片段与pUC9的PstI-BamHI片段相连接。按常规方法用该连接混合物转化大肠杆菌JM 109，得到含nprM基因的PstI-BamHI片段的重组质粒(pUCTZ55)(图6)。
在20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.1MNaCl，1mM DTT)中于37℃用各5单位的SphI和BclI对1μg的重组质粒pUCTZ55消化2小时。将该样品加到1％琼脂糖凝胶电泳上并且利用Bio-101Gene Clean DNA纯化试剂盒分离并纯出约550bp的DNA片段。
单独地，在37℃于20μl如上面介绍的相同反应混合物中用各为5单位的限制性酶SphI和BamHI将1μg的噬菌体载体M13mp18消化2小时。
利用一个Takara Shuzo DNA连接试剂盒，将nprM基因的SphI-BclI片段连接到M13mp18的SphI-BamHI片段上。采用常规方法用该连接混合物转化大肠杆菌JM 109，以得到含有nprM基因的SphI-BclI片段的重组噬菌体(M13TZSp-Bc)(图7)。
采用常规方法从M13TZSp-Bc制备单链DNA并对其进行诱变。利用AppliedBiosystems 380B型DNA合成仪制备用于诱变的寡核苷酸。
下文中显示了用于取代第227位残基(天冬酰胺→组氨酸)的诱变寡核苷酸。(SEQ ID NO4)5′-CGCAAGATCATGGCGGGG-3′His227
利用USB T7-GEN体外诱变试剂盒进行诱变，随后采用DNA测序法证实诱变。
采用常规方法制备经诱变的M13TzSp-Bc双链DNA，在37℃，20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.1M NaCl，1mM DTT)中用各5单位的限制性酶SphI和AatI对1μg的该双链DNA消化2小时，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。从M13TZSp-Bc消化产物中分离约550bp的DNA片段并且利用Bio-101 Gene Clean DNA纯化试剂盒纯化该DNA片段。
用限制性酶SphI和AatI消化质粒pUBTZ2并分离7.6kb的片段。利用TakaraShuzo DNA连接试剂盒将由此获得的pUBTZ2 SphI-AatI片段与nprM基因的经诱变的SphI-AatI片段(约550bp)相连接。采用常规方式用该连接混合物转化大肠杆菌JM 103，得到重组质粒pUBTZ2(N227H)(图8)。
b)位点150Trp诱变以及突变酶(D150W-N227H)的制备利用质粒pUBTZ2(N227H)作为聚合酶链反应的模板。利用SEQ ID NO2的诱变引物以及SEQ ID NO3的反方向引物。
将1ng质粒pUBTZ2(N227H)溶于100μl的PCR反应混合物中(67mMTris-HCl pH8.8，16.6mM硫酸铵，6.7mM MgCl2，10mM 2-巯基乙醇，0.05mMdATP 0.05mM dTTP，0.05mM dGTP，0.05mM dCTP，1μM诱变引物，1μM反方向引物)中，并加入1单位的Tth DNA聚合酶。将一滴矿物油覆盖在该溶液上。在93℃变性1分钟，在45℃退火一分钟，并在72℃延伸45秒，将该过程重复30次。反应之后，回收水层，用酚抽提并用乙醇处理以便回收经扩增的DNA(D150W-N227H)。
在37℃用各为5个单位的限制性酶SphI和AatI将含有一半量的经扩增的DNA的20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，100mMNaCl，1mM DTT)消化2小时，并在70℃保温5分钟。利用Takara ShuzoDNA连接试剂盒将经诱变的SphI-AatI片段与pUBTZ2 7.6kb的SphI-AatI片段相连接。采用常规方法用该连接混合物转化大肠杆菌JM 103得到转化子JM 103/pUBTZ2(D150W-N227H)。通过测定该质粒的核苷酸序列确证被取代的氨基酸。
用该质粒DNA转化枯草芽孢杆菌MT-2，采用类似于实施例1中描述的方法制备该经修饰的蛋白酶(D150W-N227H)。
图9显示用于构建重组质粒pUBTZ2(D150W-N227H)的方案。
实施例3[第144位的氨基酸残基由亮氨酸取代为丝氨酸，第150位的氨基酸残基由天冬氨酸取代为色氨酸，第227位氨基酸残基由天冬酰胺取代为组氨酸的三重替代的经修饰蛋白酶(L144S-D150W-N227H)的合成]按如下方法构建嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的三位点突变体。
a)144位点丝氨酸诱变下文中显示了取代144位残基(亮氨酸变为丝氨酸)的经诱变的寡核苷酸。(SEQ ID NO5)5′-TACCGCATGCGTTGACTCATGTGCGAC-3′SphI Ser另外，合成了具有下文中描述的核苷酸序列的有意义引物。(SEQ ID NO6)5′-CCGAATTTGGACACGAAAGGATCC-3′BamHI将1ng的质粒pUBTZ2溶于100μl的PCR反应混合物(67mM Tris-HClpH8.8，16.6mM硫酸铵，6.7mM MgCl2，10mM 2-巯基乙醇，0.05mM dATP0.05mM dTTP，0.05mM dGTP，0.05mM dCTP，1μM诱变引物，1μM有意义引物)中，并加入1单位的Tth DNA聚合酶。用一滴矿物油盖在溶液上面。使之在93℃变性1分钟，在45℃退火1分钟并在72℃延伸45秒，该过程重复30次。反应之后，回收水层，用苯酚抽提，并用乙醇处理以便回收经扩增的DNA。
在37℃用各5单位的限制性酶BamI和SphI将含有一半量的经扩增的DNA的20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.1M NaCl，1mM DTT)消化2小时，并在70℃保温5分钟。利用Takara Shuzo DNA连接试剂盒将经诱变的BamI-SphI片段与pUBTZ2的BamI-SphI片段(7.4kb)连接。用常规方法将该连接混合物用于转化大肠杆菌JM 103，得到转化子JM 103/pUBTZ2(L144S)。通过测定该质粒的核苷酸序列确证被取代的氨基酸。
图10显示用于构建重组质粒pUBTZ2(L144S)的方案。
b)质粒pUBTZ2(L144S-D150W-N227H)的构建在37℃用各5单位的限制性酶SphI和AatI将含有实施例2中获得的1μg pUBTZ2(D150W-N227H)的20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.1M NaCl，1mM DTT)消化2小时，并在70℃保温5分钟。利用Takara Shuzo DNA连接试剂盒将经诱变的SphI-AatI片段与pUBTZ2(L144S)的7.6kb的SphI-AatI片段相连接。按常规方法用该连接混合物转化大肠杆菌JM 103得到转化子JM 103/pUBTZ2(L144S-D150W-N227H)。通过测定该质粒的核苷酸序列而证实被取代的氨基酸。
用该质粒DNA转化枯草芽孢杆菌MT-2，并采用类似于实施例1中描述的方法制备经修饰的蛋白酶(L144S-D150W-N227H)。
图11显示用于构建重组质粒pUBTZ2(L144S-D150W-N227H)的方案。
实施例4经修饰的蛋白酶活性的测定
(1)Z-APM合成活性在苄氧羰基-L-天冬氨酸(Z-APM)和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(L-PM)发生缩合反应之后采用高压液相层析(HPLC)方法测定Z-APM合成活性。在35℃将经诱变的蛋白酶与溶于0.1M Tris-马来酸盐缓冲液(pH6或7)中的0.1M Z-Asp和0.1M L-PM一起保温30分钟。通过加入等体积的0.125MEDTA终止该反应。采用装备了cosmosil C-18柱(Nacalai tesque)的HPLC测定合成的Z-APM的量。用含有40％乙腈的60mM三乙胺-磷酸盐缓冲液(pH3.0)作为洗脱剂以1.0ml/分的流速完成HPLC。并在224nm处检测经洗脱的Z-APM的吸收值。将在1秒钟内合成1摩尔Z-APM的活性定义为1开特(kat)。
为了进行比较，申请人还利用随机诱变引物合成并检测了所有其他D150突变体。
随机诱变引物的核苷酸序列是(SEQ ID NO7)5′-AACGCATGCGGTAACCXXXTATACAGC-3′SphI 编码第150位氨基酸的密码子其中各个X分别表示为G、A、T或C。
该引物在第150位氨基酸残基的密码子处有变异，并且可以在第150位处引入所有20个氨基酸残基。利用该诱变引物我们已经在第150位处导入了各种突变，并对除色氨酸外的所有氨基酸进行了研究。
将1ng的pUBTZ2质粒溶于100μl的PCR反应混合物(67mM Tris-HCl pH8.8，16.6mM硫酸铵，6.7mM MgCl2，10mM 2-巯基乙醇，0.05mM dATP0.05mM dTTP，0.05mM dGTP，0.05mM dCTP，1μM诱变引物，1μM反方向引物)中，并加入1单位的Tth DNA聚合酶。用一滴矿物油覆盖该溶液。在93℃进行1分钟变性，在45℃进行1分钟退火并在72℃延伸45秒，该过程重复30次。反应之后，回收水层，用苯酚抽提并用乙醇处理，以回收经扩增的DNA。
在37℃用各5单位的SphI和AatI对含有一半量经扩增DNA的20μl反应混合物(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，0.1M NaCl，1mM DTT)进行2小时的消化，并在70℃保温5分钟。利用Takara Shuzo DNA连接试剂盒将经诱变的SphI-AatI片段与pUBTZ2的7.6kb SphI-AatI片段相连接。采用常规方法将该连接混合物用于转化大肠杆菌JM 103，得到转化子JM 103/pUBTZ2。通过确定该质粒的核苷酸序列而证实氨基酸的取代。
采用快速碱-SDS法分离除D150W突变体外的质粒DNA。采用感受态细胞法完成对枯草芽孢杆菌MT-2菌株的转化。
将各个不同枯草芽孢杆菌MT-2/pUBTZ2(突变体)转化子的单菌落接种于5ml含卡那霉素(5μg/ml)的LB培养基中并在37℃培养过夜。将该培养物转移到含卡那霉素(5μg/ml)的500ml的2L培养基(2％细菌培养用胰化蛋白胨，1％酵母抽提物，0.5％NaCl)中并于37℃培养20小时。将培养液于8,000rpm离心30分钟以除去细菌，向上清液中加入硫酸铵以达到60％饱和度，将该混合物在4℃搅拌过夜。
通过离心回收沉淀，并溶于10ml的缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH9.0，10mM CaCl2)中。将该酶溶液加到20ml丁基-Toyopearl中，随后用缓冲液A以1.5ml/分的流速进行洗脱。将活性组分进行合并用60％饱和碳酸铵进行盐析。通过以15,000rpm离心3D分钟而收集沉淀，并溶于5ml缓冲液B(20mMTris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2)中。将该酶溶液进一步加到凝胶过滤柱(TSK Gel G2000SW(21.5×300mm))上，随后用缓冲液B以1ml/分的流速进行洗脱。将活性组分合并得到各个经纯化的酶。
图12显示了经修饰蛋白酶的合成活性，该经修饰酶中第150位天冬氨酸残基由其他氨基酸残基取代(D150W突变体)。其第150位天冬氨酸残基被取代为色氨酸的突变体(D150W)明显地显示出高比活性即比野生型嗜热菌蛋白酶(D)高约4倍，而大多数的其他突变体显示出比野生型嗜热菌蛋白酶(D)更高活性，但这些活性比D150W低得多。色氨酸突变体活性显然是最高的。如表1所示，对另外两个称为2-位点突变体D150W-N227H(即第150位天冬氨酸转变为色氨酸以及第227位天冬酰胺转变为组氨酸)和3位点突变体L144S-D150W-N227H(即第144位亮氨酸转变为丝氨酸，第150位天冬氨酸转变为色氨酸以及第227位天冬酰胺转变为组氨酸)的多位点突变体测定的活性甚至更高。
(2)Z-APM的水解活性根据Inoue的方法(Inoue，K.，(1992)J.Biochem.，112，335-340)在224nm处吸收值降低之后检测由经修饰的蛋白酶将Z-APM水解成Z-Asp和PM。在35℃将溶于0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中的3ml 1mM Z-APM与经修饰的蛋白酶一起保温，并监测224nm处吸收值的降低。根据计算得到的摩尔吸收值差异Δε224为-493(M-1.cm-1)，测出被水解的Z-APM的量。
D150突变体的活性显示于图13中。D150W突变体明显地显示出比野生型嗜热菌蛋白酶高约4倍的高活性。其他大多数的突变体显示比野生型嗜热菌蛋白酶(D)的Z-APM水解的比活性仅高约1-3倍。色氨酸突变体明显具有高得多的活性。
D150W-N227H和L144S-D150W-N227H的活性也显示于表1中。其水解Z-APM的活性分别比野生型高6-7倍和9-10倍。
表1概括了经修饰的蛋白酶合成Z-APM和水解Z-APM的活性作用Z-APM的活性合成(开特/摩尔) 水解(开特/摩尔)酶 pH6pH7pH7.0野生型 0.063 0.137 3.5D150W0.261 0.623 11.9D150W/N227H 0.447 1.007 22.6L144S/D150W/N227H0.609 1.220 37.0*1开特(kat)的定义是每秒中合成或水解1摩尔Z-APM的活性。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称Sagami Chemical Research Center(B)街道4-5，Marunouchi 1-chome，Chiyoda-ku(C)城市东京(E)国家日本(F)邮编100(A)名称Holland Sweetener Company V.O.F(B)街道Blekerij 52，6212 XW(C)城市Maastricht(E)国家荷兰(F)邮编6201(G)电话31(0)43 21 22 28(H)传真31(0)43 21 66 33(I)电传56 384(ii)发明名称新的蛋白酶II(iii)序列数7(iv)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度316个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Aspl 5 10 15Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp20 25 30Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr35 40 45Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala50 55 60Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr65 70 75 80Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn85 90 95Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn100 105 110Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln115 120 125Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu130 135 140Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu145 150 155 160Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val165 170 175Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val180 185 190Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro195 200 205Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr210 215 220Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala225 230 235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr260 265 270Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 315(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)几何结构线性(ii)分子类型其他核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO2AACGCATGCG GTAACCTGGT ATACAGC 27(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)几何结构线性(ii)分子类型其他核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGATACCAC TTTATTTCAC CCCT 24(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)几何结构线性(ii)分子类型其他核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO4CGCAAGATCA TGGCGGGG 18(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)股数单链(D)几何结构线性
(ii)分子类型其他核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO5TACCGCATGC GTTGACTCAT GTGCGAC 27(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ii)分子类型其他核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO6CCGAATTTGG ACACGAAAGG ATCC 24(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ii)分子类型其他核酸(合成的DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO7AACGCATGCG GTAACCXXXT ATACAGC 2权利要求
1.一种嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的经修饰蛋白酶，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，其中第150位的天冬氨酸残基被色氨酸取代。
2.根据权利要求1所述的嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的经修饰蛋白酶，其中第227位的天冬酰胺残基被组氨酸取代。
3.根据权利要求1或权利要求2所述嗜热菌蛋白酶类中性金属蛋白酶的经修饰蛋白酶，其中第144位亮氨酸残基被丝氨酸取代。
4.权利要求1-3中任何一项所述的经修饰蛋白酶的应用，用于消化或合成苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
5.一种用于合成苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，该方法包括将权利要求1-3中任一项所述的经修饰蛋白酶与含有苄氧羰基-α-L-天冬氨酰和L-或D，L-苯丙氨酸甲酯的底物溶液接触。
6.一种用于消化苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，该方法包括将权利要求1-3中任一项的经修饰蛋白酶与含有苄氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的底物溶液相接触。
全文摘要
公开了一种经修饰的蛋白酶，它是具有SEQ IDNO1的氨基酸序列的热稳定中性金属蛋白酶的突变体，其中第150位天冬氨酸残基被色氨酸取代。
文档编号C12N9/52GK1141649SQ94194851
公开日1997年1月29日 申请日期1994年12月6日 优先权日1993年12月7日
发明者田中良和, 三宅俊男, 半泽敏, 大江正刚, 城所俊一, 三木洋一郎, K·远藤, 和田昭允 申请人:财团法人相模中央化学研究所, 荷兰加甜剂公司