来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法
【专利摘要】本发明提供来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)、其变体、编码AmyE或其变体的核酸，以及含有该核酸的宿主细胞。本发明公开了包括淀粉液化和/或糖化的使用AmyE或其变体的方法。此类方法可以产生用于乙醇产生或高果糖玉米糖浆产生的糖。在一些情况下，可以在低pH、不存在钙和/或不存在葡糖淀粉酶的情况下使用该淀粉酶。
【专利说明】来自枯草芽孢杆菌的变体Ct-淀粉酶及其使用方法
[0001]本申请是发明人于2009年6月5日提交的题为“来自枯草芽孢杆菌的变体淀粉酶及其使用方法”的中国专利申请200980129658.X的分案申请。
[0002]优先权
[0003]本申请要求2008年6月6日提交的美国临时专利申请61/059，513和61/059，618的优先权，这两个临时专利申请以其整体引入作为参考。
【技术领域】
[0004]提供来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的α -淀粉酶(AmyE)、其变体、编码AmyE或其变体的核酸以及含有该核酸的宿主细胞。公开了使用AmyE或其变体的方法，其包括淀粉液化和/或糖化。此类方法可以产生用于乙醇产生或高果糖玉米糖浆产生的糖类。在一些情况下，可以在低pH、不存在钙和/或不存在葡糖淀粉酶的情况下使用这些淀粉酶。
【背景技术】
[0005]谷粒、谷物和植物淀粉，例如玉米淀粉被广泛用于工业制gr1-如糖浆和生物燃料的产物。例如，高果糖玉米糖浆(HFCS)是加工形式的玉米糖浆，其具有高果糖含量和与糖相当的甜度，使得HFCS可在软饮料和其他加工食物中用作糖替代物。HFCS生产目前代表了十亿美元的产业。生产乙醇作为生物燃料也是不断增长的产业。
[0006]可以通过催化淀粉降解为葡萄糖的酶促方法从淀粉产生糖浆和生物燃料。此酶促方法通常涉及一系列酶催化的反应。
[0007](I)液化:`0【.淀粉酶(EC3.2.1.1)首先催化可含有30-40% w/w干固体(ds)的淀粉悬液降解为麦芽葡聚糖(maltodextran)。α -淀粉酶是催化随机切割内部的α -1, 4-D-糖苷键的内水解酶(endohydrolase)。因为通常在高温,例如90_100°C下进行液化，所以优选将热稳定的α -淀粉酶，如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α -淀粉酶用于此步骤。目前用于此步骤的α -淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)、解淀粉芽抱杆菌(B.amy1Iipuefaciens)和嗜热脂肪芽抱杆菌(B.stearothermophiIus)(AmyS)的α -淀粉酶不产生显著量的葡萄糖。相反,产生的液化产物(Iiquefact)具有低葡萄糖当量(DE)且含有麦芽糖和高聚合度(DPn)糖类。
[0008](2)糖化:葡糖淀粉酶和/或产麦芽糖α -淀粉酶催化液化后形成的麦芽葡聚糖的非还原端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。糖化产生富含葡萄糖的糖浆或高麦芽糖糖浆。在前者的情况下，葡糖淀粉酶通常于升高的温度在酸性条件下催化糖化，例如在60°C、pH4.3下。用于此方法中的葡糖淀粉酶通常获自真菌，例如用于Optidex? L400中的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐质霉(Humicula grisea)葡糖淀粉酶。脱支酶，如支链淀粉酶可以辅助糖化。
[0009]备选地，产麦芽糖(maltogenic) α-淀粉酶可以催化糖化来形成高麦芽糖糖浆。产麦芽糖α -淀粉酶通常具有比葡糖淀粉酶更高的最适PH和更低的最适温度，且产麦芽糖淀粉酶通常需要Ca2+。目前用于此应用中的产麦芽糖α -淀粉酶包括枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、植物淀粉酶以及来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α -淀粉酶(Clarase? L的
活性成分)。用于产生多种产物的示例性糖化反应显示于以下:
[0010]
【权利要求】
1.分离的变体多肽，其具有α-淀粉酶活性和至少一种改善酶性能的改变的特征，所述变体多肽包含与选自AmyE的亲本α -淀粉酶多肽(SEQID NO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或与AmyE的截短变体(SEQ ID NO: 2)具有至少92%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自1、43、100、131、142、200、226、254、402和424的一个或多个位置上的修饰，其中所述修饰产生就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.0的性能指数(PI)的变体多肽。
2.权利要求1的变体多肽，其在选自1、43、100、131、142、200、226、254、402和424的一个或多个位置上包含修饰，其中所述修饰产生就蛋白质表达而言具有大于0.5的性能指数(ΡΙ)，且就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.1的PI的变体多肽。
3.权利要求1的变体多肽，其中所述一个或多个位置选自1、43、100、131、142、200、226、254、402和424，该位置在全长或截短亲本多肽中对性能而言是非完全限制性的。
4.权利要求1的变体多肽，其中所述修饰是在选自1A、43M、100M、100L、131H、142S、142Y、200N、2261、2541、254V、402M和424A的一个或多个位置上，将存在于亲本多肽中的一个或多个氨基残基取代为不同的氨基酸残基。
5.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置I上的氨基酸残基改变为A，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
6.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置43上的氨基酸残基改变为M，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
7.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置100上的氨基酸残基改变为L或M，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
8.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置131上的氨基酸残基改变为H，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
9.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置142上的氨基酸残基改变为S或Y，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
10.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置200上的氨基酸残基改变为N，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
11.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置226上的氨基酸残基改变为I，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
12.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置254上的氨基酸残基改变为I或V，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
13.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置402上的氨基酸残基改变为M，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
14.权利要求4的变体多肽，其中所述取代将存在于位置424上的氨基酸残基改变为A，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
15.权利要求1的变体多肽，其中所述亲本多肽与SEQID NO: 3的氨基酸序列具有至少97%氨基酸序列同一性。
16.权利要求1的变体多肽，其中所述改善酶性能的特征选自提高的热稳定性、提高的比活和提闻的蛋白质表达。
17.洗涤剂组合物，其含有权利要求1的变体多肽。
18.淀粉转化组合物，其含有权利要求1的变体多肽。
19.权利要求18的淀粉转化组合物，其进一步包含具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
20.分离的变体多肽，其具有α-淀粉酶活性和至少一种改善酶性能的改变的特征，所述变体多肽包含与选自AmyE的亲本α -淀粉酶多肽(SEQID NO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或与AmyE的截短变体(SEQ ID NO: 2)具有至少92%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及包含选自35、56、65、158、189、192、298、320、386和395的一个或多个位置上的修饰，其中所述修饰产生就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.0的性能指数(PI)的变体多肽。
21.权利要求20的变体多肽，其在选自35、56、65、158、189、192、298、320、386和395的一个或多个位置上包含修饰，其中所述修饰产生就蛋白质表达而言具有大于0.5的性能指数(ΡΙ)，且就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.1的PI的变体多肽。`
22.权利要求20的变体多肽，其中所述一个或多个位置选自35、56、65、158、189、192、298、320、386和395，该位置在全长或截短亲本多肽中对性能而言是非完全限制性的。
23.权利要求1的变体多肽，其中所述修饰是在选自T35V/1、S56W/R、Τ65Ι、L158V、Y189F、Q192N/E、G298L、S320T、A386R和D395K的一个或多个位置上，将存在于亲本多肽中的一个或多个氨基残基取代为不同的氨基酸残基。
24.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置35上的氨基酸残基改变为V或I，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
25.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置56上的氨基酸残基改变为W或R，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
26.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置65上的氨基酸残基改变为I，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
27.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置158上的氨基酸残基改变为V，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
28.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置189上的氨基酸残基改变为F，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
29.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置192上的氨基酸残基改变为N或E，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
30.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置298上的氨基酸残基改变为L，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
31.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置320上的氨基酸残基改变为T，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
32.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置386上的氨基酸残基改变为R，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
33.权利要求23的变体多肽，其中所述取代将存在于位置395上的氨基酸残基改变为K，且与亲本多肽相比，所述变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。
34.权利要求20的变体多肽，其中所述亲本多肽与SEQID NO:3的氨基酸序列具有至少97%氨基酸序列同一性。
35.权利要求20的变体多肽，其中所述改善酶性能的特征选自提高的热稳定性、提高的比活和提闻的蛋白质表达。
36.洗涤剂组合物，其含有权利要求20的变体多肽。
37.淀粉转化组合物，其含有权利要求20的变体多肽。
38.权利要求37的淀粉转化组合物，其进一步包含具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
【文档编号】C12R1/125GK103773749SQ201410016942
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2009年6月5日 优先权日:2008年6月6日
【发明者】L·卡斯考-佩雷拉, W·A·奎瓦斯, D·A·埃斯特尔, 李祥揆, S·D·鲍尔, S·W·拉默, A·R·托波扎达, L·华莱士 申请人:丹尼斯科美国公司