菊属及近缘属植物通用ssr分子标记cssr2及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2，用于PCR扩增所述标记CSSR2的引物序列如Seq?ID?No.1和2所示。本发明还提供了所述SSR标记在菊属与亚菊属的属间杂交种鉴定中的应用。另外，本发明还提供了扩增所述SSR分子标记的方法，建立了一个在菊属、亚菊属和太行菊属的植物材料之间通用的SSR分子标记技术体系，该标记可以用于进行菊属，亚菊属及太行菊属属内和属间的杂种鉴定，植物遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种等，应用前景十分广阔。
【专利说明】菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2及应用。
【背景技术】
[0002]菊属(Chrysanthemum)属于双子叶植物纲菊科，原产于我国的菊属植物主要有:野菊(C.1ndicum)、神农香菊(C.1ndicum var.aromaticum),毛华菊(C.vestitum)、甘菊(C.1avandulifolium)> 小红菊(C.chanetii )、紫花野菊(C.zawadskii )、菊花脑(C.mankingense)等。其中，菊花(Chrysanthemum morrofolium)是观赏价值最高的种，菊花是中国十大名花和世界四大切花之一，在中国有三千多年的栽培历史，形成了花型丰富、花色多样的品种群。除观赏价值外，菊属植物还有很高的药用价值和食用价值等。菊花含有水苏碱、刺槐甙、木樨草甙、大波斯菊甙、腺膘呤、胆碱、葡萄糖甙等成分，尤其富含挥发油，并且油中主要为菊酮、龙脑、龙脑已酸酯等物质。功效作用方面，菊花具有平肝明目、散风清热、消咳止痛的功效，用于治疗头痛眩晕、目赤肿痛、风热感冒、咳嗽等病症效果显著。
[0003]亚菊属(Ajania),属于双子叶植物纲菊科，主要分布于我国除东南半壁以外的广大地区。蒙古、苏联及朝鲜北部和阿富汗北部也有少数种。亚菊属的野生种矶菊(A.acificum)，原产于我国台湾和日本，已经较为广泛的应用于我国东南沿海以及日本、荷兰等国的园林中， 作为地被以及盆栽植物栽培。其叶片光亮革质具有较高的观赏价值。菊花育种工作者也把矶菊作为亲本和菊属植物进行杂交育种，以提高菊花的枝叶观赏性。
[0004]太行菊属(Opisthopappus),菊科,包括太行菊(0.taihangensis)和长裂太行菊(0.1ongilobus)两种，主要分布于我国山西、河北、河南等地，植株匍匐生长，多生于陡坡，峭壁的岩石缝隙中，耐瘠薄，耐寒以及耐旱性强，已成为园艺工作者的重要育种材料。
[0005]亚菊属和太行菊属作为菊属的近缘属，已成为新的种质资源被菊花育种工作者用来与菊花进行远缘杂交，以提高现有菊花品种群的抗性和观赏性。
[0006]简单重复序列(simplesequence repeat, SSR),也称微卫星 DNA(microsatellite),是一种由2~5个核苷酸为单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。这些序列广泛存在于真核生物基因组的不同座位上，每个座位重复单位的数量可能不完全相同，因而形成多态性。由于其具有多态性丰富、重复性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于植物的群体和进化遗传研究、种质资源遗传多样性分析、指纹图谱构建等领域。
[0007]然而，目前菊花的SSR标记开发处于起步阶段，亚菊属(Ajania)和太行菊属(Opisthopappus)由于缺乏基因序列信息，尚未发现SSR标记开发相关研究的报导；因此目前亚菊属(Ajania)和太行菊属(Opisthopappus)还没有SSR分子标记被开发出来,也没有能够用于菊属以及近缘属之间通用的SSR标记；因此，开发菊属、亚菊属和太行菊属微卫星标记，对于菊属，亚菊属和太行菊属的野生资源的开发利用，开展属间远缘杂交育种以及分子水平研究具有重要意义。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2及应用。
[0009]为了实现本发明目的，本发明的一种菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2，用于PCR扩增分子标记CSSR2的引物对为:
[0010]上游引物:5’-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’和
[0011]下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
[0012]本发明中涉及的近缘属植物包括但不限于菊属(Chrysanthemum)、亚菊属(Ajania)、太行菊属(Opisthopappus)等。
[0013]本发明还提供所述分子标记在菊属及近缘属植物属内或属间杂种鉴定、植物材料遗传多样性分析、指纹图谱构建及分子标记辅助育种等方面的应用。
[0014]本发明进一步提供一种鉴定菊属及近缘属植物品种的方法，包括以下步骤:
[0015]I)提取待测植物的基因组DNA ；
[0016]2)以待测植物的基因组DNA为模板，利用上述用于PCR扩增分子标记CSSR2的引物对进行PCR扩增；
[0017]3 )检测PCR扩增产物。
[0018]步骤2)中PCR反应体系为:引物各0.32 μ Μ/μ L，Taq DNA聚合酶0.2U/μ L，dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 DNA2 ~4ng/ μ L，以 ddH20 配制。
[0019]步骤2)中 PCR 扩增程序为-MV 5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min，72°C lmin,共 30 个循环；72°C 5min。优选地，PCR 扩增程序为-MV 5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72 °C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
[0020]本发明首次提供一种在菊属、亚菊属和太行菊属的植物材料之间通用的SSR分子标记一CSSR2。本发明还提供了该SSR标记在菊属与亚菊属的属间杂交种鉴定中的应用。另外，本发明还提供了扩增该SSR位点的引物序列和扩增方法，建立了一个在菊属、亚菊属和太行菊属的植物材料之间通用的SSR分子标记技术体系，该标记可以用于进行菊属，亚菊属及太行菊属属内和属间的杂种鉴定，植物遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种等，应用前景十分广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明CSSR2位点的SSR引物扩增的菊属、亚菊属及太行菊属植物材料基因组DNA的STR分型图；其中，I~28分别对应表1中列出的菊属、亚菊属及太行菊属的28种植物材料，横坐标代表扩增产物大小，纵坐标代表扩增强度。
[0022]图2为亚菊属野生种矶菊(母本)，菊属地被菊品种“铺地淡粉”(父本)，及其杂交后代 AP1、AP2、AP3。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明 本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。[0024]实施例1菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2的获得
[0025](I)在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Genbank/)下载网站上截至2012年4月公布的所有菊属植物的7180个EST序列，应用CAP3软件进行拼接处理，得到拼接基因序列。然后利用SSRIT软件(http://www.gramene.0rg/db/markers/ssrtool)进行SSR位点搜索,然后利用Primer Premier5.0软件进行SSR位点上、下游引物的设计。
[0026]其中扩增所述分子标记CSSRl和CSSR2的引物为如下引物对:
[0027]CSSR2 上游引物 F: 5’ -TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3’
[0028]CSSR2 下游引物 R: 5，-CACATAACCACCACTACCACCA-3’
[0029](2)提取了菊属(Chrysanthemum)、亚菊属(Ajania),太行菊属(Opisthopappus)的常见植物材料的DNA样品(见表1)。
[0030]表1菊属、亚菊属和太行菊属的植物材料
[0031]
【权利要求】
1.菊属及近缘属植物通用SSR分子标记CSSR2，其特征在于，用于PCR扩增分子标记CSSR2的引物对为: 上游引物:5，-TTCGCTCACTCACTCACTCACA-3，和 下游引物:5’-CACATAACCACCACTACCACCA-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述近缘属植物包括但不限于菊属(Chrysanthemum)、亚菊属(Ajania)、太行菊属(Opisthopappus)。
3.权利要求1或2所述分子标记在菊属及近缘属植物属内或属间杂种鉴定、植物材料遗传多样性分析、指纹图谱构建及分子标记辅助育种中的应用。
4.一种鉴定菊属及近缘属植物品种的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取待测植物的基因组DNA； 2)以待测植物的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的用于PCR扩增分子标记CSSR2的引物对进行PCR扩增； 3)检测PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为:引物各0.32 μ M/ μ L, Taq DNA 聚合酶 0.2U/ μ L, dNTP0.4 μ M/ μ L, Mg2+0.65 μ M/ μ L,模板 2 ~4ng/μ L,以ddH20配制。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增程序为:94°C5min ；94°C 0.5min，50 ~62°C 0.5min,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。`
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增程序为:94°C5min ；94°C 0.5min,58°C 0.5min,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述近缘属植物包括但不限于菊属、亚菊属、太行菊属。
【文档编号】C12N15/11GK103773762SQ201410016955
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】张启翔, 刘华, 孙明, 高亦珂, 潘会堂, 程堂仁, 王佳, 杨炜茹 申请人:北京林业大学