专利名称：一种新的头孢菌素c酰基转移酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的头孢菌素C酰基转移酶(此后简称为“CC酰基转移酶”)。本发明特别涉及一种新的由蛋白质工程产生的突变体CC酰基转移酶，其编码DNA，含有所述DNA的表达载体，一种用所述的表达载体转化的微生物以及经培养所述转化体得到的CC酰基转移酶的产物。
头孢菌素C酰基转移酶是一种酶的总称，它们都能水解头孢菌素C产物7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
迄今为止，已发现了三种酶可被归类为CC酰基转移酶，即头孢菌素C酰基转移酶SE83、N176和V22，它们的氨基酸序列已在Journalof Fermentation和Bioengineering Vol 72，232-243(1991)上公开。此文献中，CC酰基转移酶的氨基酸序列编号是从其N-末端部分的蛋氨酸基团开始。然而，在本说明书中，CC酰基转移酶的氨基酸序列编号是从其N-末端部分蛋氨酸基团相邻的苏氨酸基团开始，因为通过原核生物来表达CC酰基转移酶基因所得到的成熟CC酰基转移酶的α-亚基的N-端蛋氨酸被酶(如氨肽酶)去掉，生成一以苏氨酸基团做为其N-末端氨基酸的成熟CC酰基转移酶。通过重组DNA技术得到的天然型CC酰基转移酶的产物也已在所述的文章中公开，并发现表达的CC酰基转移酶在细胞内部被加工成一包含α-亚基和β-亚基的活化形式。然而，在大肠杆菌中，加工效率通常不高。从广泛的研究结果来看，本发明的发明人在产生突变体CC酰基转移酶上是成功的，这些酶具有满意的性质，可归纳为高的酶效力、pH分布型(profile)改变、加工效率高等等。
本发明的新突变体CC酰基转移酶的特性可归纳如下一种突变体CC酰基转移酶，其中在天然CC酰基转移酶的氨基酸序列的Ala49、Met164、Ser166、Met174、Glu358、Met465、Met506或Met750位置上至少有一个氨基酸被不同的氨基酸取代。
优选的取代Met164的不同氨基酸的实例包括中性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等等。
取代Ser166、Met174、Met465、Met506和/或Met750的不同氨基酸的优选实例可包括中性氨基酸如丙氨酸等。
取代Glu358的不同氨基酸的优选实例可包括中性氨基酸(如异亮氨酸等)，碱性氨基酸(如赖氨酸等)等等。
取代的Ala49的不同氨基酸的最优选实例是亮氨酸。
本发明的突变体CC酰基转移酶也可以通过用一个不同的氨基酸，取代天然CC酰基转移酶的氨基酸序列其它位置的至少一个氨基酸制备的。例如，用一个或多个不同的氨基酸取代突变体CC酰基转移酶的Met269和/或Cys305。
突变体CC酰基转移酶的一个优选实例可用下面的式子代表，此式是CC酰基转移酶加工成其α-亚基和β-亚基前的前体形式A1-48-X1-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773其中A1-48与天然CC酰基转移酶的Thr1到Glu48具有相同的氨基酸序列。
A50-163与天然CC酰基转移酶的Asp50到Leu163具有相同的氨基酸序列。
A167-173与天然CC酰基转移酶的Val167到Arg173具有相同的氨基酸序列。
A175-357与天然CC酰基转移酶的Leu175到Val357具有相同的氨基酸序列。
A359-464与天然CC酰基转移酶的Thr359到Ala464具有相同的氨基酸序列。
A466-505与天然CC酰基转移酶的Pro466到Ile505具有相同的氨基酸序列。
A507-749与天然CC酰基转移酶的Lys507到Ala749具有相同的氨基酸序列。
A751-773与天然CC酰基转移酶的Val751到Ala773具有相同的氨基酸序列。
X1是丙氨酸或一种不同的氨基酸，X2、X4、X6、X7和X8各为蛋氨酸或一种不同的氨基酸，X3是丝氨酸或一种不同的氨基酸，以及X5是谷氨酸或一种不同的氨基酸，条件是Met269和/或Cys305可由一个或多个不同的氨基酸取代，当X1是丙氨酸，X2、X4、X6、X7及X8均为蛋氨酸，X3是丝氨酸以及X5是谷氨酸以外的一种氨基酸。
在本说明书中，给特定的突变体CC酰基转移酶的名称采用方便的命名法，例如根据此命名，通过用亮氨酸取代天然CC酰基转移酶的氨基酸序列第164位的蛋氨酸制得的突变体CC酰基转移酶，称为突变体CC酰基转移酶M164L，其中M是被取代的蛋氨酸(一种氨基酸)残基的单字母缩写，164是天然CC酰基转移酶氨基酸序列的位置号，L是用来取代蛋氨酸(前氨基酸)残基的亮氨酸(不同的氨基酸)的单字母缩写。另外，再如突变体CC酰基转移酶M164L和M164A分别是用亮氨酸和丙氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸序列的164位的蛋氨酸残基后得到的。突变体CC酰基转移酶M164L/M174A/M269Y是通过以下方式得到的，用亮氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸序列164位的蛋氨酸残基，用丙氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸序列174位的蛋氨酸残基和用酪氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸序列269位的蛋氨酸残基。
本发明的突变体CC酰基转移酶可以通过重组DNA技术，多肽合成等方法制备。
即，新的CC酰基转移酶可以通过在营养介质中培养宿主细胞并从液体培养基中回收新CC酰基转移酶来制备。此宿主细胞是用含编码新CC酰基转移酶氨基酸序列的DNA的表达载体转化了的。
此过程的细节在下面有更详细的解释。
宿主细胞可以是微生物[细菌(如大肠杆菌、枯草杆菌等)，酵母菌(如啤酒酵母菌等)，动物细胞系以及培养的植物细胞]。优选的微生物实例包括细菌(特别是属于埃希杆菌属的菌株(如E.coliJM109 ATCC 53323，E.coli HB101 ATCC 33694，E.coli HB101-16 FERM BP-1872，E.coli 294 ATCC 31446等))、酵母菌(特别是属于酵母菌属的菌株，如啤酒酵母菌AH 22)、动物细胞系(如小鼠L929 细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等)等等。
当一种细菌，特别是E.coli被用作宿主细胞时，表达载体通常至少包括启动子一操纵基因区，起始密码子，编码新CC酰基转移酶氨基酸的DNA，终止密码子、终止子区以及可复制单位。当酵母菌或动物细胞被用做宿主细胞时，表达载体优选的至少包含启动子，起始密码子，编码信号肽和新CC酰基转移酶氨基酸序列的DNA，以及终止密码子，将增强子序列，新CC酰基转移酶的5′-和3′-非编码区，剪接接界，聚腺苷酸化位点以及可复制单位也可插入表达载体。
启动子-操纵基因区由启动子、操纵基因和Shine-Dalgarno(SD)序列(例如AAGG等)组成。优选的启动子一操纵基因区可包括常规使用的启动子-操纵基因区(如E.coli的PL-启动子和trp-启动子)和CC酰基转移酶N-176染色体基因的启动子。用于酵母菌的新CC酰基转移酶表达的启动子可包括TRP1基因的启动子、ADHI或ADHII基因以及啤酒酵母菌的酸性磷酸酶(pH05)基因。用于哺乳动物细胞新CC酰基转移酶表达的启动子可包括SV40早期和晚期启动子，HTLV-LTR-启动子，鼠金属硫蛋白I(MMI)-启动子，痘苗一启动子等等。
优选的起始密码子可包含蛋氨酸密码子(ATG)。
信号肽可包含常规使用的其它酶的信号肽(天然t-PA信号肽，天然纤溶酶原的信号肽)等等。
编码新CC酰基转移酶氨基酸序列的DNA可采用常规方法制备，如用DNA合成仪部分或全部合成DNA和/或处理来自转化体的插入一合适的载体的编码天然CC酰基转移酶的完整DNA序列(如PCCN 176-2)而得，此载体除了用一种合适的酶(如限制性酶、碱性磷酸酶、聚核苷酸激酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等)处理外，采用合适的方法如常规突变方法(如暗盒突变法(cf.Tokunaga，T.et al.，Eur.J.Biochem.153，445-449(1985))，PCR突变方法(cf.Higuchi，R.et al.，Nucleic Acids Res.16，7351-7367(1988))，Kunkel′s方法(cf.Kunkel，T.A.et al.，Methods Enzymol，154，367(1987)等)。
终止密码子可包括常规使用的终止密码子(如TAG，TGA等)。
终止子区可包括天然或合成的终止子(如合成的fd噬菌体终止子等)。
可复制单位是一个DNA化合物，它能在宿主细胞中复制属于此处的整个DNA序列，并且可以包含天然质粒，人工修饰的质粒(如从天然质粒制备的DNA片段)和合成质粒。质粒的优选实例对E.coli可包括质粒pBR 322和它的人工修饰质粒(从适当的限制酶处理PBR 322而得到的DNA片段)，对酵母菌来说可是酵母2μ质粒和酵母染色体DNA，对哺乳动物细胞可以是质粒pRSVneo ATCC 37198，质粒pSV2dhfrATCC 37145，质粒pdBPV-MMTneo ATCC 37224和质粒pSV2neo ATCC37149。
增强子序列可包含SV40的增强子(72b.p.)。
聚腺苷酸化位点可包含SV40的聚腺苷酸化位点。
剪接接界可包含SV40的剪接接界。
启动子、起始密码子、编码新CC酰基转移酶氨基酸序列的DNA、终止密码子和终止子区可连续地环化地与一个适当的可复制单位(质粒)连接，如果需要，用适当的DNA片段(如接头，其它限制位点等)用常规方式(如用限制酶消化，用T4DNA连接酶连接)以得到一个表达载体。
宿主细胞能被表达载体转化(转染)。转化(转染)可用一常规方式(如用于E.coli的Kushner方法，用于哺乳动物细胞的磷酸钙法，显微注射等)进行以产生转化体(转染体)。
对于通过本发明方法产生新CC酰基转移酶，如此获得的含有表达载体的转化体在水溶性营养介质中培养。
所用的营养介质含有碳源(如葡萄糖、甘油、甘露糖醇、果糖、乳糖等)和无机或有机氮源(如硫酸铵、氯化铵、酪蛋白水解液、酵母膏、聚蛋白胨、细菌用胰化胨、牛肉膏等)。如果需要，其它营养源[如无机盐(像磷酸二氢钠、钾、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钙)，维生素(如维生素B1)，抗生素(如氨苄青霉素，卡那霉素)等等]可以加入到培养基中。对于哺乳动物细胞二培养，常用加有胎牛血清和一种抗生素的Dulbecco′s Modified Eagle′s MinimumEssential Medium(DMEM)培养基。
转化体(包括转染体)的培养通常是在pH 5.5-8.5(优选pH 7-7.5)和18-40℃(优选20-30℃)进行5-50小时。
当经如此产生的新CC酰基转移酶存在于培养液中，培养滤液(上清液)通过过滤或离心液体培养基得到。从培养滤液中，新CC酰基转移酶可以用一般用来纯化和分离天然或合成蛋白的的常规方法来纯化(如透析、凝胶过滤、采用抗-CC酰基转移酶单克隆抗体的亲合柱层析、在合适吸附剂上的柱层析、高效液相色谱等等)。如果产生的新CC酰基转移酶存在于培养转化体的外周质和细胞质中，用过滤或离心来收集细胞，其细胞壁或细胞膜用如超声波和/或溶菌酶处理加以破坏产生碎片和/或裂解物。此碎片和/或裂解物可溶于适当水溶液中(如8M水溶尿素，6M水溶quanidium盐)。新CC酰基转移酶可从该溶液中用上面举例的常规方法加以纯化。
本发明进一步提供了一个制备如下式的化合物或其盐的方法 此处R1是乙酰氧基、羟基或氢，该方法包含分子式如下的一个化合物或其盐 此处R1如上面所定义，R2是羧酸酰基，与由包含编码本发明的新CC酰基转移酶DNA的表达载体转化的微生物的培养基或其加工材料接触。
R2的羧酸酰基可以是脂肪、芳香或杂环羧酸酰基，其适宜的实例是C1-C6链烷酰基，它可以带有选自氨基、羟基、羰基、C1-C6链烷酰氨、苯甲酰氨基、噻吩基等等的一或二个合适的取代基。
化合物(I)和(II)的适宜的盐可以是碱金属盐(如钠盐、钾盐、锂盐)。
如果CC酰基转移酶活性通常存在于转化细胞中，下面的制备方法可做为液体培养基的加工物质的例证。(1)原始细胞用常规方式，如过滤、离心，从液体培养基中分离；(2)干燥细胞用常规方式，如冷冻干燥和真空干燥，干燥所述原始细胞而得到；(3)无细胞抽提物用常规方式(如用有机溶剂使细胞自溶，用氧化铝、海沙等研磨细胞，或用超声波处理细胞)，通过破坏所述原始细胞或干燥细胞获得。(4)酶溶液用常规方式(如柱层析)，通过纯化或部分纯化所述的无细胞提取物获得；(5)固定细胞或酶用常规方式(如丙烯酰胺、玻璃珠、离子交换树脂等方法)，通过固定所述的细胞和酶来制备。
包含化合物(II)与酶接触的反应可以在水性介质，如水或缓冲液中进行，也就是说，常常通过把培养基或其加工物质溶于或悬浮于像水或缓冲液那样的含有化合物(II)的水性介质中来进行反应。
优选的反应混合物的pH，化合物(II)的浓度，反应时间及反应温度可随所用的培养基或其加工物质的性质有所变化。一般地，反应在pH6到10，优选pH7到9；在5到40℃，优选5到37℃下进行0.5到50小时。
在反应混合物作为底物的化合物(II)的浓度可优选自从1到100mg/ml范围。
以常规方式，可从反应混合物中分离纯化由此得到的化合物(I)。
根据下面提到的步骤测定突变酰基转移酶的比活。i)GL-7ACA酰基转移酶活性在预先在37℃温育10分钟的500μlGL-7ACA溶液[10mg/ml，于0.15M Tris·HCl(pH 7.5)]中，加入20ml酰基转移酶样品，混合物于37℃保温5分钟。加入550μl5％乙酸中止反应。所得混合物离心后(在环境温度下10,000rpm离心5分钟)，上清液用于测定7ACA形成。
HPLC条件柱TSKgel ODS-80 TMCTR 4.4mm×100mm(TOSOH)；洗脱液100mM柠檬酸，14.3％(v/v)乙腈中的5.0mM正己烷-1-磺酸钠；流速1.0ml/min；进样体积10μl；检测器254nM。
一个活力单位定义为在37℃，每分钟能从GL-7ACA合成1.0μmol7ACA的活性。
ii)CC酰基转移酶活性在37℃预保温10分钟的500μlCC溶液中[10mg/ml，在0.15M Tris·HCl(pH 8.7)中的头孢菌素C钠盐，用1N NaOH重调pH至8.7)，加入20μl酰基转移酶样品，并将混合物于37℃温育10分钟。加入550μl 5％乙酸终止反应。离心(在环境温度下10,000rpm 5分钟)所得混合物，上清液用于7ACA形成的测定。
HPLC条件柱TSKgel ODS-80 TMCTR 4.4mm×100mm(TOSOH)；洗脱液100mM柠檬酸，14.3％(v/v)乙腈中5.0mM正己烷-1-磺酸钠；流速1.0ml/min；进样体积20μl，检测器254nM。
一个活力单位定义为在37℃，每分钟能从头孢菌素C钠盐合成1.0μmol 7ACA的活性。
附图的简要解释如下
图1表示用于本说明书工作实施例的DNA寡聚体。
图2是构建pCC001A的图示。
图3是构建pCC002A的图示。
图4是构建pCK002的图示。
图5是构建pCC007A和pCCNt013的图示。
图6是构建pCC013A的图示。
图7是构建pΔN176和pCK013的图示。
图8是制备mp18p181和mp18p183的图示。
图9是制备mp18p181M164A、mp18p181M174A、pCKM174A和pCKM164A的图示。
图10是制备pCKS166A的图示。
图11是制备pCKM164L和pCKM164G的图示。
图12是构建mp19pfu62的图示。
图13是制备RF DNAs(mp19pfu62M465A、mp19pfu62M506A和mp19pfu62M750A)和表达载体(pCKM465A、pCKM506A和pCKM750A)的图示。
图14是制备p269I358K、p269I358S和p269I358L的图示。
图15是制备pCCE358R和pCCE358T的图示。
图16是制备p164L269Y、p164L269F和p164L269Y305S的图示。
图17是制备p164L174A和p164A174A的图示。
图18是制备p164A269Y、p164L174A269Y、p164L174A269F和p164A174A269Y305S的图示。
图19是制备p164L174A269Y305S750A的图示。
图20是制备pCKA49L的图示。
图21是制备p49L164L174A269Y的图示。
图22表示突变体CC酰基转移酶M164A的核苷酸及氨基酸序列。
图23表示突变体CC酰基转移酶S166A的核苷酸及氨基酸序列。
图24表示突变体CC酰基转移酶M269I/E358K的核苷酸及氨基酸序列。
图25表示突变体CC酰基转移酶M164L/M174A/M269Y的核苷酸及氨基酸序列。
图26表示突变体CC酰基转移酶A49L的核苷酸及氨基酸序列。
下面的实施例中，一些质粒、酶(如限制性酶，T4 DNA连接酶)及其它材料是从商业途径获得，并参照供应商的说明使用。特别地，在实施例中用作起始材料的质粒pCCN176-2和质粒pTQiPAΔtrp已保藏于一个国际性保藏单位-National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology in Japan，分别做为转化体E.coli JM109(pCCN176-2)FERM BP-3047和转化体E.coli HB101-16(pTQiPAΔtrp)FERMBP-1870，根据USP 5,192,678和欧洲专利申请公布No.302456很易得到。其它质粒等可根据说明书的描述，从所述pCCN176-2，pTQiPAΔtrp和可购得的质粒容易地制备。用于DNA克隆，宿主细胞转化、转化体的培养、从培养基中回收新CC酰基转移酶等操作在技术上是共知的，或可由文献改动。
下列实施例其目的是为了解释本发明，而本发明不只限于此。实施例1(寡脱氧核糖核苷酸的合成)DNA寡聚体SO-M164A[如图1(a)所列]是用381A DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.)合成的。此DNA用28％氨水从CPG聚合物载体(CPG可控多孔玻璃)上释放出来，随后在60℃加热9小时以脱除所有保护基团。反应混合物真空蒸干，残留物溶于200μl TE缓冲液[10mM Tris·HCl(PH 7.4)-1mM EDTA]中，所得粗DNA溶液用反相HPLC分离[柱子COSMOSIL C18 4.6mm×150mm(Nacalai Tesqul)，洗脱液A0.1M乙酸三乙胺缓冲液(pH 7.2-7.4)，B乙腈，梯度起始A(100％)，终止A(60％)+B(40％)，25分钟内线性梯度，流速1.2ml/min]。收集含有目的DNA寡聚体的洗脱液并真空蒸干。纯化的DNA溶于200μl TE缓冲液，使用前贮存于-20℃。
图1所列所有其它DNA寡聚体用上述相似方式合成和纯化。实施例2(在trp启动子控制下的天然CC酰基转移酶N176的表达载体的制备)(1)构建pCC002A，它是天然CC酰基转移酶N176的氨苄青霉素抗性表达载体(i)构建pCC001A质粒pCCN176-3[从质粒pCCN176-2(用常规方法从转化体E.coli JM109(pCCN176-2)FERM BP-3047得到)制备该质粒的方法在JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERINGVol 72，1991的235页公开](1.0μg)用EcoRI和HindIII滴化，含有CC酰基转移酶N176全部编码区的2.9kb片段通过琼脂糖凝胶电泳分离。另外，突变体t-PA[用常规方式及在欧洲专利申请公布No.302456中公开的制备方法可从转化体E.coli HB101-16CpTQiPAΔtrp)FEPM BP-1870获得]的表达载体pTQiPAΔtrp(1.0μg)用XmaI和XhoI消化，并分离较大的DNA(5113bp)。合成的DNA寡聚体CT-1(5’-CCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA)，CT-2(5’-AGCTTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCTAGGTAGTTGGTAACCTTGGTGTACACAC)，TR-1(5’-AGCTTGTCCTCGAGATCAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTTG)and TR-2(5’-TCGACAAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGATCTCGAGGACA)用T4聚核苷酸激酶磷酸化并用T4DNA连接酶连接得到XmaI/SalI DNA片段(114bp)，得到的DNA片段与XmaI/XhoI DNA连接从而得到pTQiPAdtrp。pTQiPAdtrp(1.0μg)用EcoRI和HindIII消化。分离得到的4.3kb DNA含trp启动子的t-PA编码区的一部分(Cys92到Trp113)及fd噬菌体中央终止子的复制序列。将2.9kb和4.3kb DNA片段混合，在16℃及T4DNA连接酶(300单位，Takara Shuzo)存在情况下，于50mM Tris·HCl，10mM MgCl2，10mM 二巯苏糖醇和1mM ATP组成的40μl连接缓冲液中连接5小时。连接混合物用于转化E.coli JM109。从抗氨苄青霉素的转化体可以得到称作pCC001A的目的质粒，并通过限制酶切作图鉴定。(ii)构建pCC002A质粒pCC001A含有t-PA基因在trp启动子和酰基转移酶基之间的一部分(Cys92到Trp113)。为了除去这个区域，pCC001A(1.0μg)用ClaI和MluI消化，并分离得到的6.1kb DNA片段，另外，pCCN176-3(1μg)用MluI和Sau3AI消化来分离编码酰基转移酶Asp7到Arg71的189bp DNA。合成的DNA寡聚体002a和002b(分别与0.5nmol，见下面表1)在37℃ 10μl缓冲液(Kination缓冲液50mM Tris·HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，1.0mM ATP)中用T4聚核苷酸激酶磷酸化1小时，反应混合物在55℃加热20分钟以使酶失活。得到的混合物在15℃ 20μl连接缓冲液中，在T4连接酶存在下与189bp Sau3AI/MluI DNA连接3小时。6.1kb ClaI/MliIDNA片段加入得到的连接混合物中，在加入T4DNA连接酶(300单位)后于4℃保温16小时。得到的连接混合物用于转化E.coliJM109。所需CC酰基转移酶N176的表达载体质粒pCC002A从某转化体分离到并通过限制酶切作图鉴定。
表1为CC酰基转移酶N176的N-末端盒式突变而合成的DNA寡聚体。
(2)CC酰基转移酶N176的卡那霉素抗性表达载体pCK002的构建质粒pCC002A用DraI(TOYOBO)消化。生成混合物用酚处理以除去酶，并用乙醇沉淀。回收的DNA悬浮在20μl连接缓冲液中，并与磷酸化的EcoRI接头(2μg，Pharmacia)混合，然后在4℃与T4DNA连接酶(300单位)保温16小时。反应混合物用酚抽提并乙醇沉淀。回收的DNA用EcoRI消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离生成的5.6kb缺乏氨苄青霉素抗生基因的DNA。另外，质粒pA097[从转化体E.coli JM109(pA097)FERM BP-3772获得]用EcoRI消化，并分离得到的1.2kb卡那霉素抗性DNA。该1.2kb EcoRI DNA在16℃50μl连接缓冲液中用T4DNA连接酶(300单位)与5.6kb EcoRIDNA连接2小时。连接混合物用于转化E.coli JM109得到带有以卡那霉素抗性基因为抗生素标记的目的质粒pCK002。实施例3CC酰基转移酶N176的高表达载体(pCK013的构建)(1)pCC013A的构建(i)pCC007A的构建质粒pCC001A用EcoRI和MluI消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离生成的6.4kb DNA片段。回收的DNA在16℃用T4DNA连接酶(300单位)与合成的DNA寡聚体007a和007b(各0.5μg表1)连接5小时，007a和007b在连接反应前均被磷酸化。生成混合物用来转化E.coli JM109以获得目的的质粒pCC007A。(ii)pCCNt013的构建质粒pCC007A(1.0μg)用ClaI和BamHI消化，生成的6.1kb DNA用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。该DNA在T4DNA连接酶(300单位)作用下与合成的寡聚体013a和013b(各0.5μg，均已磷酸化，表1)连接。连接混合物用来转化E.coli JM109，目的质粒pCCNt013从氨苄抗性转化体中分离。(iii)pCC013A的构建质粒pCCNt013用BamHI和MluI消化，并分离生成的6.1kb DNA。此外，pCC002A(1.0μg)用MluI和Sau3AI消化得到189bp DNA片段。生成的DNA在T4DNA连接酶(300单位)作用下与6.1kb BamHI/MluI DNA片段连接，连接混合物用于转化E.coliJM109。从抗氨苄青霉素的转化体之一，分离具有AT-丰富的NH2末端DNA序列(编码与天然CC酰基转移酶N176相同的氨基酸序列)的目的质粒pCC013A。(2)天然CC酰基转移酶N176的卡那霉素抗性表达载体pCK013的构建。(i)pΔN176的构建质粒pCK002(1.0μg)用AakII(TOYOBO)消化，生成的DNA用T4DNA连接酶(150单位)处理以自连接。连接混合物用来转化E.coli JM109，以得到含单一AtaII限制性内切酶位点的质粒pΔN176。(ii) pCK013的构建质粒pΔN176(1.0μg)用AatII消化，此线性化DNA在42℃ 100mM Tris.HCl(pH 8.0)缓冲液中用细菌碱性磷酸酶(1单位，Takara Shuzo)处理1小时。分离脱磷酸化的DNA并在T4DNA连接酶作用下与pCC013A的2.5kb AatII DNA连接。连接混合物用来转化E.coli JM109，得到含卡那霉素抗性基因作标志的目的质粒pCK013。实施例4(用Kunkel′s法对编码CC酰基转移酶N176的DNA进行点突变)(1)编码CC酰基转移酶N176的DNA亚克隆到M13噬菌体(i)制备mp18p181质粒pCC013A(一种含氨苄青霉素抗性标志的天然CC酰基转移酶N176的表达载体，该质粒的构建在欧洲专利申请公布No.558,241，p.8中公开)用HpaI和SmaI消化。分离编码CC酰基转移酶N176 Met1至Pro267的842bp DNA。该DNA在T4DNA连接酶存在下与被SmaI消化的7250bp M13mp18连接，连接混合物用来转化E.coli JM109。从一个噬菌斑分离到目的的RF DNA mp18p181，在该质粒中，部分酰基转移酶以与M13的正向ori相反之方向插入，用限制性酶切图谱鉴定RF DNA mp18p181。制备RF DNA mp18p181的噬菌体溶液在使用前贮存于4℃。
从来自pCC013A的编码CC酰基转移酶N176 Met1至Ala414的1162bp HpaI/Eco47III DNA制备RF DNA mp18p183，并用与上述相似的方法将7250bp M13mp18用HincII消化。(ii)制备单链U-mp18p181-SS(cf.Kunkel，T.A.et al.MethodsEnzyml.154，367)E.coli CJ236(dut-，ung-，F′)(Bio-Rad Lab.)的单克隆在37℃含有氯霉素(30μg/ml)的2ml 2XTY培养基中培养16小时。将细胞(0.1ml)转到含30μg/ml氯霉素的新鲜2XTY培养基(50ml)中，并继续在37℃培养。当在600nm吸光度达0.3时，将mp18p181的噬菌体溶液(MOI＜0.2)加入培养基。再继续培养5小时。4℃ 17000xg离心15分钟后，将上清液再离心。得到的上清液(30ml)于室温用RNase(150μg/ml，Sigma)处理30min，然后加入7.5ml PEG溶液(3.5M NH4OAC溶于20％聚乙二醇8000)。离心(17,000xg，15分钟，4℃)后，残留物重悬于200μl含300mMNaCl，100mM Tris·HCl(pH 8.0)和0.1mM EDTA的缓冲液中。得到的溶液顺次用200μl酚和200μl酚/氯仿(1∶1)抽提，并用氯仿(200μl)洗两次。将7.5M NH4OAC(100μl)和乙醇(600μl)加入溶液中以沉淀噬菌体DNA。离心收集DNA，用700μl冰冷的90％乙醇洗涤并真空干燥，将纯化的单链U-DNA(U-mp18p181SS)悬于20μl TE缓冲液中使用前贮于4℃。
用与上述相似的方法制备其它的用于Kunkel′S突变法的单链U-DNAs。(2)制备用于突变体CC酰基转移酶M164A的mp18p181M164A寡聚脱氧核糖核苷酸SO-M164A(0.2nmol)在37℃ 15ml缓冲液(含1.3mMATP，10mM二硫苏糖醇(DTT)，50mM Tris·HCl，6.6mM于5％聚乙二醇(PEG)6000)中与T4DNA连接酶(10单位)保温60分钟。在20μl含10mM Tris·HCl(pH 8.0)，6mM及40mM NaCl的缓冲液中将磷酸化引物(1.5μl，20pmol)与mp18p181 SS-U-DNA(1μl，0.1pmol)混合。混合物于75℃加热5分钟，然后冷却至室温超过40分钟，然后将混合物置于0℃。向混合物中加入T4DNA聚合酶(15单位)，T4DNA连接酶(600单位)，100mM二硫苏糖醇(DTT，6μl)，10mM ATP(2μl)及5mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP，2μl)。得到的混合物相继在室温孵育5分钟及37℃保温1.5小时。部分反应混合物(1.0μl)加入根据Sigesada′s方法[Sigesada，K.(1983)SAIBO-KOUGAKU(Japanese)2，616-626]制备的E.coliJM109的感受态细胞，该细胞在湿冰上孵育30分钟。将在L培养基(A600＝0.8，200μl)中培养的E.coli JM109加入转化细胞中，并将此细胞混合物加入55℃预热的3ml H顶层琼脂(1％菌胰蛋白胨，0.8％NaCl，0.8％琼脂)中。将混合物铺在H平板(1％菌胰蛋白胨，0.8％ NaCl，1.5％琼脂)上，平板于37℃保温16小时。从平板上噬菌斑中分离目的RF DNA(mp18p181M164A)，并通过BamHI消化鉴定。(3)制备用于突变体CC酰基转移酶M164A的pCKM164Amp18p181M164A用MluI及BstBI消化，用琼脂糖氮胶电泳分离582bp DNA片段。pCK013(一种带有卡那霉素抗性标记的天然CC酰基转移酶N176表达载体)也用MluI及BstBI消化，并分离较大的DNA片段。生成的DNA(0.03pmol)在10μl连接缓冲液(66mM Tris·HCl(pH 7.6)，6.6mM，10mM β-巯基乙醇，0.5mM ATP)于环境温度在T4DNA连接酶(300单位)作用下与582bp MluI/BstBI DNA(0.15pmol)连接5小时。连接混合物用于转化E.coli JM109。从一个卡那霉素抗性转化体中分离目的质粒pCKM164A，并用限制性酶切作图鉴定。转化体称作E.coli JM190/pCKM164A，其甘油贮存液用常规方式制备。(4)制备用于突变体CC酰基转移酶M174A的mp18p181M174A用与上述相似的方法从mp18p181的SS-U-DNA和DNA寡聚体SO--M174A制备mp18p181M174A。(5)用于突变体CC酰基转移酶M174A的表达载体pCKM174A的制备用与上述相似的方法制备突变体CC酰基转移酶M174A表达载体及其转化体，分别称作pCKM174A和E.coli JM109/pCKM174A。用常规方法制备转化体的甘油贮存液。(6)用于突变体CC酰基转移酶S166A的表达载体pCKS166A的制备用类似于上述方法，从mp18p183和DNA寡聚体SO-S166A(5′-CATCCGCCAAAGCTTGAACCACACCGCACCCATAAG)制备突变体CC酰基转移酶S166A的mp18p183S166A。mp18p1835166A用MluI和BetBI消化。分离较小的DNA片段与被MluI及BstBI消化的pCK013的较大DNA片段连接，得到pCKS166A。用它转化E.coli JM109得到转化体E.coliJM109/pCKS166A，其甘油贮存液用常规方法制备。实施例5(用PCR法对编码CC酰基转移酶N176的DNA的点突变)(1)突变体CC酰基转移酶M164L的表达载体pCKM164L的制备pCK013(模板DNA，0.5fmol)，DNA寡聚体SO-MluFor[引物#1，125pmel，图1(b)]及SO-M164L[引物#2，125pmol，图1(b)]在100μl含10mM Tris·HCl(pH9.0)，50mM KCl，0.1％Triton X-100，2.5mM和0.2mM dNTP的缓冲液中与Taq DNA聚合酶(Kurabo，1单位)混合。混合物用矿物油封并如下进行PCR(聚合酶链式反应)。初始变性(96℃ 0.5分钟)后，反应完成30个循环的扩增(97℃ 1.5分钟，50℃ 2.5分钟及72℃ 2.5分钟)。然后终延伸(72℃ 7分钟)。生成混合物用酚抽提，乙醇沉淀并用BamHI及MluI消化。285bp BamHI/MluI DNA与被BamHI及MluI消化的pCKM164A的较大DNA片段连接。连接反应混合物用于转化E.coliJM190。从一个卡那霉素抗性转化体中分离目的质粒pCKM164L，并通过限制酶切作图鉴定。E.coli JM109用pCKM164L转化得到转化体E.coli JM109/pCKM164L，其甘油贮存液用常规方法制备。(2)突变体CC酰基转移酶M164G表达载体pCKM164G的制备以与上述类似的方法，用pCK013(模板DNA)，DNA寡聚体SO-MluFor[引物#1，图1(b)]及SO-M164G[图1(b)]进行突变体CC酰基转移酶M164G的DNA片段的突变和扩增。生成的285bpBamHI/MluI DNA与被MluI及BamHI消化的pCKM164A的较大DNA片段连接，得到pCKM164G。用pCKM164G转化E.coli JM109得到转化体E.coli JM109/pCKM164G，其甘油贮存液用常规方法制备。(3)其它M164突变体CC酰基转移酶的表达载体M164X突变酰基转移酶(X＝C、D、E、F、H、I、K、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y)的表达载体及其转化体用与上述相似的方法制备。实施例6(其它突变体CC酰基转移酶表达载体的制备)(1)mp19pfu62的构建M13mp19(1.0μg)用SmaI(5单位)和HindIII(5单位)消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离得到的7.2kb DNA。此外，pCK002(此质粒的构建公开在欧洲专利申请公布No.558,241，p.7)用SmaI和HindIII消化，分离到1.6kb DNA。得到和DNA在20μl连接缓冲液中于15℃并有T4DNA连接酶(300单位)存在下与7.2kb SmaI/HindIII DNA连接2小时。连接混合物用来转化E.ocli JM109得到目的RF DNAmp19pfu62。mp19pfu62单链U-DNA(SS-U-DNA)以与实施例2(1)(ii)所述相似的方法制备。(2)突变体CC酰基转移酶M465A的mp19pfu62M465A的制备以与上述相似的方法从mp19pfu62的SS-U-DNA和DNA寡聚体SO-M465A[图1(a)]制备mp19pfu62M465A。(3)突变体CC酰基转移酶M506A的mp19pfuM506A的制备以与上述相似的方法从mp19pfu62的SS-U-DNA和DNA寡聚体SO-M506A[图1(a)]制备mp19pfu62M506A。(4)突变体CC酰基转移酶M750A的mp19pfu62M750A的制备以与上述相似的方法从mp19pfu62的SS-U-DNA和DNA寡聚体SO-M750A[图1(a)]制备mp19pfu62M750A。(5)突变体CC酰基转移酶M465A的表达载体pCKM465A的制备mp19pfu62M465A用PstI和NcoI消化，用琼脂糖凝胶电泳分离较小的DNA片段(1271bp)。PCK013也用PstI和NcoI消化。分离较大的DNA，在含有50mM Tris·HCl，10mM，1.0mM DTT及5％PEG 6000的缓冲液中，用T4DNA连接酶将其与1271bp PstI/NcoI DNA连接。连接反应混合物用于转化E.coli DH10B。从卡那霉素抗性转化体中，分离目的质粒pCKM465A，并通过限制性酶切作图鉴定。E.coliJM109用pCKM465A转化得到转化体E.coli JM109/pCKM465A，其甘油贮存液用常规方法制备。(6)突变体CC酰基转移酶M506A的表达载体pCKM506A的制备以与上述相似的方法从pCK013和mp19pfu62 M506A构建pCKM506A。E.coli JM109用pCKM506A转化，从而得到转化体E.coli JM109/pCKM506A，其甘油贮存液用常规方法制备。(7)突变体CC酰基转移酶M750A的表达载体pCKM750A的制备以与上述相似的方法从pCK013和mp19pfu62 M750A构建pCKM750A。E.coli JM109用pCKM750A转化，从而得到转化体E.coli JM109/pCKM750A，其甘油贮存液用常规方法制备。实施例7(E358突变体CC酰基转移酶的表达载体的制备)(1)突变体CC酰基转移酶M269I/E358的表达载体的制备(i)突变体CC酰基转移酶M269I/E358K表达载体p269I358K的制备pCK013用HpaI和MluI(0.5fmol)消化后的较大的DNA片段，DNA寡聚体SO-E358K[5′-TAACCGGGCCATGGCGCGTCTTGACTATATCGAACT，125pmol，列于图1(b)(ii)]和SO-BstFor[5′-ATCGCGTCTTCGAAATACCGGGCATC，125pmol，列于图1(b)(ii)]在100μl含有10mMTris·HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.1％明胶，1.5mM和0.2mMdNTP的缓冲液中与Taq DNA聚合酶(TaKaRa，1单位)混合。混合物用矿物油封并初变性(96℃ 0.5分钟)，进行25个循环扩增(97℃1.5分钟，50℃ 2.5分钟，72℃ 2.5分钟)并终延伸(72℃ 7分钟)。反应混合物经酚抽提，乙醇沉淀，然后用NcoI和BstBI消化。得到的DNA(290bp)连接到被NcoI及BstBI消化的pCK013的较大DNA片段上。用连接混合物转化E.coli DH10B(购自Gibco-BRL)。从卡那霉素抗性转化体中分离目的的质粒p269I358K，并用限制性酶切作图鉴定。E.coli JM109用p269I358K转化得到转化体E.coliJM109/p269I358K，其甘油贮存液用常规方法制备。(ii)突变体CC酰基转移酶M269I/E358S和M269I/E358L的表达载体P269I358S和p269I358L的制备以与上述相似的方法从pCK013及DNA寡聚体SO-BstFor和SO-E358S[或SO-E358L，见图1(b)(ii)]制备M269I/E358S(或M269I/E358L)的表达载体。用p269I358S(或p269I358L)转化E.coliJM109得到转化体E.coli JM109/p269I358S(或E.coli JM109/p269I358L)，其甘油贮存液用常规方法制备。(2)其它突变体CC酰基转移酶E358表达载体的制备(i)突变体CC酰基转移酶E358R表达载体pCCE358R的制备用与实施例2中所述相似的方法从mp18p183和DNA寡聚体SO-E358R[图1(b)(ii)]制备突变体CC酰基转移酶E358R的mp18p183E358R。mp18p183E358R用MluI和NcoI消化后的较小DNA与经MluI和NcoI消化后的pCC013A的较大DNA连接，得到pCCE358R。E.coli JM109用pCCE358R转化，得到转化体E.coli JM109/pCCE358R，其甘油贮存液用常规方法制备。(ii)突变体CC酰基转移酶E358T的表达载体pCCE358T的制备以与实施例2中所述相似的方法从mp18p183和DNA寡聚体SO-E358T[图1(b)(ii)]制备突变体CC酰基转移酶E358T的mp18p183E358T。mp18p183E358T经MluI和NcoI消化后的较小的DNA与pCC013A经MluI和NcoI消化后的较大的DNA连接得到pCCE358T。E.coli JM109用pCCE358T转化得到转化体E.coli JM109/pCCE358T，其甘油贮存液用常规方法制备。实施例8(多突变体CC酰基转移酶的制备)(1)M164L或M164A与另一种突变体CC酰基转移酶的组合(i)突变体CC酰基转移酶M164L/M269Y的表达载体p164L269Y的制备pCKM164L用MluI和BstBI消化，分离较小的DNA(582bp)。另外，pCKM269Y(此质粒的构建方法公开在欧洲专利申请公布No.558,241，p.10上)用MluI和BstBI消化。分离生成的DNA(ca 6.2kb)并连接到582bp MluI/BstBI DNA上。连接混合物用于转化E.coli DH10B。从卡那霉素抗性转化体中分离目的p164L269Y，并经限制性酶切作图鉴定。E.coli JM109用p164L269Y转化得到转化体E.coli JM109/p164L269Y，其甘油贮存液用常规方法制备。(ii)突变体CC酰基转移酶M164L/M269F的表达载体p164L269F的制备pCKM164L用MluI和BstBI消化并分离较小的DNA(582bp)。此外，pCKM269F(此质粒的构建方法公开在欧洲专利申请公布No.558,241，p.15-16上)被MluI和BstBI消化。分离较大的DNA片段(ca 6.2kb)与582bp MluI/BstBI DNA连接。连接混合物用于转化E.coli DH10B。从卡那霉素抗性转化体中分离目的p164L269F，并用限制性酶切作图鉴定。E.coli JM109用p164L269F转化得到转化体E.coli JM109/p164L269F，其甘油贮存液用常规方法制备。(iii)突变体CC酰基转移酶M164L/M269Y/C305S的表达载体p164L269Y305S的制备用与上述相似的方法从pCKM164L和p269Y305S(此质粒的构建方法分开在欧洲专利申请公布No.558,241，p 10上)制备p164L269Y305S。E.coli JM109用p164L269Y305S转化得到转化体E.coli JM109/p164L269Y305S，其甘油贮存液用常规方法制备(iv)突变体CC酰基转移酶M164L/M174A的表达载体p164L174A的制备将来自pCKM164L(模板DNA，0.5fmol)的HpaI/NcoI DNA(1122bp)，DNA寡聚体SO-MluFor[引物#1，125pmol，图1(b)(i)]和SO-M174A2(5′-GACCGGCAGCGCTAGCGCCCGCCAGAGCTTGA，引物#2，125pmol)在100μl含有10mM Tris·HCl(pH 8.3)，50mM KCl，0.1％明胶，1.5mM和0.2mM dNTP的缓冲液中与Taq DNA聚合酶(TaKaRa，1单位)。混合。混合物用矿物油封并进行初变性(96℃ 0.5分钟)，25个循环的扩增(97℃ 1.5分钟，50℃ 2.5分钟及72℃ 2.5分钟)和终延伸(72℃ 7分钟)。生成混合物用酚抽提、乙醇沉淀，并用MluI和NheI消化。生成的DNA与pCKM174A经MluI和NheI消化后较大的DNA片段连接，得到目的质粒p164L174A。E.coli JM109用p164L174A转化得到转化体E.coli JM109/p164L174A，其甘油贮存液用常规方法制备。(v)突变体CC酰基转移酶M164A/M174A的表达载体p164A174A的制备用与上述相似的方法从pCKM164A(模板DNA)，SO-MluFor[引物#1，图1(b)(i)]、SO-M174A[引物#2，图1(a)]和pCKM174A(载体DNA)制备164A174A。E.coli JM109用p164A174A转化得到转化体E.coli JM109/p164A174A，其甘油贮存液用常规方法制备。(vi)突变体CC酰基转移酶M164A/M269Y的表达载体p164A269Y的制备M164A用MluI和BstBI消化并分离较小的DNA(582bp)。此外，pCKM269Y用MluI及BstBI消化。生成的较大的DNA片段连接到582bpMluI/BstBI DNA，而且连接混合物用来转化E.coli DH10B。从卡那霉素抗性转化体分离目的质粒p164A269Y，并经限制性酶切作图鉴定。E.coli JM109用p164A269Y转化得到转化体E.coli JM109/p164A269Y，其甘油贮存液用常规方法制备。(vii)突变体CC酰基转移酶M164L/M174A/M269Y，M164L/M174A/M269F，和M164A/M174A/M269Y/C305S的表达载体的制备p164L174A用MluI和BstBI消化后的较小的DNA与pCKM269Y(或pCKM269F或p269Y305S)经MluI及BstBI消化后的较大DNA片段连接，得到目的载体p164L174A269Y(或p164L174A269F或p164A174A269Y305S)。E.coli JM109用p164L174A269Y(或p164L174A269F或p164A174A269Y305S)转化得到转化体E.coli JM109/p164L174A269Y(或E.coli JM109/p164L174A269F或E.coli JM109/p164A174A269Y305S)，其甘油贮存液用常规方法制备。(viii)突变体CC酰基转移酶M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A的表达载体p164L174A269Y305S750A的制备pCKM750A用PstI及NcoI消化。分离较小的DNA与p174L174A269Y305S经PstI及NcoI消化后的较大的DNA连接，得到目的质粒。E.coliJM109用p164L174A269Y305S750A转化，得到转化体E.coli JM109/p164L174A269Y305S750A，其甘油贮存液用常规方法制备。(2)A49L与其它突变体酰基转移酶的组合(i)突变体CC酰基转移酶A49L的mp18p181A49L的制备以与实施例2所述相似的方法从mp18p181的SS-U-DNA和DNA寡聚体SO-A49L制备的mp18p181A49L。(ii)突变体CC酰基转移酶A49L的表达载体pCKA49L的制备
mp18p181A49L用ClaI及MluI消化并分离218bp DNA。另外，pCC013A用ClaI及MluI消化。分离生成的较大的DNA并连接到218bpClaI/MluI DNA上。连接混合物用于转化E.coli JM109。从氨苄青霉素抗性转化体中，分离突变体CC酰基转移酶A49L的表达载体pCCA49L，并有限制性酶切图谱鉴定。pCCA49L的250bp HpaI/MluIDNA片段与pCK013经HpaI及MluI消化后的较大DNA片段连接，得到pCKA49L。(iii)天然CC酰基转移酶和突变体CC酰基转移酶A49L的表达比较用常规方法，通过质粒pCKA49L(或pCK013)转化E.coli JM109制得的E.coli JM109/pCKA49L(或JM109/pCK013)的甘油贮存液(1ml)转入100ml含50μg/ml卡那霉素的L液体培养基中，该混合物在30℃培养8小时。经培养的液体培养基(3.75ml)加入25ml含25μg/ml卡那霉素的N-3培养基(成分5％大豆汁，1％甘油，1.25％ K2HPO4，0.38％KH2PO4，50μg/ml盐酸硫胺，2mMMgSO4·7H2O，0.2mM CaCl2·2H2O，0.05mM FeSO4·7H2O)，该混合物在22.5℃培养16小时。在第16小时，向培养基中加入终浓度为20μg/ml的3-吲哚丙烯酸(IAA)再继续培养56小时。离心收集细胞(于4℃，14000rpm，15分钟)，悬浮于40ml TE缓冲液(pH 8.0)并超声裂解。裂解物于4℃ 14000rpm离心20分钟，得到上清液(称作“汤”部分)。残留物重悬于40ml含100mM Tris·HCl(pH 8.0)，1mM EDTA及8M尿素的缓冲液中，并超声裂解。离心除去不溶物质，收集上清(称作“ppt”部分)。用15％ SDS-PAGE分析突变体CC酰基转移酶A49L和天然CC酰基转移酶N176的“汤”及“ppt”部分。通过天然CC酰基转移酶突变为突变体CC酰基转移酶A49L，细胞不溶性前体蛋白大大减少。通过反相HPLC测定了“汤”中相应于成熟酰基转移酶(天然CC酰基转移酶或突变体CC酰基转移酶A49L)总量的结果(下表)。
A49L(单位/ml培养基)天然(单位/ml培养基)72.635.6(iv)突变体CC酰基转移酶A49L/M164L/M174A/M269Y的表达载体p49L164L174A269Y的制备p164L174A269Y的772bp MluI/NcoI DNA与pCKA49L经MluI和NcoI消化后的较大DNA连接，得到目的质粒p49L164L174A269Y。E.coli JM109用p49L164L174A269Y转化得到转化体E.coli JM109/p49L164L174A269Y，其甘油贮存液用常规方法制备。实施例9(突变体CC酰基转移酶的表达和纯化)(1)突变体CC酰基转移酶M164A的表达将E.coli JM109/pCKM164A(0.5ml)的甘油贮存液加入50ml含50μg/ml卡那霉素的L培养基，混合物在30℃培养8小时。然后将经培养的液体培养基(3.75ml)转入25ml含1％甘油和12.5μg/ml卡那霉素的N-3培养基(5.0％大豆浸液(Osaka Shokuhinn Kagaku)，0.608％ Na2HPO4，0.7％ KH2PO4，0.7％K2HPO4，0.12％(NH4)2SO4，0.02％ NH4Cl，0.0011％ FeSO4·7H2O，0.0011％CaCl2·2H2O，0.000276％MnSO4·nH2O，0.000276％AlCl3·6H2O，0.00011％ CoCl2·6H2O，0.0000552％ ZnSO4·7H2O，0.0000552％NaMoO4·2H2O，0.0000276％ CuSO4·7H2O，0.0000138％H3BO4，50μg/mlvitamin B1，0.048％ MgSO4)中。混合物于20-22℃温育88小时，并在开始培养后16小时加入β-吲哚丙烯酸(终浓度20μg/ml)，16及24小时加入甘油(终浓度1.0％)。离心(4℃，8000rpm 10分钟)收集细胞，悬浮于10ml TE缓冲液(10mM Tris·HCl(pH 8.0)，1.0mM EDTA)并超声裂解。离心(4℃，15000rpm，20分钟)后，上清液(粗裂解物)在贮存于4℃备用。(2)M164A的纯化用0.45μm column guarb(Millipore)过滤粗裂解物(1.0ml)并上样到TSK-gelTM DEAE-5PW(TOSOH，4.6×50mm)高压液相色谱柱。洗脱为30分钟内从80％ A缓冲液[25mM Tris·HCl(pH 8.0)]+20％B缓冲液
到50％A缓冲液+50％B缓冲液的凹型梯度洗脱，流速1.0ml/min。用230nm处吸光率监测洗脱过程。收集用约0.16M NaCl洗脱的最后一个主峰，得到突变体CC酰基转移酶M164A的纯品。(3)其它突变体CC酰基转移酶的表达以与上述相似的方法，培养带有另一表达载体(如pCKM164L，pCKM164G，pCKM174A，pCKM465A，pCKM506A，pCKM750A，p164L/269Y，p164L/269Y/305S，p164L/174A/269Y/305S，p269I/358K，p269I/358S，p164L/269F，p164L/174A/269F，pCKS166A，p164L/174A/269Y/305S/750A，p164A/269Y，pCK49L和和p49L/164L/174A)的E.coli JM109，并制备其粗裂解物。(4)其它突变体CC酰基转移酶的纯化
以与上述相似的方法，其它突变体CC酰基转移酶(如M164L、M164G、M174A、M465A、M506A、M750A、M164L/M269Y、M164L/M269Y/C305S、M164L/M174A/M269Y/S305S、M269I/E358K、M269I/E358S、M164L/M269F、M164L/M174A/M269F、S166A、M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A、M164A/269Y、和A49L/M164L/M174A)从各自的粗裂解物纯化。(5)突变体CC酰基转移酶的鉴定通过12.5％ SDS-PAGE分析和反相HPLC鉴定纯化的突变体CC酰基转移酶如M164A，M164L，M164G，M174A，M465A，M506A，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S，M164L/M174A/M269Y/S305S，M269I/E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/M174A/M269F，S166A，M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A，M164A/269Y，和A49L/M164L/M174A。在β-巯基乙醇存在下进行SDS-PAGE分析，证实每种纯化的酰基转移酶由2个独立亚基组成，α和β亚基分别对应25.4KDa和58.4KDa的肽，通过它们在凝胶电泳上的迁移率来计算其分子量。在HPLC分析中，每种纯化的酰基转移酶解离为2个独立的肽——α和β亚基，分别在大约8.7和5.8分钟被洗脱下来[HPLC条件下，柱5C4-AR-300，4.6×50mm；洗脱10分钟内从35％到70％含0.05％三氟乙酸的乙腈水溶液的线性梯度；检测214nm]。每种突变体酰基转移酶的两个亚基通过反相HPLC系统分离，并用473A蛋白测序仪(应用生物系统)通过氨基末端序列分析确定其与天然酰基转移酶序列相同。实施例10(DNA序列分析)用373A DNA测序仪(应用生物系统)测定突变体酰基转移酶，如M164A，M164L，M164G，M174A，M465A，M506A，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S，M164L/M174A/M269Y/S305S，M269I/E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/M174A/M269F，S166A，M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A，M164A/269Y，and A49L/M164L/M174A的载体的DNA序列，并证实其与预期的相同。实施例11(CC酰基转移酶活性)用与上述相同的方法测定各突变体酰基转移酶在pH 8.7的CC酰基转移酶活性，列于表2。结果见表2。
表2CC酰基转移酶的相对活性(*将天然型视为100％)
实施例12(GL-7ACA酰基转移酶活性)用与上述相同的方法测定各突变体酰基转移酶在pH 7.5的GL-7ACA酰基转移酶活性，列于表3。结果见表3。
表3GL-7ACA酰基转移酶的相对活性(*将天然型视为100％)
权利要求
1.一种突变体CC酰基转移酶，其中在天然CC酰基转移酶氨基酸序列的Ala49、Met164、Ser166、Met174、Glu358、Met465、Met506或Met750位置上至少一个氨基酸被一种不同的氨基酸取代。
2.权利要求1的突变体头孢菌素C酰基转移酶，在其被加工成α-亚基和β-亚基之前，其前体形式用下列式子表示A1-48-X1-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505-X7-A507-749-X8-A751-773其中A1-48与天然CC酰基转移酶的Thr1到Glu48的氨基酸序列相同，A50-163与天然CC酰基转移酶的Asp50到Leu163的氨基酸序列相同，A167-173与天然CC酰基转移酶的Val167到Arg173的氨基酸序列相同，A175-357与天然CC酰基转移酶的Leu175到Val357的氨基酸序列相同，A359-464与天然CC酰基转移酶的Thr359到Ala464的氨基酸序列相同，A464-505与天然CC酰基转移酶的Pro466到Ile505的氨基酸序列相同，A507-749与天然CC酰基转移酶的Lys507到Ala749的氨基酸序列相同，A751-773与天然CC酰基转移酶的Val751到Ala773的氨基酸序列相同，X1是丙氨酸或一种不同的氨基酸，X2、X4、X6、X7和X8各为蛋氨酸或一种不同的氨基酸，X3为丝氨酸或一种不同的氨基酸，以及X5为谷氨酸或一种不同的氨基酸，条件是上式中Met269和/或Cys305可被不同的氨基酸取代，且当X1是丙氨酸，X2、X4、X6、X7和X8均为蛋氨酸时，X3为丝氨酸及X5是谷氨酸以外的一种氨基酸。
3.权利要求2的突变体头孢菌素C酰基转移酶，其中X1为亮氨酸，X3为丙氨酸，Mey269被酪氨酸取代。
4.编码权利要求1的头孢菌素C酰基转移酶的DNA。
5.含有权利要求4的DNA的表达载体。
6.由权利要求5的表达载体转化的宿主细胞。
7.生产权利要求1的突变体头孢菌素C酰基转移酶的方法，包括在一种水性营养介质中培养权利要求6的宿主细胞，并从经培养的液体培养基中回收突变体头孢菌素C酰基转移酶。
8.制备式(I)的化合物或其盐的方法 其中R1是乙酰氧基，羟基或氢，该方法包括将式(II)的化合物或其盐 其中R1与上面定义的相同，R2是羧酸酰基，与权利要求6的转化体的经培养的液体培养基或其加工材料接触。
全文摘要
一种突变体CC酰基转移酶，其中天然CC酰基转移酶氨基酸序列的Ala
文档编号C12N15/55GK1150823SQ94194758
公开日1997年5月28日 申请日期1994年10月26日 优先权日1993年11月1日
发明者丹羽峰雄, 斋藤善正, 藤村高穗, 石井芳则, 野口/嗣 申请人:藤泽药品工业株式会社