编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物的基因的制作方法

专利名称：编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物的基因的制作方法
背景技术：
本发明涉及为链霉菌属微生物的支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)复合物编码的新DNA序列。本发明也涉及通过基因工程技术生产阿凡曼链菌(streptomyces avermitilis)支链α-酮酸脱氢酶(bkd)-缺损突变体的方法。所述bkd-缺损突变体缺乏支链α-酮酸脱氢酶活性，在发酵生产新(非天然)阿凡曼菌素(avermectins)上是有用的。
阿凡曼链霉菌天然产生被命名为阿凡曼菌素和8种不同的但密切相关的抗寄生虫聚酮化合物。由阿凡曼链霉菌产生的阿凡曼菌素复合物具有4种主要组分(A1a、A2a、B1a和B2a)和4种次要组分(A1b、A2b、B1b和B2b)。各组分的结构描述如下 阿凡曼菌素R1R2X-YA1a 仲丁基 Me CH＝CHA1b 异丙基 Me CH＝CHA2a 仲丁基 Me CH2-CH(OH)A2b 异丙基 Me CH2-CH(OH)B1a 仲丁基 H CH＝CHB1b 异丙基 H CH＝CHB2a 仲丁基 H CH2-CH(OH)B2b 异丙基 H CH2-CH(OH)阿凡曼菌素聚酮化合物的结构由7个乙酸分子、5个丙酸分子和一个α-支链脂肪酸(S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸)分子衍生而成。符号“A”和“B”指其中5-取代基分别是甲氧基或羟基的阿凡曼菌素。数字“1”指其中双键在22-23位上的阿凡曼菌素。数字“2”指在22位具有氢且23位具有羟基的阿凡曼菌素。最后，C-25具有两种可能的取代基存在于阿凡曼菌素“a”系列中的仲丁基取代基(得自S(+)-2-甲基丁酸的引入)和存在于阿凡曼菌素“b”系列的异丙基取代基(得自异丁酸的引入)(作为回顾，可参见Fisher，M.H.and Mroziik，H.1984，“MacrolideAntibiotics”，Academic Press，chapter 14)。
“天然”阿凡曼菌素指由阿凡曼链霉菌产生的其中25位取代基如上所述是异丙基或仲丁基的那些阿凡曼菌素。其中25位取代基不是异丙基或仲丁基的阿凡曼菌素这里称作新或非天然阿凡曼菌素。
以其CoA形式存在的天然α-支链脂肪酸的一条代谢途径是从α-支链氨基酸异亮氨酸和缬氨酸开始经支链氨基酸转氨酶反应，接着经支链α-酮酸脱氢酶反应(支链脂肪酸酰基-CoA衍生物也可以从由全程合成产生的支链α-酮酸产生)。这些代谢途径描述如下
过去已分离到在最后提到的酶中不具有可检测的支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)活性的阿凡曼链霉菌突变体(Hafner etal.，1988，欧洲专利EP 284，176，1993年10月20日公布)。在从14C-1标记的2-氧代异己酸底物(亮氨酸类似物)不产生14CO2的筛选研究中，在阿凡曼链霉菌菌株ATCC 31272的标准化学诱变后分离到该突变体。除了当S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸或携带异丙基或仲丁基(S-型)基团的前体加入到该突变体的发酵培养基中之外，该突变体不能合成天然阿凡曼菌素。当在含水有氧条件下在含有外加可替换的羧酸(例如环己烷羧酸(CHC)或以上指出的其前体的营养培养基中发酵养时，所述突变体也能产生新(非天然)阿凡曼菌素。
克隆编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物的基因是非常合乎需要的。用重组DNA技术操作这些基因应当有利于天然和新阿凡曼菌素的产生。就某些菌株而言，通过增加bkd基因的拷贝数可以预料天然阿凡曼菌素增加的滴度。此外，通过基因取代使BCKDH活性永久缺失或修饰产生的不可逆阻断的bkd菌株会是以上提到的经化学诱变获得的bkd突变体的改进的替换物。
α-酮酸脱氢酶多酶复合物-支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)复合物、丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物和α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)复合物分别催化支链α-酮酸、丙酮酸和α-酮戊二酸的氧化脱羧反应，释放出CO2并产生相应的乙酰-CoA和NADH(Perham，R.N.，1991，Biochemistry，308501-8512)。每一种复合物由三种不同的催化酶组成脱羧酶(E1)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶(转酰基酶)(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。
支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)是由三种功能性组分E1(脱羧酶)，E2(转酰基酶)和E3(硫辛脱氢酶)组成的多酶复合物。得自恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的纯净的复合物由4种多肽组成。纯净的哺乳动物复合物也由4种多肽(E1α、E1β、E2和E3)组成。已从具有丙酮酸和支链α-酮酸脱氢酶两种活性的枯草芽孢杆菌分离出α-酮酸脱氢酶复合物。这一双功能复合物氧化膜磷脂的丙酮酸和支链α-酮酸二者。
已报道了克隆假单胞菌和芽孢杆菌原核生物支链α-酮酸脱氢酶基因。在这些系统中发现编码BCKDH的基因群集在操纵子上。已克隆恶臭假单胞菌BCKDH复合物基因，并已测定了这一区的核苷酸序列(Sykes et al.，1987，J.Bacteriol.，1691619-1625，和Burns etal.，1988，Eur.J.Biochem，176165-169和176311-317)。E1α的分子量是45289、E1β的是37138、E2的是45134、E3的是48164。所述4种基因群集在E1α、E1β、E2和E3序列上。Northern印迹分析表明，这4种基因的表达从单mRNA发生，并且这些基因构成一个操纵子。有一种紧靠在E1α编码区(它允许假单胞菌bkd基因的组成型表达)起始位点之前的典型的原核生物共有序列启动子。E1β编码区的起始密码子位于E1α开放读框(ORF)末端下游仅40个核苷酸处。相反，在E1β和E2 ORF之间没有基因间区，因为E1β ORF终止密码子是紧靠在E2 ORF起始密码子之前的三联体。E2和E3 ORF之间的基因间区降低到仅有2个核苷酸。因此，假单胞菌bkd基因是紧密连接的。
类似地，已克隆了编码枯草芽孢杆菌BCKDH/PDH双重复合物的操纵子(Hemila et al.，1990，J.Bacteriol.，1725052-5063)。这一操纵子含有编码大小为42、36、48和50千道尔顿(kDa)的蛋白质的4个ORF，表明它高度同源于假单胞菌bkd簇的E1α、E1β、E2和E3亚单位。编码嗜热脂肪芽孢杆菌双重BCKDH/PDH多酶复合物E1组分的α和β亚单位的基因也已被克隆和测序(估计α和β亚单位的分子量分别为约41,000和35,000(Hawkins etal.，1990，Eur.J.Biochem.，191337-346)。
此外，已公开了大量真核生物(人、牛和大鼠)E1α和βBCKDH亚单位的序列。最近，已通过计算机分析完成了得自多种物种的PDH和BCKDH复合物E1α和E1β组分两者的所有出版已知序列的氨基酸序列比较(Wexler et al.，1991，FEBS Letters，282209-213)。令人感兴趣地是，认定了α和β亚单位的几个区不仅在迄今描述过的所有PDH中而且在原核生物和真核生物二者的BCKDH复合物中都是高度保守的。
最近，分别编码阿凡曼链霉菌BCKDH复合物E1组分的α(bkd A)和β(bkd B)亚单位及E2(bkd C)组分的基因也被采用异源基因表达系统克隆、测序和分析(Denoya，C.D.，1993，“Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydro-genase complex from Streptomyces avermitilis”，美国专利申请08/100，518，1993年7月30日申请)。DNA序列分析表明，存在按以下方式排列成簇的推定的转录启动子序列和bkd结构基因启动子序列，E1-α(bkd A)，E1-β(bkd B)和E2(bkdC)开放读框。此外，完整的阿凡曼链霉菌bkd ABC基因簇被克隆到用于在大肠杆菌宿主中表达的强大肠杆菌T7启动子的下游。类似地，E1-α和E1-β开放读框(ORF)也被分别或同时克隆到T7启动子下游，且对每一构建体进行了表达试验。这些研究表明，当在大肠杆菌中表达时，至少2个阿凡曼链霉菌bkd基因簇的开放读框(E1-α-〔bkd A〕和E1-β〔bkd B〕)是完全可翻译的。此外，旨在特定性分析BCKDH复合物E1组分的酶试验最后证实，两个重组大肠杆菌克隆(一个携带全部bkd基因簇，另一个同时携带E1-α和E1-βORF)具有E1 BCKDH-特异性酶活性。
本发明涉及编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)的第二簇新基因的分子克隆和分析，所述簇至少包含3种基因(bkd F、bkd G和bkd H)，这些基因分别为阿凡曼链霉菌BCKDH复合物的E1-α、E1-β和E2亚单位编码。这里公开的bkd基因族位于最近报道(Denoya，C.D.，1993，美国专利申请08/100,518，1993年7月30日申请)的第一bkd簇(bkd A、bkd B和bkd C基因)下游约12千碱基(kb)处。两簇都有类似的基因组构，且它们在阿凡曼链霉菌染色体中以相同的方向取向。两簇中相应的结构基因尽管高度同源，但是不同的。
此外，本发明也涉及用基因工程技术构建bkd突变体的方法。所述bkd突变体具有影响bkdF基因的染色体缺失，缺乏支链α-酮酸脱氢酶活性，它在以异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸单独作碳源时不能生长，在缺少S-2-甲基丁酸和异丁酸二者的培养基中也不能产生天然阿凡曼菌素。本文公开的突变体在经发酵产生新(非天然)阿凡曼菌素上是有用的，所述的发酵是在含有合适的可变羧酸(例如环己烷羧酸(CHC))的培养基中进行。此外，本发明也涉及构建具有影响bkd F基因和bkd ABC基因簇二者的染色体缺失的突变体的方法。
链霉菌具有一个主要的遗传连锁群(一种染色体)，它通常以每个菌丝分隔含多个拷贝的形式存在，但在孢子中仅以单拷贝存在。在原核生物中，链霉菌基因组特别大(5×103到7×103千碱基〔kb〕)(Gladek，A.，and Zakrzew sha，J.，1984，FEMS Microbiol.lett.，2473-76)，约是大肠杆菌基因组大小的2倍。
链霉菌遗传学特别有趣的一点是频繁的染色体重排，该重排涉及常常伴随强烈DNA扩增的广泛的缺失(Birch A.et al.，1990，J.Bacteriol.，1724138-4142)。链霉菌中扩增和缺失现象比大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的类似现象强2到3个数量级。已报道了18％染色体的缺失和45％基因组的扩增。尽管它们有遗传长期不稳定性，但某些基因的复制以104细胞中1次的出现次数出现。这种复制常常是由非常规交换现象(涉及分开的子染色体中DNA的短的、部分同源部分)产生的。由于在相同的染色体上产生新的DNA骨架，因此自然易于在这种复制现象之后出现进一步的基因扩增或消除现象。不仅相同基因而且具有高度相似结构的两种不同基因的多拷贝易于重组并产生缺失。这样，要求一种基因的遗传稳定性不能与任何其它基因的太相似。
链霉菌中基因或基因组的多拷贝的出现是不常见的。已报道了Saccharopoly spora erythraea中合成大环内酯抗生素红霉素的聚酮化合物部分所需的基因组件结构(Donadio et al.，1991，Science，252675-679)。
我们已发现阿凡曼链霉菌具有至少两簇bkd基因一族包括bkdA、bkd B和bkd C基因，另一簇包括bkd F、bkd G和bkd H基因。我们推测bkd ABC基因簇(以前在美国专利申请08/100,518(1993年7月30日)中公开，以上已提及)和这里公开的bkd FGH基因簇两者在阿凡曼链霉菌中由基因复制产生，并且2个拷贝经突变获得了足以维持其存在(避免重组/缺失现象)的不同。
除了公开编码BCKDH的新的第二簇基因外，我们也公开了用基因工程技术构建阿凡曼链霉菌bkd F突变体的方法。所述bkd F突变体缺乏支链α-酮酸脱氢酶活性，在用异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸单独作为碳源时不能生长，在缺少S-2-甲基丁酸和异丁酸二者的培养基中也不能产生天然阿凡曼菌素。该bkd F突变体在经发酵产生新阿凡曼菌素中是有用的，所述的发酵是在含有合适的可变羧酸(例如环己烷羧酸(CHC))的培养基中进行的。我们还公开了构建携带影响bkd F基因和bkd ABC基因簇二者的染色体缺失的突变体的方法。
用化学和物理方法诱变产生链霉菌突变体对分析基因功能和基因调节以及开发改进的工业菌株来说是一项重要的技术。链霉菌基因克隆最近的进展已使采用重组DNA技术操作大量克隆基因(如抗性基因、生物合成基因和调节基因)以及阐明基因组构和基因调节成为可能。另一种诱变方法-基因取代已成功地用于酿酒酵母、大肠杆菌种枯草芽孢杆菌(Scherer，S.and R.W.Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，764951-4955；Shortle，D.，et.，al 1982，Science，217371-373；Stahl，M.L.，and Ferrari，E.，1984，J.Bacteriol.，158411-418)、Saccharopolyspora erythraea(Weber，J.M.，andLosick，R.，1988，Gene，68173-180)和几个种的链霉菌。这一技术使得携带在质粒上的体外产生的突变引入到宿主菌株的染色体中。这一方法是基于发现宿主染色体和含有同源区的质粒之间可发生重组。
阿凡曼链霉菌中的基因取代是用载体中携带的克隆序列和其染色体配对物之间的同源重组的方法进行的。可假定，引起整合和其后切除整合质粒的分离步骤的同时发生的双交换或单交换导致克隆序列和居留序列之间的相互交换。我们已观察到阿凡曼链霉菌中的双交换和单交换两种现象。双交换和单交换两种机制之后切除产生相同的产物。采用这一方法，我们可以破坏阿凡曼链霉菌bkd F基因的E1-α开放读框。该破坏作用涉及约1.4kb的染色体缺失，该缺失影响编码BCKDH复合物E1-α亚单位的基因的5′-半边。所形成的突变株表现出bkd突变体所有的特征性表型特征，它是稳定的并且能用于经发酵产生有价值的新阿凡曼菌素。
本文引用的所有文献以其整体在此一并作为参考文献。
术语解释本说明书全文使用的技术术语对分子遗传学领域的技术人员是公知的。本发明中经常使用的术语定义如下扩增指产生以染色体内或染色体外DNA被发现的染色体序列的额外拷贝。
抗生素抗性基因当引入到天然对特定抗生素敏感的宿主细胞中时，使宿主细胞对该特定抗生素有抗性的DNA序列。也称作抗生素标记。
克隆与单个始祖细胞相同的大量细胞或分子。
克隆载体可插入待克隆的外源DNA的任何质粒，经转化后它将外源DNA携带到宿主细菌细胞中。
CoA辅酶A。
粘端序列(CoS)允许体外包装的得自细菌噬菌体λ的DNA序列。
粘粒已插入细菌噬菌体λCOS位点的质粒，其结果是该质粒DNA(携带外源DNA插入片段)可被在噬菌体包被中体外包装。
CRNA与DNA互补的单链RNA，从前者经体外转录合成。
交换指出现克隆序列和其染色体配对物之间物质的相互交换点。
道尔顿与相当于1个氢原子分子大小相联系的通常使用的质量单位。
DNA连接形成连接两个DNA片段的化学键。
双交换现象同时或相继发生双交换。其结果是克隆序列与居留序列之间发生相互交换。
基因簇在染色体上物理性相近的一组基因。
基因取代将质粒上携带的体外衍生的突变引入到染色体中的技术。当宿主染色体和含有与其同源的区的质粒重组时发生该取代。
基因组完整的染色体组。所有单个基因的总和。
杂交、菌落杂交用来鉴别细菌菌落的技术，所说的菌落携带有其中插入的DNA类似于某些特定序列的嵌合载体。
菌丝霉菌生长或营养形式的主要因素。菌丝是管状结构，直径约2到10微米，它形成称为菌丝体的大量缠绕在一起的链。
kbDNA或RNA的1,000个碱基对的缩写。
接头含有一种或多种限制酶靶位点的短的合成以链寡核苷酸。将其加入到载体上可产生新的多接头或多克隆位点(MCS)。
NADH还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
核苷酸核酸的组成部分或单体单位。
寡核苷酸短链核苷酸。
操纵子细菌基因表达和调节的一个完整的单位，包括结构基因、调节基因和被调节基因产物识别的DNA中的调控元件。
质粒自主、自身复制的染色体外环状DNA。
质粒拷贝数保持在细菌中的每一宿主染色体的质粒分子数。
引物与一个DNA链配对并提供自由的3′-羟基末端的短的DNA或RNA序列，在所述末端，DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核酸链。
原核细胞包括大多数微生物的小的相对简单的细胞。
启动子引起转录开始的DNA区。
限制酶识别并切割特定的短DNA序列的酶。
限制识别序列被特定的限制酶特异性识别的DNA序列。也称作靶位点。
穿梭载体能够在一种或多种可变宿主(例如大肠杆菌和链霉菌)中复制的双功能载体。
单交换现象在单点发生的单相互基因重组，它导致新进入的环状质粒或噬菌体载体在同源染色体序列中的整合和复制。
Southern印迹法将变性DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上的方法，在所述滤膜上变性DNA可以与互补的核酸探针杂交。
亚克隆将克隆的DNA片段从一种类型的载体转移到另一种类型的载体中(例如从重组粘粒转移到质粒中)。然后新的重组质粒转化进合适的宿主细胞中，产生亚克隆菌株。
细菌细胞的转化经掺入添加的DNA获得新的遗传标记。
发明概述本发明涉及一种为链霉菌属微生物支链α-酮酸脱氢酶复合物编码的分离的DNA区段。
本发明也涉及一种以上描述的分离的DNA区段，该区段还包含调节所述支链α-酮酸脱氢酶复合物表达的DNA区。
本发明也涉及一种为阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物编码的分离的DNA区段。
本发明也涉及一种包含如以下描述的SEQENCE ID NO.1、SEQUENCE ID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQENCE IDNO.4的DNA序列或者其等位变异体的DNA区段。本发明也涉及一种为外源DNA区段亚组且其功能等同于外源DNA区段的DNA区段。
本发明也涉及(a)包含SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCEID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQUENCE ID NO.4的DNA序列或其等位变异体的重组DNA；(b)一种包含这种重组DNA的质粒；和(c)一种其中已掺入这种重组DNA的宿主细胞。
本发明也涉及包含在一种DNA区段中的为支链α-酮酸脱氢酶复合物编码的基因，其中所说的DNA区段选自由如以下定义的pCD713、pCD740、pCD747和pCD854组成的组。
本发明也涉及一种包含SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCEID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQUENCE ID NO.4的DNA序列或其等位变异体的DNA区段。
本发明也涉及一种包含一种DNA序列的DNA区段，所述的DNA序列是SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCE ID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQUENCE ID NO.4 DNA序列或其等位变异体的亚组，当该区段用作探针时，它可以分别杂交到SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCE ID NO.2、SEQUENCE IDNO.3或SEQUENCE ID NO.4或其等位变异体上，当该区段用作聚合酶链反应引物时，它可以扩增全部或部分这种序列。
本发明也涉及一种基本上纯化的多肽，该多肽包含SEQUENCEID NO.5、SEQUENCE ID NO.6、SEQUENCE ID NO.7或SEQUENCE ID NO.8的氨基酸序列。
本发明也涉及一种生产天然阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适于产生这种天然阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkdF、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段拷贝数在其中已增加的阿凡曼链霉菌进行发酵。
本发明涉及一种生产天然阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适于产生这种天然阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用经操作或取代决定着调节包含bkd F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段的表达的基因使这种表达在其中已增强的阿凡曼链霉菌进行发酵。
本发明也涉及一种生产新阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkd F、bkdG和bkd H基因中一种或多种的基因组片段的表达在其中已降低或消除的阿凡曼链霉菌进行发酵，其中所述的降低或消除是经对决定着这种表达的基因的缺失、灭活、取代或其它操作进行的。
本发明的一个优选的实施方案涉及前述的生产新阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkd F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段在其中已缺失或灭活的阿凡曼链霉菌进行发酵。
本发明也涉及一种生产新阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkdA、bkd B和bkd C基因中一种或多种和bkd F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段的表达在其中已降低或消除的阿凡曼链霉菌进行发酵，其中所述的降低或消除是经对决定着这种表达的基因的缺失、灭活、取代或其它操作进行的。
本发明一个优选的实施方案涉及前述的生产新阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkd A、bkd B和bkd C基因中一种或多种和bkd F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段在其中已缺失或灭活的阿凡曼链霉菌进行发酵。
附图简要说明

图1用来克隆阿凡曼链霉菌bkd F基因(E1α BCKDH)片段的聚合酶链反应(PCR)引物的核苷酸序列。用9个氨基酸长的保守区设计每一引物。相应于每一保守氨基酸的密码子表示在相应的DNA序列的上面。右引物用包含人E1-αBCKDH亚单位(用作E1-αBCKDE亚单位的代表性模型)的192-200位氨基酸的区设计。左引物用包含E1-αBCKDH亚单位的286-293位氨基酸的区设计。在右引物的5′末端，有两个额外的含腺嘌呤的核苷酸和两个限制酶识别序列(EcoRI和Sacl)(被添加以促进克隆PCR产物)。类似地，在左引物的5′末端，有两个额外的含腺嘌呤的核苷酸和两个限制酶识别序列(BamHI和XbaI)。
图2阿凡曼链霉菌bkd FGH基因簇的基因组限制性酶切图、位置和亚克隆。也表示了以前公开的bkd ABC基因簇(参见Denoga，C.D.，美国专利申请08/100,518，以上已提及)的位置。图F的黑框表示用PCR克隆的起始E1-α-特异性阿凡曼链霉菌基因组片段的位置和取向。表示了基因组亚克隆(pGEM-3Z衍生物)。也表示了分别编码E1-α、E1-β和E2 BCKDH亚单位的bkd F、bkd G和bkd H结构基因的位置和取向。鉴别的开放读框(以方框表示)的极性是从左到右。缩写字母B代表BamHI；Bg代表BgIII；P代表PstI；S代表SphI；“X”指如下所述的用于DNA区测序的转座子小-γ-δ-1插入物的位置，所述DNA区位于bkd F开放读框下游。
图3用图1所示的引物经PCR克隆的501-bp阿凡曼链霉菌基因组DNA片段(CD613)的核苷酸序列和推断的翻译产物。这一基因组片段含有部分bkd F基因(E1-αBCKDH)。在每行序列的顶部对核苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码子序列下面。
图4用SP6载体引物从pCD746亚克隆的PstI端测序的201-bp阿凡曼链霉菌基因组DNA区的核苷酸序列和推断的翻译产物。推断的翻译产物代表部分相应于bkd G基因的BCKDH复合物的E1-β组分。在每行序列的顶部对核苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码子序列下面。
图5从小-γ-δ-1插入物“A3”两端测序的194-bp阿凡曼链霉菌基因组DNA区的核苷酸序列(序列CD785)和推断的翻译产物。所述“A3”距BamHI端约1.7kb，含有4.1kb BamHI基因组片段中的bkd F基因。推断的翻译产物代表相应于bkd G基因的NCKDH复合物E1-β组分的C-末端。在每行序列的顶部对核苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码子序列下面。
图6从小-γ-δ-1插入物“A5”两端测序的455-bp阿凡曼链霉菌基因组DNA区的核苷酸序列(序列CD 786)和推断的翻译产物。所述的“A5”距BamHI端约3kb，含有4.1kb BamHI基因组片段中的bkd F基因。推断的翻译产物代表相应于bkd H基因的NCKDH复合物E2组分的C-末端。在每行序列的顶部对核苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码子序列下面。
图7基因取代载体pCD768的构建和阿凡曼链霉菌bkd F突变株CD 794的基因组限制图。质粒pCD768是穿梭载体pCD262的一种衍生物，pCD262携带有侧翼于emE标记(黑箭头)的2.3和4.1kb BamHI阿凡曼链霉菌基因组片段。如以下所描述的，质粒pCD761是一种中间构建体。也显示出了含bkd F基因的阿凡曼链霉菌染色体区的基因组限制图(野生型和取代型菌株)。这些图是从用5.0kb PstI基因组片段为探针的Southern杂交分析推断的。BamHI缩写成B，PstI缩写成P。每一DNA片段上面的数字表示以千碱基(kb)为单位的片段长度。
图8基因取代载体pCD768的限制图。有阴影的框表示tsr-硫链丝菌肽抗性标记；amp-氨苄青霉素抗性标记；“2.3”-2.3kb BamHI阿凡曼链霉菌基因组片段；erm-红霉素抗性标记；“4.1”-4.1kb BamHI阿凡曼链霉菌基因组片段。也表示了链霉菌和大肠杆菌源复制区。白框表示大肠杆菌载体区。箭头表示转录和翻译的方向。
图9bkd ABCF突变体的构建。表示出了基因组限制图、载体构建体简图和靶基因组区。bkd基因簇的位置及开放读框取向的表示法和缩写与图3说明中所述的相同。以灰色阴影区表示缺失的区段。连续的线和虚线分别表示染色体和载体DNA。粗黑线代表用于基因取代中的克隆基因组片段。垂直箭头表明抗生素抗性标记插入物的位置。
发明详述用两种分子遗传学技术(DNA聚合酶链反应(PCR)和同源性探测)组合克隆了本发明的新DNA序列。
识别和克隆本发明的新DNA序列的方法以及用基因取代构建bkd突变体的方法在以下描述。
首先，用保守区设计称作“右”和“左”(图1)的2种PCR引物，所述保守区是从由不同物种的E1-αBCKDH肽序列推断的和由文献上获得的多种排列识别的。使用右和左两种引物经PCR扩增阿凡曼链霉菌基因组DNA获得约0.55kb长PCR产物。将这种PCR扩增的DNA片段进一步克隆到大肠杆菌载体pGEM-3Z中以产生重组质粒pCD613。接着，将质粒pCD613转化进大肠杆菌DH5-α感受态细胞。选择出一种转化体，指定为菌株CD613。克隆DNA片段CD613的DNA测序显示出存在具有高度同源于E1-αBCKDH亚单位的推断肽的开放读框(图3)。然后将克隆的CD613基因组DNA片段用作探针，经菌落杂交筛选阿凡曼链霉菌染色体文库。识别了几个粘粒克隆。限制性分析和Southern印迹分析表明，所有选择出的粘粒克隆都携带有重叠基因组片段。从亚克隆的基因组DNA片段(在实施例6中详细描述)获得的染色体区DNA测序表明，序列CD613是完整bkd基因簇的一部分。克隆的阿凡曼链霉菌bkd基因包括长度约4kb的染色体区(图2)。DNA序列分析表明存在bkd结构基因，该基因排列成按以下方式组构的簇E1-α(bkd F)、E1-β(bkd G)和E2(bkd H)开放读框(图2-6)。
其次，构建携带有bkd F基因灭活变体的质粒。如图2所示，(从左到右)画出了阿凡曼链霉菌染色体中3种邻近的BamHI限制片段2.3kb、1.4kb和4.1kb。1.4kb BamHI基因组片段携带起始E1-α开放读框(ORF-1)(基因bkd F)。4.1kb BamHI携带剩下的bkd基因簇(bkd F末端、bkd G和bkd H)。质粒pCD768是携带两种阿凡曼链霉菌基因组片段(2.3和4.1kb BamHI)(它们与染色体1.4kb BamHI片段两边邻近)的穿梭载体pCD262的衍生物。此外，pCD768携带有位于2.3和4.1kb BamHI片段的ermE标记。ermE标记(赋予红霉素抗性)与ORF-1(bkd F)有相反的取向，避免由下游基因超量表达引起的可能的麻烦。如以下的描述，经重组，该构建体产生宿主基因组中1.4kb缺失(将影响到ORF1)。
将质粒pCD768转化进阿凡曼链霉菌31272 SC2宿主原生质体。选择出表现出对红霉素的抗性(erm-R)和硫链丝菌肽的抗性(tsr-R)两种抗性的两个转化体。使1号转化体(CD783)在液体培养基中生长，制备原生质体，并在含红霉素的琼脂培养基上制成平板。选择50个克隆并进一步分析46个是erm-R、tsr-R，4个是erm-R、tsr-S。后面的4个克隆表现出如下的bkd-缺陷表型它们不能在ILV基本培养基板上生长；它们没有可检测的E1(支链脱羧酶)活性；除非外加S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸，它们不能经发酵合成天然阿凡曼菌素(参见实施例9)。此外，当CHC加到发酵培养基中时，可合成新阿凡曼菌素(CHC-阿凡曼菌素。说明bkd阻断不影响阿凡曼菌素生物合成的细胞机制。这一组4个中的1个克隆(克隆pp15)事先命名为阿凡曼链霉菌菌株CD794，并作为本发明的一个例证保藏在美国典型培养物保藏中心。最后，Southern杂交分析证实，如所预期的，靠阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2中的基因取代，相应于bkd F基因的OR1-1被破坏。
以下是有关阿凡曼链霉菌bkd基因克隆的实验步骤和所得结果的详细描述(a)可用作结合PCR引物候选位点的E1-α BCKDH肽亚单位中保守区的识别对比来自人(Fisher et al.，1989 J.Biol.Chem.，2643448-3453)、大鼠(Zhany et al.，1987，J.Biol，Chem.，26215220-15224)，恶臭假单胞菌(Sokatch et al.，1988，Eur.J.Biochem.，176311-317)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Perham et al.，1990，Eur.J.Biochem.，191337-346)的4种E1-αBCKDH肽序列，以识别可用作设计相应PCR引物的序列的保守区。用GCG序列分析软件包(GCG，Madison，WI)的LineUP和Pretly程序进行计算机分析以识别在原核生物和真核生物两者的BCKDH复合物中高度保守的E1-α亚单位区。四种E1-αBCKDH肽的多种对比显示出几个广泛同源性区(参见Wexler，I.D.，et al.，1991，FEBS letters，282209-213)。位于人E1-α氨基酸182-229之间的硫胺素焦磷酸结合基序)Perham etal.，1989，FEBS Lett ers，25577-82)和包含磷酸化位点1和2跨越氨基酸291-307的区在所有4种被分析的E1-αBCKDH肽中明显保守。也存在前述的位于氨基酸245-289之间的高同源性区。这一区对α-酮酸脱氢酶(它有α和β亚单位二者)显得是独特的，它不同源于大肠杆菌PDHE1或大肠杆菌和酵母α-戊二酸脱氢酶复合物的E1组分(它们是仅由单独的E1多肽组成的二聚体)中的任何序列。由于以上提到的原因，已说明后面的同源性区在亚单位相互作用中起作用(Patel et al.，1991，FEBS Letters，282209-213)。选来进行PCR引物设计的保守区编码人E1-αBCKDH蛋白质的氨基酸残基192到200和286到293。
(b)从用作PCR引物的那些E1-αBCKDH保守区衍生的新寡核苷酸的设计如以上的描述，从多种比较研究选择出E1-αBCKDH亚单位的两个保守区。用包含人E1-αBCKDH亚单位(用作E1-αBCKDH亚单位的代表性模型)氨基酸192-200的区设计右PCR引物(图1)。这些氨基酸位于硫胺素焦磷酸结合基序的范围内。用包含人E1-α BCKDH亚单位氨基酸286-293的区设计左PCR引物(图1)。后面的氨基酸序列包含亚单位相互作用位点末端部分和磷酸化位点保守区的起始部分。使用链霉菌基因密码子排布法(F.Wright and M.J.Bibb，1992，Gene，11355-65)。在右引物5′-末端有促进克隆PCR产物的2个额外的含腺嘌呤的核苷酸和两个限制酶识别序列(EcoRI和SacI)。类似地，在左引物的5′-末端有两个额外的含腺嘌呤的核苷酸和两个限制酶识别序列(BamHI和XbaI)。
右PCR引物完整的序列是5′-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3′左PCR引物完整的序列是5′-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3′用国际生物化学联合会(IUB)核苷酸命名规则描述DNA序列。按如下的IUB组码识别丰余序列K＝G+T、S＝G+C、W＝A+T。与E1-αbkd基因不同源的和为克隆目的掺入到引物中的限制识别序列是下面画线的(参见图1)。
(c)阿凡曼链霉菌基因组DNA片段的PCR扩增用适于高GC含量DNA和使得链霉菌DNA有效和特异扩增的反应条件酶促扩增阿凡曼链霉菌基因组DNA(参见实施例2)。用以上描述的引物(右引物5′-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3′和左引物5′-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3′)。组合完成PCR。扩增产物用琼脂凝胶电泳按大小分成不同的组分。在以上所述的PCR条件下，当采用这种引物组合时检测到单个DNA带(长度约550碱基对)。
(d)扩增的基因组DNA片段克隆到大肠杆菌克隆载体中，再转化进大肠杆菌宿主中如以前提到的，为方便克隆，将EcoRI限制位点掺入到右PCR引物中，使XbaI限制位点存在于左引物5′末端。用电洗脱从琼脂糖凝胶回收0.55kb PCR片段，并用EcoRI和XbaI限制酶两者消化。在将特定片段连接进线性化的大肠杆菌载体(pGEM-3Z)后回收到许多重组克隆，产生重组质粒pCD613，将其转化进大肠杆菌感受态细胞中。选择出一种转化体用于进一步研究其特征，将其指定为菌株CD613。证实性限制分析表明，从大肠杆菌菌株CD613分离的质粒PCD613确定含有0.55kb阿凡曼链霉菌插入物。
(e)克隆片段的DNA测序的bkd-特异性序列的识别用一对载体引物经双链测序方法对存在于质粒pCD613中的0.55kb插入物测序(参见实施例6A)。此外，将0.35kb SalI片段(位于0.55kb PCR插入物内)亚克隆进细菌噬菌体MB中，并用单链测序方案测序(参见实施例6B)。用单链DNA模板和Taq Track试剂盒(Promega)按双脱氧核苷酸链终止法完成DNA测序。DNA测序数据的密码子优先分析(GCG序列分析软件包，Madison，WI)表明具有预期的用于链霉菌基因的密码子的开放读框。
接着，用IntelliGenetics Suite软件(IntelliGeneticsInc.，Mountain View，California)Seq和Translate程序将推定的开放读框翻译成氨基酸序列。最后用IntelliGenetics软年FASTDB程序进行具有询问肽序列(query peptide)的数据库类似性检索。检索DNA数据库(GenBankR，National Institute of Health，和EuropeanMolecular Biolologg Laboratory(EMBL)，Heidelberg，Germang)或蛋白质数据库(PIR和Swiss-Prot)的所有数据库检索明确显示，源于克隆CD613的序列高度同源于但是新的且不同于源于原核生物和真核生物源二者的数据库中所列的所有其它E1-αBCKDH肽。此外，也比较了被基因bkdA编码的新阿凡曼链霉菌E1-αBCKDH肽序列(参见Denoya，C.D.，1993，“Cloned genes encodingbrancled-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex fromStreptomyces avermitilis”，美国专利申请08/100,518，1993年7月30日申请)。这一分析的结论是；在大肠杆菌菌株CD613中克隆的550bp阿凡曼链霉菌基因组PCR产物确实代表了一种新的E1-αbkd基因片段。
(f)全可凡曼链霉菌bkd基因簇的的克隆、限制性分析和Southern印迹分析及染色体图的构建如以上所述，原0.55kb PCR片段含有一个内0.35kb SalI片段。将这一小片段用作放射性活性标记探针经菌落杂交来筛选阿凡曼链霉菌基因组DNA粘粒文库。识别并回收10个克隆。限制性分析和Southern印迹杂交分析表明，所述10个克隆均含有来源于相同染色体区的重叠序列。高度严格地使用相同探针进行阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2的消化的染色体DNA的Southern印迹分析。后一分析证实从基因组文库回收的克隆的同一性。令人惊奇的是，所述粘粒克隆中的两个也杂交到bkdA特异性探针(参见Denoya，C.D.，1993，“Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis”，美国专利申请08/100,518，1993年7月30日申请)上，表明这里所述的bkd基因(命名为bkdF)可能位于靠近包含bkdA、bkdB和bkdC的基因簇的位置上。构建了含有阿凡曼链霉菌CD613序列的基因组区的限制图(图2)。如从以上讨论的杂交数据所预测的，bkdF基因离bkdABC基因簇仅12kb。
(g)得自粘粒克隆的基因组DNA片段的亚克隆和携带bkd基因簇的阿凡曼链霉菌染色体区的DNA测序将BamHI和PstI基因组片段(覆盖了阿凡曼链霉菌染色体全部CD613 bkd区)从DNA文库粘粒克隆亚克隆进大肠杆菌载体pGEM-3Z中。包括每一质粒简要描述的这一工件中构建的亚克隆的表如下1.含有2.3kb BamHI片段的质粒pCD740；2.含有1.4kb BamHI片段的质粒pCD854；3.含有4.1kb BamHI片段的质粒pCD713；和4.含有约5kb PstI插入物的质粒pCD747。(分别相应于上述4种质粒的大肠杆菌菌株CD740、CD854、CD713和CD747，保藏在美国典型培养物保藏中心，有关这些保藏物的相关信息可以在PCT表RO/134中查到，该表在本申请66页上)此外，从质粒pCD713中携带的4.1kb BamHI片段衍生含约3.1kb PstI/BamHI片段的亚克隆。这一新构建体被称作质粒pCD746，并且来进行DNA测序(如以下描述)。质粒限制性酶切作图、Southern杂交和PCR分析证实了每一亚克隆的同一性。
(h)从克隆DNA片段获得的DNA测序数据的计算机分析和阿凡曼链霉菌E1-α、E1-β和E2 bkd开放读框的识别从大量不同的亚克隆和构建体获得了如下的DNA测序数据1.CD613代表以上“c”和“d”节及实施例2和3中描述的原PCR克隆。它含有开放读框1(ORF-1)的一部分，ORF-1相应于编码BCKDH复合物E1-α组分的bkdF基因(图3)。
2.CD746代表得自pCD713的3.1kb PstI/BamHI片段(参见以上“g”节)。用SP6载体引物(从Promega Co.购得)经pCD746插入物PstI末端测序获得的DNA测序数据揭示出部分ORF-2，ORF-2相应于编码BCKDH复合物E1-β组分的bkdG基因(图4)。
3.CD785转座子小-γ-δ-1插入物，该插入物用于位于克隆的4.1kb BamHI基因组片段中bkdF开放读框下游的DNA区测序。这一小-γ-δ-1插入物命名为“A3”，位于含bkdF基因的BamHI末端的约1.7kb处。从插入物A3两个末端进行的DNA测序(参见实施例6c)表明存在相应于E1-βORF(ORF-2)(bkdG)的ORF(图5)。
4.CD786转座子小-γ-δ-1插入物，该插入物用于位于克隆的4.1kb BamHI基因组片段中bkdF开放读框下游的DNA区测序。这一小-γ-δ-1插入物命名为“A5”，位于含bkdF基因的BamHI末端的约3kb处。从插入物A5两个末端进行的DNA测序(参见实施例6c)表明存在相应于E2 ORF(ORF-3)(bkdH)的ORF(图6)。
用“DNA Inspector”软件(Textco，N.H.)进行测序的基因组区的移动碱基组成分析(sliding base composition analysis)，所述的基因组区含有阿凡曼链霉菌E1-α、E1-β和E2(部分)bkd开放读框(OFR)。这一分析给出了用30个碱基骨架长度和20的偏移值(offset value)进行的G+C含量平均值分析的轮廓。相应于阿凡曼链霉菌染色体这一区的总G+C含量是69％，也分析了为密码子位置的函数的G+C含量。用带有链霉菌64种基因密码子使用表(F.Wright and M.J.Bibb，1992，Gene，11355-65)的“Codon Preference程序”(Genetics Computer Group，Madi-son，WI)检测开放读框。Codon Preference程序是一种读框-特异性基因探测程序，用于利用其与密码子频率表的类似性或其每一密码子第三位上的组成(通常为GC)的偏移来识别蛋白质编码序列。ORF表示为其各自读框区下面的框。也检测了所有起始(ATG)和终止密码子(垂直线)。在每一读框中发现的稀有密码子标注在每一ORF区下。用25密码子移动窗计算G+C含量，因而在观察到蛋白质编码区的全部影响之前预料到约25个密码子的偏移。获得了以下3种分布图1.三联体中第一位置；2.三联体中第二位置、3.三联体中第三位置。这一分析的结果是确定了相应于三种BCKDH亚单位(E1-α、E1-β和E2)的三种bkdORF的位置。
(i)阿凡曼链霉菌bkd突变体的构建用来引入缺失的技术是一种改进的用于酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的基因取代方法(Scherer，S.andR.W.Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，764951-4955；Shortle，D.，et al.，1982，Sience，217371-373；stabt，M.L.，and Ferrari，E.，1984，J.Bacteriol.，158411-418)。这一技术(特别是用于链霉菌的这一技术)的一般性描述可见于Kieser，T.和Hopwood，D.A.的综述性文章“Genetic Manipulation of streptomycesIntegrating Vectors andGene Replacement”(1991，Methods in Enzgmology，Vol，204，430-458)。而且，这一方法(包括保证单个克隆分离和增加质粒消除频率必须的附加原生质体制备步骤)的详细描述可见于Anzai等的文章“Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segme-nts with in vitro altered DNA sequences”Joural of Antibiotics，1988，vol.XLI，2，pp.226-233。
用基因取代培育工业突变株的一个关键性步骤是构建在所述特定菌株中有效发挥作用的整合载体。此外，当在链霉菌染色体中进行基因取代时，一个主要问题是载体的消除。用于链霉菌的带有可选择性标记的大肠杆菌质粒可看作是理想的，因为它的不能在链霉菌中复制。大肠杆菌质粒已成功地用于生二素链霉菌和变青链霉菌中(Kieser，T.，and Hopwood，D.A.，1991，Genetic Manipulation ofStrep-tomycesIntegrating Vectors and Gene Replacement，inMethods in Enxymology，vol.204，430-458)。然而，在我们经历的实验中，这一策略在阿凡曼链霉菌中表现出低的整合效率，极易引起单交换现象。
我们最近已研究出大量多用途穿梭载体，该载体对于在链霉菌大肠杆菌二者中克隆和在链霉菌中分子遗传学技术方面的各种用途上有用)C.D.Denoya，1993，“Novel Bacterial Plasmid ShuttleVectors for Streptomyces sp.and Escherichia coli”，美国专利申请032，925，1993年3月18日申请)。这些穿梭载体是结构稳定的，并且在大肠杆菌和大量链霉菌的种中有效地复制，使宽的大小范围内的克隆DNA片段从一种宿主向另一种宿主的来回转移。三种穿梭载体(pCD262、pCD385和pCD500)携带链霉菌温度敏感性复制起点，该复制起点控制链霉菌中的中到高拷贝数。这一复制子的温度敏感性使其能用于链霉菌基因取代和突变体设计实验中。
穿梭载体pCD262和pCD500已成功地用于构建本文所述的bkd-缺损菌株中。这一载体以自身复制的高拷贝数质粒稳定地保持在链霉菌中。然而，当已用这些载体中任何载体转化的阿凡曼链霉菌菌株经受苛刻的条件(如高湿)、孢子形成或原生质体制备和再生时，可回收到许多无质粒的菌落。我们已利用这一特点，在阿凡曼链霉菌基因破坏实验中将pCD262或pCD500用作整合载体。
阿凡曼链霉菌中的基因取代机制被假定为导致整合和后续分离步骤(其中整合质粒被切除)的双交换或单产换。我们已观察到阿凡曼链霉菌中的双交换和单交换现象。经双交换和单交换两种机制，接着切除，产生相同的产物。经采用这一方法，我们能破坏相应于本文所述阿凡曼链霉菌bkd基因簇bkdF基因的E1-α开放读框。这一破坏作用涉及影响编码BCKDH复合物E1-α亚单位的基因的5’-半边的约1.4kb染色体缺失。所形成的表现出bkd突变体所有特有表型特征的突变菌株是稳定的，并且能被用于经发酵产生有价值的新阿凡曼菌素产物。
更具体地说，我们通过用得自Saccharo polys pora erythraea的ermE基因(赋予红霉素抗性)取代阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2染色体中E1-αBCKDH基因(bkdF)区段构建了bkdF突变体。如以上提及的，这是经采用新双功能(大肠杆菌/链霉菌)载体(pCD262)获得的，该载体在有关链霉菌的克隆和基因取代两种实验中有效地发挥作用。如图7所示，画出(从左到右)了阿凡曼链霉菌染色体中三个邻近的BamHI限制片段2.3kb、1.4kb和4.1kb。1.4kb BamHI基因组片段携带E1-α开放读框(ORF-1)(基因bkdF)的起始部分。4.1kb BamHI携带bkd基因簇剩下的部分(bkdF末端、bkdG和bkdH)。
质粒pCD768是穿梭载体pCD262的一个衍生物，pCD262携带位于1.4kb BamHI片段侧翼的两个阿凡曼链霉菌基因组片段(2.3和4.1kb BamHI片段)(图8)。此外，pCD768携带位于2.3和4.1kb BamHI片段之间的ermE标记。该ermE标记以与OR1-1(bkd F)相反的取向存在，以避免由下游基因的超量表达引起的可能的麻烦。预料这一构建体经重组可产生宿主基因组中1.4kb缺失(ORF-1受影响)。
将质粒pCD768转化进阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2宿主原生质体。选择出对红霉素(erm-R)和硫链丝菌肽(tsr-R)两种抗生素有抗性的转化体(参见实施例9)。使转化体#1(CD783)在液体培养基中生长，制备原生质体，并平板接种到含红霉素的琼脂培养基上。选择50个克隆并进一步分析46个是erm-R、tsr-R；4个是erm-R、tsr-S(pp15、pp17、pp22和pp40)。进一步分析后一组的4个克隆和前一组的2个克隆(pp14和p21，参见实施例9表1)。所有这些克隆均表现出如下的bkd-缺陷表型所有4个erm-R，tsr-S都不能在1LV基本培养基板上生长；当试验BCKDH复合物E1组分时它们没有活性；除非补加S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸，它们不能经发酵合成天然阿凡曼菌素(参见实施例9)。此外，当CHC加到发酵培养基中时，可合成新阿凡曼菌素(CHC-阿凡曼菌素)，说明bkd阻断不影响阿凡曼菌素生物合成的细胞机制(参见实施例9)。这一组4个中的1个克隆(克隆pp15)事先命名为阿凡曼链霉菌菌株CD794，并作为本发明的例证保藏在美国典型培养物保藏中心。最后，Southern杂交分析清楚地证实，如所预期的，靠阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2中的基因取代，相应于bkdF基因的ORF-1被破坏(参见实施例15)。
实施例以下是用于识别、克隆和分析阿凡曼链霉菌bkdF基因的实验方法的详细实施例(附图也说明了这些方法)。此外，也描述了经基因取代构建两种bkd-缺陷突变体的方法。也描述了分子生物学领域中专业人员公知的标准技术其它细节和所使用的特定的酶的表示方法(例如Sanbrook等的实验室手册“分子克隆”(Cold SpringHarbor Laboratory，1988)中的方法)实施例1阿凡曼链霉菌基因组DNA的制备于29℃下在YPD-2琼脂培养基上以铺满菌苔的方式培养阿凡曼链霉菌(单菌落分离物#2)菌丝体7天。培养基的组成为Difco酵母提取物 10gDifco Bacto-胨10g葡萄糖5gDifco Bacto琼脂 20g乙酸钠2gMOPS 10gPH值调至7.0。
终体积1l。
在121℃下高压灭菌25分钟。
用该菌丝体接种到在300ml折流瓶中的30ml AS-7培养基(参见Hafner等1988，欧洲专利申请号88300353.5，
发明者C·D·迪诺亚, K·J·斯图兹曼恩格沃尔 申请人:辉瑞大药厂