专利名称：动脉硬化的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及动脉硬化的治疗剂，更具体地说涉及利用calponin基因的动脉硬化治疗剂。
动脉硬化在病理上以内膜损伤为代表，其特征在于脂肪和结缔组织的沉积以及平滑肌细胞和巨噬细胞的生长，特别是动脉粥样硬化引起局部缺血性心脏病和大脑出血，因此它是一种非常致命的疾病。一般认为高脂血、高血压、衰老和吸烟是动脉硬化的主要危险因素。
至于动脉硬化的治疗，使用抗高脂血试剂和抗高血压药品作为治疗剂以抑制危险因素的增强。使用抗氧化剂、抗血小板试剂、血管舒张剂、抗凝血剂和类似物作为治疗剂以抑制疾病发作的起因。目前，这些治疗尚未在临床上产生足够的效力。
另外，在对局部缺血性心脏疾病(如由动脉硬化引起的心绞痛和心肌梗死形成)的早期治疗中进行经皮的经腔冠状血管成形术(PTCA)PTCA产生了明显的效果。然而，在PTCA治疗后发现30-40％的病人在3到6个月后再狭窄，这是一个大问题。为了抑制再狭窄，给病人施用一种药物，但这种治疗并不足够有效。各种研究的结果表明，在内膜中平滑肌细胞的增生引起再狭窄(Hanke，H.et al.，Timecourse of smooth muscle cell proliferation in theintima and media of arteries of following experimentalangioplasty，Circulation Res.1990；67651-659)。已尝试了将试剂或基因直接导入内膜平滑肌细胞(特别是在病灶位点)来治疗再狭窄的方法。作为一个例子，尝试了在内膜平滑肌细胞(特别是在病灶位点)使用肝素的方法(Gimple，L.W.et al.，Effectof chronic subcutaneous or intramural administration ofheparin on femoral artery restenosis ofter balloonangioplasty in hypercholesterolemic rabbits Circulation1992；861536-1546)，但对抑制再狭窄没有产生足够的影响。另外，进行了经气囊导入法将荧光素酶编码基因导入平滑肌细胞特别是动脉硬化形成的病灶的位置的试验(Leclerc，G.et al.，Percutaneous arterial gene transfer in a rabbit model.J.Clin.Invest，1992；90936-944)，但该试验作为动脉硬化的治疗方法并不完全令人满意，因为他们使用的该基因不是作为一种治疗剂而是作为一种标记。
因此，本发明的一个目的是提供动脉硬化的治疗剂，它能克服上面提及的背景技术之缺陷。换句话说，本发明的目的是提供用于动脉硬化的高效治疗剂。
本发明的另一目的是提供在PTCA后能有效防止再狭窄的动脉硬化治疗剂。
本发明进一步的目的是提供对制备用于动脉硬化的高效治疗剂中有用的重组载体。
本发明还有一个目的是提供在治疗动脉硬化和它所引起的局部缺血性心脏疾病中有用的药物组合物。
本发明另外的目的是提供一种治疗动脉硬化的方法。
本发明甚至还有一个目的是提供一种治疗局部缺血性心脏病的方法。
作为各种研究的结果，本发明人发现血管壁中平滑肌细胞的增生可经过将calponin基因导入血管壁来抑制并完成了本发明。本发明提供了用于动脉硬化的治疗剂，它包含以calponin基因作为活性成份。而且，本发明提供了含有calponin基因的重组载体，它能在平滑肌细胞中表达calponin基因。本发明还提供了包含calponin基因和一种药用的载体的药物组合物。另外，本发明提供了一种治疗动脉硬化的方法，包括给病人施用治疗上有效量的calponin基因的步骤。此外，本发明提供了一种治疗局部缺血性心脏病的方法，包括给病人施用治疗上有效量的calponin基因之步骤。
尽管不受特定的理论限制，据信经过应用本发明用于动脉硬化的治疗剂，calponin基因在血管壁平滑肌细胞内表达，从而将去分化的平滑肌细胞重新分化以抑制平滑肌细胞的增殖。
图1是参入了人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN的限制性图谱。
图2是证实人calponin基因导入血管壁的电泳图谱，泳道1是不含DNA的阴性对照，泳道2是用质粒pCAGGS处理的对照组2的颈总动脉DNA，泳道3是用含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN处理的calponin组颈总动脉的DNA。
图3是一组照片，显示了在下面3组颈总动脉横切片中观察到的血管增生内膜的生物学形态(a)用含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN处理的calponin组；(b)用质粒pCAGGS处理的对照组2；(c)未处理的对照组1。
图4是显示用气囊摩擦兔颈总动脉后基因的导入在抑制血管壁内膜增生中的有效程度。在图4的横座标上，对照组1代表用气囊摩擦颈总动脉后不作处理的未处理对照组(n＝18)，对照组2代表用气囊摩擦颈总动脉后用质粒pCAGGS处理的对照组(n＝7)，calponin组代表用含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN处理的组(n＝8)。纵坐标数表示内膜与血管中层的面积比。
实施本发明的最佳方式术语“calponin基因”指编码calponin或calponin样蛋白质的基因。发现calponin作为一种肌钙蛋白样蛋白质主要存在于哺乳动物平滑肌细胞中(Takahashi，K.et al.，Biochem，Biophys.Res.Commun.1986；14120-26)。已知calponin存在于肌动蛋白丝上并经过与肌动蛋白丝结合来抑制肌球蛋白ATPase的活性(Winder，S.J.et al.，J.Biol.Chem.1990；26510148-10155)。因此，据信calponin在调节平滑肌的收缩中起着重要作用。Takahashi等已测定了鸡calponin的氨基酸序列(Takahashi，K.and Nadal-Ginard，B.，J.Biol.Chem.1991；26613284-13288)。SM22和mp20被熟知为calponin样蛋白质，Thweatt和Ayme-Southgate分别测定了它们的氨基酸序列(Thweatt，R.et al.，Biochem.Biophys，Res.Commun，1992；1871-7和Ayme-Southgate，A.et al.，J.Cell.Biol.1989；108521-531)。上述calponin和calponin样蛋白质可用于本发明。
最先从鸡砂囊中克隆了calponin的cDNA并测定了其碱基序列(Takahashi，K.and Nadal-Ginard，B.，J.Biol.Chem.1991；26613284-13288)。后来报道了人和大鼠calponin cDNA的克隆(Takahashi，K.et al.，Japanese circulation Journal1992；56 supplement 140和Shanahan，C.M.et al.，Circulation Res.1993；73193-204)。本发明可使用这种calponin。为了减少被导入基因和被表达蛋白质的免疫排异作用和为了增加治疗的有效性，导入的calponin基因优选来自人类。优选使用含有编码SEQ ID NO2的氨基酸序列之碱基序列的calponin基因，更优选使用含有SEQ ID NO1的碱基序列的calponin基因。calponin基因可含有补加编码序列。可修饰calponin基因以便增加、置换或缺失一些编码的氨基酸序列。该修饰的前提是能表达具有与calponin功能相似的蛋白质。calponin基因可以是经过使用常规技术从细胞中分离和纯化的基因组DNA或cDNA。或者它可以是根据Narang等的方法(Narang，S.A.，DNA Synthesis，Tetrahedron 1983；393)化学合成的。
可将calponin基因本身导入处于病灶位点的平滑肌细胞。作为选择，可将含有calponin基因并能在平滑肌细胞中表达calponin基因的重组载体导入病灶位点的平滑肌细胞。这种重组载体包含calponin基因和表达该基因的表达载体。一般来说，可用能在哺乳动物细胞中表达蛋白质的质粒载体或病毒载体DNA或RNA来构建表达载体。可经过最佳选择和组合一个能引起表达载体复制的复制起点，一个表达启动子，一个剪接信号，polyA加入信号，药物选择标记，一个增强子等来构建表达载体。优选的是表达载体含有至少一个启动子。能引起表达载体复制的复制起点的例子包括SV40病毒，乳头状瘤病毒，EB病毒(Epstein-Barr病毒)等。表达启动子的例子包括β-肌动蛋白启动子，延伸因子1α，胸苷激酶启动子，SV40启动子，腺病毒主要晚期启动子，巨细胞病毒启动子等。而且，除了剪接信号，polyA加入信号，为确保有效克隆选择的药物选择标记如氨苄青霉素抗性基因，和细胞特异性功能增强子外，可加入控制导入的基因表达的转录控制基因。可用于构建本发明的重组载体的优选的表达载体的例子包括pEF-BOS(Mizushima，S.et al.，Nucleic Acid Research1990；185322)，pcDL-SR α296(Takebe，Y.et al.，Molecular and Cellular Biology 1988 8466-472)，pCAGGS(Niwa，H.et al.，Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryoticvector，Gene 1991；108；193-200)，pAd265SVp(A)3(Kaufman，R.J.，et al.，Mol.Cell.Biol 1985；51750-1759)等。其中，pCAGGS是最优选的。含巨细胞病毒增强子，鸡β-肌动蛋白启动子，兔β-球蛋白3′剪接信号，兔β-球蛋白3′侧翼区和SV40复制起点的pCAGGS能有效地表达参入哺乳动物细胞的基因。
可使用本领域的技术人员熟知的技术(Maniatis，T.et al.，Molecular cloningA laboratory manual 1989；ColdSpring harbor laboratory)经过将calponin基因参入表达载体中构建本发明的重组载体。
calponin基因，或者含有calponin基因并能在平滑肌细胞中表达calponin基因的重组载体(下文称为“含calponin基因的重组载体”)可用药用的载体配制以制备随后施用的以溶液、悬液、胶体或等形式存在的药物组合物。
作为选择，calponin基因或含calponin基因的重组载体可在膜中包被以制备成颗粒，且该颗粒可用药用的载体配制以制备随后施用的以溶液、悬液、胶体或类似形式存在的药物组合物。在膜中包被calponin基因或含calponin基因的重组载体可防止该基因或重组载体被核酸酶消化并能有助于高效地将该基因或重组载体无损伤地导入靶细胞。至于膜，可使用合成的膜，如脂质体(Wong，T.K.et al.，Science 1980；215166)，脂质乳浊液等，也可使用天然存在的膜，如原生质体(Schaffner，W.，Proc.Natl.Acad.Sci，1980；77；2163)，病毒(如逆转录病毒)衣壳(Cone，R.D.et al.，Proc.Natl，Acad.Sci，1984；816349)，红细胞空壳(Furusawa，M.et al.，Nature 1974；2498449)等。其中，由于下面原因优选脂质体。对calponin基因或含calponin基因的重组载体不作任何特殊的处理就能将该基因或该重组载体包被进脂质体中。另外，如果从存在于人类的脂肪或在人体内代谢的脂肪生产脂质体，导入后脂质体可代谢成无害的形式。用于形成脂质体的物质的例子包括脂肪，如N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氨甲基硫酸盐(DOTAP)，N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)，二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)，N-(α-三甲基氨基乙酰)-双十二烷基-D-氯化谷氨酸(TMAG)等，以及它们的混合物。优选这些脂肪是因为它们能形成具有足够内部容积的大型单层泡囊(LUV)，使calponin基因或含calponin基因的重组载体有效地参入而不会损伤这些DNA。例如，已知N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以1∶1(w/w)比例的混合物(Felgner，D.L.et al.，LipofectionA highly efficient，lipid-mediated DNA-transfection procedure，Proc.Natl.Acad.Sci，1987；847413)，N-(α-三甲基氨基乙酰-双十二烷基-D-氯化谷氨酸(TMAG)与二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以1∶2∶2(mol/mol/mol)比例的混合物(Koshizaka，T.etal.，J.Clin.Biochem.Nutr.19897185)和类似物可形成能吸收DNA的脂质体。在这些脂肪中，最优选N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氨甲基硫酸盐(DOTAP)，因为它的细胞毒性低。而且，HVJ(日本血凝病毒)的糖蛋白可参入或共价结合到脂质体的表面，或加入乙二醇以增加DNA导入细胞的效率。另外，抗存在于靶平滑肌细胞表面的抗原的特异性抗体或受体配体可参入或共价结合到脂质体上以增强细胞的靶特异性。
使用本领域的技术人员熟知的技术可将calponin基因或含calponin基因的重组载体包被进上述各种膜中。例如，根据Danos O等人(Proc.Natl.Acad.Sci，1988；856460)中描述的方法可将calponin基因或含calponin基因的重组载体包装进病毒衣壳中。经过将calponin基因或含calponin基因的重组载体与上述脂肪类型以及一种液体介质(如水，Hepes缓冲的生理盐水溶液(150mM NaCl/20mM Hepes，pH7.4)，Tris-HCl缓冲液等)混合并搅拌混合物可将calponin基因或含calponin基因的重组载体包装进合成膜内。将calponin基因或含calponin基因的重组载体包装进合成膜时，可加入聚乙二醇，植物凝血素等。可选择calponin基因与膜的比率或含calponin基因的重组载体与膜的比率的值以便按所需量表达calponin基因。膜中包含的calponin基因或含calponin基因的重组载体优选的重量比为从10％到50％。
任选包装的calponin基因或含calponin基因的重组载体可经各种方法施用，如静脉内注射。优选的是使用导管经局部用药。在导管的辅助下，可将calponin基因转移到病灶位点或周围并经过使用导管高效地导入发病位点的血管壁。有代表性的导管的例子包括单气囊导管，Wolinsky冠状注入导管，双气囊导管和类似物。至于使用双气囊导管给药的方法，可使用Chang等的方法(Chang，S.et al.，Direct in vivo gene transfer into the coronary andperipheral vasculatures of the intact dog，Circulation，1991；832007-2011)。
根据常规配制技术可将作为活性成份的calponin基因或含calponin基因的重组载体与药用的载体一起配制以制配药物组合物。药用的载体的例子包括稀释剂、填充剂、无菌含水介质和各种无毒的有机溶剂。适于结合或选择以加入药物组合物的药用的物质有稳定剂、缓冲液、等渗剂等。稳定剂的例子包括糖类(如葡萄糖、甘露醇和类似物)、氨基酸(如甘氨酸等)、HSA、BSA，明胶等。缓冲液的例子包括Tris缓冲液，PBS缓冲液，柠檬酸缓冲液，乙酸缓冲液，HEPES缓冲液等。等渗剂的例子包括盐(如氯化钠)等，糖类(如葡萄糖、甘露醇和类似物)等。可使用经过将活性成份溶于或悬浮于上面物质的水溶液中生产的药用制剂。为了增加基因导入的效力，可加入聚乙二醇，DMSO和类似物。
当使用包含非包装状态的calponin基因或含calponin基因的重组载体之药用制剂时，可经过在病灶位点内血管壁上施用该药用制剂将calponin基因导入病灶位点的平滑肌细胞中，导入可使用磷酸钙共同沉淀法(Graham，F.L.et al.，Virology 1973；52456)，使用DEAE葡聚糖方法进行体内转染(Mocutchan，J.H.et al.，J.Natl.Cancer Inst.1968；41351)，使用以calponin基因或含calponin基因的重组载体与水凝胶的混合物覆层的单气囊导管进行气囊导入，或类似方法。当使用含有包装状态的calponin基因或含calponin基因之重组载体的药用制剂时，可经过注射和将药用制剂与双气囊导管保温一段时间或经过使用Wolinsky冠状注入导管注射进血管壁以便在病灶位点应用药用制剂将calponin基因导入发病位点的平滑肌细胞。
本发明动脉硬化治疗剂的用药剂量范围可根据年龄，性别，病人疾病的严重性，用药途径，用药次数，剂量形式等进行变动。一般来说，适于成年人的剂量相应于每天约20μg至600mg calponin基因的范围。
据信本发明的动脉硬化治疗剂具有低毒性或高度安全性，因为其活性成份是存在于哺乳动物平滑肌细胞中编码calponin的基因。另外，据信本发明的动脉硬化治疗剂具有极低的致癌性，因为已知calponin基因导入培养的平滑肌细胞中抑制了原癌基因如c-fos的表达。而且，经过在膜如脂质体和类似物中包装calponin基因或含calponin基因的重组载体进一步降低了本发明的动脉硬化治疗剂的细胞毒性。
参考下面实施例对本发明作更详细的解释，这些实施例只作为举证而不是对本发明范围的限制。
实施例11.人calponin cDNA的克隆从日本肝癌病人(男，54岁)的主动脉中分离RNA并根据Chirgwin等的方法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry 1977；185294-5299)进行纯化。使用OligotexTM-dT30<Super>(catalogNo.9021B，TAKARA SHUZO CO.，LTD)从RNA中纯化poly(A)+RNA。使用ZAP-cDNA合成试剂盒(catalog No.200400，StratageneCo.)和GigapackRII Gold(catalog No.200216，StratageneCo.)从poly(A)+RNA制备入主动脉入ZAPR-cDNA文库。将该文库的重组DNA涂布到尼龙滤膜HybondTMN+(catalog No.RPN.137B，Amersham Co.)上并使用鸡calponin cDNA作探针进行噬菌斑杂交(Takahashi，K.and Nadal-Ginard，B.，J.Biol.Chem.1991；26613284-13288)以产生阳性克隆。经过用f1辅助噬菌体R408VCSM13感染在pBluescript SK-中亚克隆阳性克隆。从亚克隆中选择最长的克隆并命名为pBluescript SK-hCN(Takahashi，K.etal.，Japanese Circulation Journal 1992；56 supplement 140)。使用SequenaseRVersion 2.0 DNA测序试剂盒(catalogNo.70781，USB Co.)对pBluescript SK-hCN进行测序。由此产生的人calponin cDNA碱基序列在序列描述中以SEQ ID NO1表示。2.构建含calponin基因的重组载体用限制性酶SmaI(Boehringer Mannheim Co.)将在1.中制备的pBluescript SK-hCN线性化并用T4DNA连接酶(TAKARASHV20 CO.LTD.)连接到退火的XhoI连接子(Boehringer MannheimCo.)上以便在pBluescript SK-hCN的人calponin cDNA 5′端插入XhoI限制性位点。用上面反应溶液转化E.coli DH5α细胞系(可从Lifetechnologies Inc.获得)。从转化的细胞培养物中分离质粒。用限制性酶XhoI(Boehringer Mannheim Co.)消化分离的质粒以产生含1522bp人calponin cDNA的片段和pBluescript SK-质粒的片段。该结果表明纯化的质粒是感兴趣的质粒。
然后，用限制性酶XhoI消化质粒并在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以分离SEQ ID NO1所示的含1522bp人calponin cDNA的片段。使用Prep-A-Gene DNA纯化试剂盒(catalog No.732-6010，Biorad Co.)纯化该片段。用T4DNA连接酶将纯化的DNA片段连接到用限制性酶XhoI(Niwa，H.et al.，Gene 1991；108193-200)消化的质粒pCAGGS上。用反应溶液转化E.coli DH5α细胞系。从转化的细胞培养物中纯化质粒并用限制性酶XhoI和PstI(Boehringer Mannheim Co.)消化以证实人calponin cDNA的插入和其相对于启动子的方向。由于用XhoI消化产生含1522bp人calponin cDNA的片段，用PstI消化产生大约1270bp含人calponincDNA 3′端和兔β-球蛋白3′-侧翼区的片段，因此证实纯化的质粒是表达人calponin之重组载体的质粒pCAGGS/hCN。
图1显示了含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN的限制性图谱。重组载体pCAGGS/hCN的大小是大约6.5kb。3.用脂质体包装用190μl Hepes缓冲的生理盐溶液(Hepes，20mM，NaCl，150mM；pH7.4)稀释N-[1-(2，3-二油酰氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氨甲基硫酸(DOTAP)(Boehringer Mannheim Co.)(1mg/ml，60μl)。在一个单独的步骤中，将2.中构建的重组载体pCAGGS/hCN(30μg)溶于250μl Hepes缓冲的生理盐溶液中。将上述2溶液混合并在室温下保温至少20分钟以产生具有包装于脂质体中的pCAGGS/hCN的颗粒。
作为对照，除了用质粒pCAGGS代替2.中构建的重组载体pCAGGS/hCN外重复上面程序以产生具有包装于脂质体的pCAGGS的质粒。4.动脉硬化治疗剂的制备向含有包装于脂质体的pCAGGS/hCN的颗粒(3.中制备)之溶液(500μl)中加入台盼蓝(10μl(Sigma Co.)和生理盐溶液(300μl)并混合以制备800μl的溶液。该溶液用作动脉硬化的治疗剂。
除了用质粒pCAGGS代替重组载体pCAGGS/hCN外重复上面程序以制备对照溶液。5.经皮的经腔基因转移(PTGT)使用18只兔子，用充气的气囊导管在5个大气压下对每只兔子的颈总动脉内面部分摩擦4-5cm以进行PTCA(C.R.Bard Inc.)。该操作重复3次。2天后，在每只处理过的兔子耳静脉中插入22G插管(Medikit Co.)并缓慢经静脉内注射4-5ml RaNonal 1A(TANABE SEIYAKU CO.，LTD.)(硫喷妥钠0.3g，碳酸钠0.18g)溶于30ml生理盐溶液形成的溶液以麻醉兔。随后，将兔固定于实验台上。
使用Wolinsky冠状注入导管(C.R.Bard Inc.)经皮的经腔基因转移(PTGT)给每只兔施用含有包装于脂质体的重组载体pCAGGS/hCN颗粒之溶液。简单地说，将每只颈总动脉内面部分已摩擦过的兔腹股沟区切开并暴露股动脉。将兔子仰卧并用线固定。用插管将兔股动脉穿孔。将2cm长的Wolinsky冠状注入导管(C.R.Bard Inc.)装上导管线以备PTCA(C.R.Bard Inc.)。经X-射线荧光镜观察选择用气囊预先摩擦的颈总动脉，导管线在摩擦位点最远点的前面，Wolinsky冠状注入导管位于颈内动脉与颈外动脉分叉近侧1cm处。
然后将18F针头(TERUMO CORP.)装上30cm长的注射筒(catalog No.9070112，NAMIC Co.)，将800μl在4.中制备的包装的pCAGGS/hCN溶液吸入注射筒。将注射筒连接到Wolinsky冠状注入导管的输入端，将包装的pCAGGS/hCN溶液注射进2天前摩擦的颈总动脉远端，并用BasixTMIn-deflator(MERIT Medical Co.)将压力维持在3个大气压；通过10次循环大约8秒进行注射，从颈总动脉去掉导线和Wolinsky冠状注入导管。制备抗生素Cefotax(CHUGAI PHARMACEUTICAL CO.LTD)(0.5g)溶于生理盐水(20ml)的溶液。将3ml Cefotax溶液局部注射到切开和穿孔的位置，剩余的Cefotax溶液经静脉内注射。
重复上面程序，除了用4.中制备的含包装的质粒pCAGGS的对照溶液代替包装的重组载体pCAGGS/hCN的溶液(对照组2)。
作为对照，2天前摩擦的颈总动脉近侧部分2-3cm处不作处理(对照组1)。6.血管内膜增生的证实经皮的经腔基因转移(PTGT)14天后，从用气囊摩擦的每只兔中取出颈总动脉。将大约4mm长的血管放入Tissue Tek冷冻模(可从Miles Laboratory Co.获得)中，使用Tissue Tek DCTCompound 4583(可从Miles Laboratory Co.获得)制备冷冻块。使用冷冻切片机将冷冻块切成5-6μm厚的切片。空气干燥后，将这些切片用苏木精和曙红染色。用颈总动脉壁横切面的显微照片评价三组中血管内膜增生的程度，这三组是用含人calponin cDNA的重组载体处理过的calponin组(n＝8)，未作处理的对照组1(n＝18)和用质粒pCAGGS处理的对照组2(n＝7)。这种横切面的3张显微照片如图3所示。图3(a)显示了在calponin组颈总动脉横切面观察到的血管内膜增生的形态学；图3(b)是对照组2；图3(c)是对照组1。图3表明calponin组血管内膜增生的程度比对照组1和对照组2的程度要小。
至于血管内膜增生程度的数值表达，用面积计测量了内膜和血管中层的面积，计算内膜与中层的面积比作为内膜增生的程度(Nabel，E.G.et al.，J.Clin.Invest.1993；911822-1829)。结果如图4所示。在图4的横坐标上，“对照组1”代表用气囊摩擦颈总动脉后未作处理的未处理对照组(n＝18)，“对照组2”代表用气囊摩擦颈总动脉后用质粒pCAGGS处理的对照组(n＝7)，“calponin组”代表用含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN处理的组(n＝8)。纵坐标上的数值表示颈总动脉横切面内膜与中层的面积比。在图4中，*和**分别表示显著性水平(p)不超过0.05％和0.005％。它证实了calponin组内膜增生的程度显著小于对照组1和对照组2的程度。
因此，上面实验的结果表明本发明的动脉硬化治疗剂在PTCA后防止再狭窄上有效。7.人calponin基因导入血管壁的证实从用含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN处理的calponin组的兔(n＝8)和用质粒pCAGGS处理的对照组2的兔(n＝7)中取出的颈总动脉血管标本用于进行如下处理。
向在6.中取出的颈总动脉血管标本中以所说标本重量3倍的量加入磷酸盐缓冲液(PBS)(8g/l NaCl，0.2g/l KCl，1.15g/1 Na2HPO4，0.2g/l KH2PO4)。剪切标本并匀浆。以15,000rpm离心匀浆物3分钟以产生上清。使用Sepa Gene(catalogNo.SG-0025，Sanko Junyaku Co.)从上清中提取DNA。用XhoI(Boehringer Mannheim Co.)处理DNA(10μg)并用酚和氯仿混合物提取。经乙醇沉淀DNA后，所得的沉淀溶于20μl水中，根据260nm波长下的吸光率测定DNA浓度。
使用溶液中相当于2μg DNA含量的DNA作为模板进行聚合酶链式反应。引物是下面2个合成的寡核苷酸，它含有人calponin cDNA5′和3′非翻译区的碱基序列。对于PCR，使用含Ampli TaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR试剂盒(catalog No.PJ5100，TAKARASHU20 CO.，LTD.)，在94℃变性条件下1分钟，55℃的退火条件下2分钟和72℃的合成条件下2分钟。以1.2％琼脂糖凝胶电泳证实对人calponin特异性的上面引物之间的DNA片段(1052bp)的扩增。5′GAGTGTGCAGACGGAACTTCAGCC 3′(SEQ ID NO3；SEQ IDNO1中序列18-41的正义序列)。5′GGCTGGGCCTGGCTGGGTCCAGCC 3′(SEQ ID NO4；SEQ IDNO1中序列1046-1069的反义序列)。
结果如图2所示。在图2中，泳道1是不含DNA的阴性对照，泳道2是来自用质粒pCAGGS处理的对照组2颈总动脉的DNA，泳道3是来自用含人calponin cDNA的重组载体pCAGGS/hCN处理的calponin组颈总动脉的DNA。在泳道3中检测到了具有1052bp长度的DNA片段，但泳道2未检测到。这些结果表明仅在calponin组中导入了人calponin cDNA基因。
工业适用性本发明的动脉硬化治疗剂对抑制血管内膜增生有用。因此，本发明的动脉硬化治疗剂对抵抗动脉硬化和它引起的局部缺血性心脏病(如心绞痛和心肌梗死形成)有效，特别是它们在防止PTCA后的再狭窄中非常有效。
序列表(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度1522个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线性(ii)分子类型mRNA的cDNA(iv)最初来源人(xi)序列描述SEQ ID NO1AACATGTGAG GAGGGAAGAG TGTGCAGACG GAACTTCAGC CGCTGCCTCT GTTCTCAGCG 60TCAGTGCCGC CACTGCCCCC GCCAGAGCCC ACCGGCCAGC ATG TCC TCT GCT CAC115Met Ser Ser Ala His5TTC AAC CGA GGC CCT GCC TAC GGG CTG TCA GCC GAG GTT AAG AAC AAG163Phe Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Gly Leu Ser Ala Glu Val Lys Asn Lys10 15 20CTG GCC CAG AAG TAT GAC CAC CAG CGG GAG CAG GAG CTG AGA GAG TGG211Leu Ala Gln Lys Tyr Asp His Gln Arg Glu Gln Glu Leu Arg Glu Trp25 30 35ATC GAG GGG GTG ACA GGC CGT CGC ATC GGC AAC AAC TTC ATG GAC GGC259Ile Glu Gly Val Thr Gly Arg Arg Ile Gly Asn Asn Phe Met Asp Gly40 45 50CTC AAA GAT GGC ATC ATT CTT TGC GAA TTC ATC AAT AAG CTG CAG CCA307Leu Lys Asp Gly Ile Ile Leu Cys Glu Phe Ile Asn Lys Leu Gln Pro55 60 65GGC TCC GTG AAG AAG ATC AAT GAG TCA ACC CAA AAT TGG CAC CAG CTG355Gly Ser Val Lys Lys Ile Asn Glu Ser Thr Gln Asn Trp His Gln Leu70 75 80 85GAG AAC ATC GGC AAC TTC ATC AAG GCC ATC ACC AAG TAT GGG GTG AAG403Glu Asn Ile Gly Asn Phe Ile Lys Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Val Lys90 95 100CCC CAC GAC ATT TTT GAG GCC AAC GAC CTG TTT GAG AAC ACC AAC CAT451Pro His Asp Ile Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe Glu Asn Thr Asn His105 110 115ACA CAG GTG CAG TCC ACC CTC CTG GCT TTG GCC AGC ATG GCG AAG ACG499Thr Gln Val Gln Ser Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ser Met Ala Lys Thr120 125 130AAA GGA AAC AAG GTG AAC GTG GGA GTG AAG TAC GCA GAG AAG CAG GAG547Lys Gly Asn Lys Val Asn Val Gly Val Lys Tyr Ala Glu Lys Gln Glu135 140 145CGG AAA TTC GAG CCG GGG AAG CTA AGA GAA GGG CGG AAC ATC ATT GGG595Arg Lys Phe Glu Pro Gly Lys Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ile Ile Gly150 155 160 165CTG CAG ATG GGC ACC AAC AAG TTT GCC AGC CAG CAG GGC ATG ACG GCC643Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Phe Ala Ser Gln Gln Gly Met Thr Ala170 175 180TAT GGC ACC CGG CGC CAC CTC TAC GAC CCC AAG CTG GGC ACA GAC CAG691Tyr Gly Thr Arg Arg His Leu Tyr Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Gln185 190 195CCT CTG GAC CAG GCG ACC ATC AGC CTG CAG ATG GGC ACC AAC AAA GGA739Pro Leu Asp Gln Ala Thr Ile Ser Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Gly200 205 210GCC AGC CAG GCT GGC ATG ACT GCG CCA GGG ACC AAG CGG CAG ATC TTC787Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Ala Pro Gly Thr Lys Arg Gln Ile Phe215 220 225GAG CCG GGG CTG GGC ATG GAG CAC TGC GAC ACG CTC AAT GTC AGC CTG835Glu Pro Gly Leu Gly Met Glu His Cys Asp Thr Leu Asn Val Ser Leu230 235 240 245CAG ATG GGC AGC AAC AAG GGC GCC TCG CAG CGG GGC ATG ACG GTG TAT883Gln Met Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gln Arg Gly Met Thr Val Tyr250 255 260GGG CTG CCA CGC CAG GTC TAC GAC CCC AAG TAC TGT CTG ACT CCC GAG931Gly Leu Pro Arg Gln Val Tyr Asp Pro Lys Tyr Cys Leu Thr Pro Glu265 270 275TAC CCA GAG CTG GGT GAG CCC GCC CAC AAC CAC CAC GCA CAC AAC TAC979Tyr Pro Glu Leu Gly Glu Pro Ala His Asn His His Ala His Asn Tyr280 285 290TAC AAT TCC GCC TAGGGCCACA AGGCCTTCCC TGTTTTCCCC CCAAGGGAGG 1031Tyr Asn Ser Ala295CTGCTGCTGC TCTTGGCTGG ACCCAGCCAG GCCCAGCCGA CCCCCTCTCC CTGCATGGCA 1091TCCTCCAGCC CCTGTAGAAC TCAACCTCTA CAGGGTTAGA GTTTGGAGAG AGCAGACTGG 1151CGGGGGGCCC ATTGGGGGGA AGGGGACCCT CCGCTCTGTA GTGCTACAGG GTCCAACATA 1211GAGCCGGGTG TCCCCAACAG CGCCCAAAGG ACGCACTGAG CAACGCTATT CCAGCTGTCC 1271CCCCACTCCC TCACAAGTGG GTACCCCCAG GACCAGAAGC TCCCCCAGCA AAGCCCCCAG 1331AGCCCAGGCT CGGCCTGCCC CCACCCCATT CCCGCAGTGG GAGCAAACTG CATGCCCAGA 1391GACCCAGCGG ACACACGCGG TTTGGTTTGC AGCGACTGGC ATACTATGTG GATGTGACAG 1451TGGCGTTTGT AATGAGAGCA CTTTCTTTTT TTTCTATTTC ACTGGAGCAC AATAAATGGC 1511TGTAAAATCT C 1522(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度297氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Ser Ala His Phe Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Gly Leu Ser5 10 15Ala Glu Val Lys Asn Lys Leu Ala Gln Lys Tyr Asp His Gln Arg20 25 30Glu Gln Glu Leu Arg Glu Trp Ile Glu Gly Val Thr Gly Arg Arg35 40 45Ile Gly Asn Asn Phe Met Asp Gly Leu Lys Asp Gly Ile Ile Leu50 55 60Cys Glu Phe Ile Asn Lys Leu Gln Pro Gly Ser Val Lys Lys Ile65 70 75Asn Glu Ser Thr Gln Asn Trp His Gln Leu Glu Asn Ile Gly Asn80 85 90Phe Ile Lys Ala Ile Thr Lys Tyr Gly Val Lys Pro His Asp Ile95 100 105Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe Glu Asn Thr Asn His Thr Gln Val110 115 120Gln Ser Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ser Met Ala Lys Thr Lys Gly125 130 135Asn Lys Val Asn Val Gly Val Lys Tyr Ala Glu Lys Gln Glu Arg140 145 150Lys Phe Glu Pro Gly Lys Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ile Ile Gly155 160 165Leu Gln Met Gly Thr Asn Lys Phe Ala Ser Gln Gln Gly Met Thr170 175 180Ala Tyr Gly Thr Arg Arg His Leu Tyr Asp Pro Lys Leu Gly Thr185 190 195Asp Gln Pro Leu Asp Gln Ala Thr Ile Ser Leu Gln Met Gly Thr200 205 210Asn Lys Gly Ala Ser Gln Ala Gly Met Thr Ala Pro Gly Thr Lys215 220 225Arg Gln Ile Phe Glu Pro Gly Leu Gly Met Glu His Cys Asp Thr230 235 240Leu Asn Val Ser Leu Gln Met Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ser Gln245 250 255Arg Gly Met Thr Val Tyr Gly Leu Pro Arg Gln Val Tyr Asp Pro260 265 270Lys Tyr Cys Leu Thr Pro Glu Tyr Pro Glu Leu Gly Glu Pro Ala275 280 285His Asn His His Ala His Asn Tyr Tyr Asn Ser Ala290 295(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑线性(ii)分子类型其它核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGTGTGCAG ACGGAACTTC AGCC(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸合成的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGCTGGGCCT GGCTGGGTCC AGCC
权利要求
1.一种用于动脉硬化的治疗剂，包含作为活性成份的calponin基因。
2.权利要求1的动脉硬化治疗剂，其中所说的calponin基因含有编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的碱基序列。
3.权利要求1的动脉硬化治疗剂，其中所说的calponin基因含有SEQ ID NO1的碱基序列。
4.权利要求1-3中任意一项的动脉硬化治疗剂，其中所说的calponin基因包装于合成的或天然存在的膜中。
5.权利要求4的动脉硬化治疗剂，其中所说的calponin基因包装于脂质体中。
6.权利要求1-3中任意一项的动脉硬化治疗剂，其中所说的calponin基因包含在能在平滑肌细胞中表达calponin基因的重组载体中。
7.权利要求6的动脉硬化治疗剂，其中所说的重组载体含有一个启动子。
8.权利要求7的动脉硬化治疗剂，其中所说的启动子是β-肌动蛋白启动子。
9.权利要求8的动脉硬化治疗剂，其中所说的重组载体是大小大约为6.5kb的重组载体pCAGGS/hCN它含有巨细胞病毒增强子，鸡β-肌动蛋白启动子，兔β-球蛋白3′剪接信号，兔β-球蛋白3′侧翼区，SV40复制起点和人calponin cDNA，并用下面的限制性图谱代表
10.权利要求6-9任意一项的动脉硬化治疗剂，其中所说的含calponin基因的重组载体包装于合成的或天然存在的膜中。
11.权利要求10的动脉硬化治疗剂，其中所说的含calponin基因的重组载体包装于脂质体中。
12.一种含有calponin基因并能在平滑肌细胞中表达calponin基因的重组载体。
13.权利要求12的重组载体，其中所说的calponin基因含有编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的碱基序列。
14.权利要求13的重组载体，其中所说的calponin基因含SEQ ID NO1的碱基序列。
15.权利要求12-14中任意一项的重组载体，它含有一个启动子。
16.权利要求15的重组载体，其中所说的启动子是β-肌动蛋白启动子。
17.权利要求16的重组载体，它是大小大约为6.5kb的重组载体pCAGGS/hCN，含有巨细胞病毒增强子，鸡β-肌动蛋白启动子，兔β-球蛋白3′剪接信号，兔β-球蛋白3′-侧翼区，SV40复制起点和人calponin cDNA并由下面限制性图谱代表。
18.一种药物组合物，包含作为活性成份的calponin基因和一种药用载体。
19.权利要求18的药物组合物，它用于治疗动脉硬化。
20.权利要求18的药物组合物，它用于治疗局部缺血性心脏病。
21.权利要求20的药物组合物，其中所说的局部缺血性心脏病是心绞痛。
21.权利要求20的药物组合物，其中所说的局部缺血性心脏病是心肌梗死形成。
22.一种治疗动脉硬化的方法，包含给病人施用治疗有效量的calponin基因的步骤。
23.一种治疗局部缺血性心脏病的方法，包含给病人施用治疗有效量的calponin基因的步骤。
24.权利要求23的方法，其中所说的局部缺血性心脏病是心绞痛。
25.权利要求23的方法，其中所说的局部缺血性心脏病是心肌梗死形成。
全文摘要
本发明提供了用于动脉硬化的治疗剂，它包含作为活性成分的calponin基因。本发明的动脉硬化治疗剂对抑制血管内膜增生有用。因此，本发明的动脉硬化治疗剂对抵抗动脉硬化和它引起的局部缺血性心脏病，如心绞痛和心肌梗死形成有效，特别是它们在防止PTCA后再狭窄中非常有效。
文档编号C12N15/09GK1136281SQ94194329
公开日1996年11月20日 申请日期1994年2月28日 优先权日1993年9月29日
发明者高桥克仁, 柴田宣彦 申请人:麒麟麦酒株式会社, 大阪府