专利名称：有效进行核酸测序的方法和组合物的制作方法
本申请是共同未决的美国申请系列No.08/303,058(1994年9月8日申请)的后继部分申请；而后者是美国申请系列No.08/127,420(1993年9月27日申请)的后继部分申请；所述公开的全部内容和附图均引入本文作为参考，不删除任何内容。按照Department of Energy grant LDRD 03235和美国能源部和芝加哥大学(代表Argonne National Laboratory)之间的合同No.W-31-109-ENG-38，美国政府拥有本发明的权利。
本发明的背景1 本发明领域本发明总的来讲涉及分子生物学领域。本发明特别提供新的方法和组合物以便能够高效地确定核酸分子的序列。本发明方法适用于确定长核酸分子的序列，包括染色体和RNA，而不需要克隆或亚克隆步骤。
2 相关领域的描述核酸测序形成目前科学进步的不可或缺的领域。确定核酸分子和片段的序列，即一级结构就研究特定目标领域范围的每个项目而言是非常重要的。测序所获得的资料影响着科学、医药、农业和生物技术的所有领域。当然，核酸测序对于人类基因组项目以及其他大规模计划是至关重要的，这些任务的目的在于进一步了解生物体的进化和功能并找出各种疾病的原因。
核酸测序的实用性是显而易见的，例如在各中心进行的人类基因组项目(HGP)，这是致力于确定全部人类基因序列的一项多国努力。但是，一般来讲在此领域的进展缓慢而且成本高。通常在分离长度上有一个核苷酸差异的1-500bpDNA片段的聚丙烯酰胺凝胶上进行核酸测序。可以用两种方法实际确测序列，即每个A，G，C和T核苷酸的顺序。第一种是使用在特定核苷酸处化学降解DNA片段的Maxam和Gilbert方法(Maxam &Gilbert(1977))，或第二种由Sanger和其同事描述的双脱氧链终止测序方法(Sanger et al.，1977)。这两种方法均费时费力。
最近，提出了不使用电泳步骤的其他核酸测序方法，这些方法总的可称为经杂交测序或SBH(Drmanac et al.，1991；Cantor etal.，1992；Drmanac & Crkvenjakov，美国专利5,202,231)。这样一些方法的发展已产生了称为测序芯片的新固体支持型测序工具。总之，在这项技术基础上而授予的美国专利已证实了SBH的实用性。但是，尽管SBH有潜力提高用其进行核酸测序的速度，目前所有的SBH方法还有一些缺陷。
可以用两种基本方式进行SBH，通常称为方式1和方式2(Cantor et al.，1992)。在方式1中，将一般为100-1000个核苷酸的未知序列的寡核苷酸排列在固体支持物和滤膜上，以便固定本身未知的样品(Strezoska et al.，1991；Drmanac &Crkvenjakov，美国专利5,202,231)。然后通过与约6-8个残基的标记探针杂交来探知所述阵的复制品。在方式2中，从有约6-8个残基之已知序列的寡核苷酸的阵形成测序芯片(Southern WO 89/10977；Khrapko et al.，1991；Southern er al.，1992)。然后标记未知序列的核酸并与固定寡核苷酸杂交。
令人遗憾的是，这两种SBH方式都有一些限制，特别是需要预先的DNA克隆步骤。在方式1中，其他明显的问题包括待测序的各种核酸碎片附着在固体支持物的表面或要制备大量的较长的探针。在方式2中，主要问题包括要标记未知序列的核酸，通常产生的高噪信比，而且事实上只能确定短序列。方式2的其他问题包括形成了不能接近一些靶目标的二级结构，而且不同GC含量的探针需要不同的条件。因此很明显，本领域将从一种用于核酸测序的新方法，特别是省去了冗长的克隆和/或亚克隆过程的方法中获益。
本发明综述本发明通过提供确定核酸序列的新方法和组合物而寻求克服现有技术中固有的这些和其他缺陷。本发明人将本文描述的新技术称为方式3，而且它显示出在现存方式1和方式2 SBH方法上的显著改进。在本发明提供的方式3测序中，提供与两组已知序列的小寡核苷酸探针杂交而确定核酸序列。本发明方法可以对极大的核酸分子，包括染色体材料或RNA进行高分辨的测序，而预先不必进行克隆、亚克隆或扩增。此外，本发明方法不需要大量的探针，不需要进行较大探针的复杂合成，或标记核酸片段的复杂混合物。
根据本发明方法，为了确定核酸序列，人们通过与来自限定长度并已知序列的两组小寡核苷酸探针(寡核苷酸)的互补序列杂交，来鉴定来自核酸的序列，所述探针覆盖了此探针长度的最大序列组合。然后人们分析鉴测序列，以确定重叠的鉴测序列的范围，然后从所述的重叠序列重建或组装完整的核酸序列。
通过相继与来自两组小寡核苷酸的互补序列杂交可以完成测序方法。另外，可以用称为“循环”的方式，其中两组小寡核苷酸同时与未知序列杂交。术语“循环”用作所述技术的分辨部分，来源于提高温度以“熔解”未互补的那些杂交物。所述循环技术是分子生物学的其他领域常用的，例如PCR，在阅读本发明时本领域专业人员是很容易理解的。
本发明可用于确定很长的核酸分子。作为一种实施情况，通常将待测的核酸分子制成片段以便得到易于操作的小或中等长度的核酸片段。本文所用的术语核酸片段大部分情况下指长度为约10个碱基对(bp)到约100bp之间的核酸分子。所完成的本发明的最优选的方法是其中处理核酸分子以得到中等长度的，即约10bp到约40bp的核酸片段。但是应该强调的是，本发明不是完全确定小核酸片段序列的方法，而是确定核酸分子本身序列的方法，其中包括确定所述分子内的部分序列-这或者用整个分子来完成，或者为了简化，首先将所述分子制成较小的约4到约1000bp的片段。
通过与已知序列的小寡核苷酸探针杂交来确定来自核酸分子的序列。在所提到的“小寡核苷酸探针”中，术语“小”指少于10bp的探针，而且优选的约4到约9bp长的探针。在一个举证性的测序实施方案中，设想约6bp的探针是特别有用的。对于覆盖所选探针长度的所有序列组合的寡聚物的组来讲，其数量为4F，其中F是探针的长度。例如，对于一个4-聚体，所述的组应含有256个探针；对于一个5-聚体，所述的组应含有1024个探针；对于6-聚体，是4096个探针；对于7-聚体，是16384个探针等。合成这种长度的寡核苷酸在本领域是常规的，而且可以用自动合成仪进行合成。
在本发明的方法中，将一组已知序列的小寡核苷酸探针(可以称为第一组)附着在固体支持物上，即将其固定在支持物上，以便使其可以参与杂交反应。另一组已知序列的小寡核苷酸探针(可以称为第二组)是溶液中的并且用可检测标记标记过的探针。所述寡聚物组可以包括长度相同或不同的探针。
相继杂交的过程指可将未知序列的核酸分子或片段与不同组已知序列的寡核苷酸探针在不同的时间杂交(
图1)。通常将核酸分子或片段变性以便进行杂交，然后将其在有分辨力的杂交条件下加到第一组固定探针中，以确保只有有互补序列的片段才能杂交。除去没有互补序列的片段，通过将第二组标记溶液中的探针加到已形成的片段探针组合中，从而完成下一轮的分辨杂交。在邻接固定探针处发生杂交的标记探针将附着在支持物上并被检测，若固定和标记探针之间有空间，则不是这种情况。
同时杂交的过程指可以将未知序列的核酸分子同时与不同组已知序列的寡核苷酸探针接触。在分辨杂交条件下会发生杂交。然后将没有互补序列的片段“熔解”，即通过提高温度而除去，然后进行下一轮的分辨杂交，使任何互补的第二探针杂交。然后，用相同的方法，检测在邻接固定探针处发生杂交的标记探针。
“互补”的核酸序列是根据标准Watson-Crick互补法则以及用于修饰的碱基时该法则的变化，能够进行碱基配对的那些。即较大的嘌呤或修饰的嘌呤总是与较小的嘧啶进行碱基配对，从而只能形成已知的组合。这些包括在DNA中，鸟嘌呤与胞嘧啶配对(GC)，腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(AT)，或者在RNA中，腺嘌呤与尿嘧啶配对(AU)。设想也可以使用修饰的碱基或所谓的广义碱基(M，Nichol et al.，1994)。
本文所用的术语“互补序列”指在整个长度上基本上完全互补并且几乎没有碱基失配的核酸序列。例如，若6个碱基长的核酸序列与6个位置中的5个杂交，而只有一个失配，则可以称为互补。自然，“完全互补”的核酸序列是在其全长均完全互补，而且没有失配的核酸序列。
核酸片段部分的各种单个序列通过与已知序列的寡聚物杂交而得到鉴定后，接下来分析这些单个序列以检测重叠的序列伸展范围。例如，鉴定了序列的一部分，其5’末端与另一序列的3’末端相同，或反之。然后可以描述核酸分子或片段的完整序列，即可以从由此确定的重叠序列将其重建。
通常通过计算分析鉴定重叠序列并重建完整序列。例如，如果标记探针5’-TTTTTT-3’与含有固定探针5’-AAAAAA-3’处杂交，就确定了核酸分子内的一个12聚体的序列，即5’-AAAAAATTTTTT-3’(SEQ ID NO1)，即将两个杂交探针的序列合起来得到一个以前未知的序列。接下来要回答的问题是新确定的5’AAAAAATTTTTT-3’(SEQ ID NO1)序列后的核苷酸是什么。由固定探针5’-AAAAAT-3’和A标记探针5’-TTTTTA-3’；标记T的5’-TTTTTT-3’；标记C的5’-TTTTTC-3’；标记G的5’-TTTTTG-3’代表了四种可能性。例如，如果探针5’-TTTTTC-3’是阳性的，而其他三种是阴性的，则装配的序列延伸为5’-AAAAAATTTTTC-3’(SEQ ID NO2)。在接下来的步骤中，规则系统确定在含有固定探针AAAATT处，标记探针TTTTCA，TTTTCT，TTTTCC或TTTTCG哪一个是阳性的。重复所述的过程直到使用了所有的阳性(F+P)寡核苷酸序列或将其确定为假阳性。
因此本发明提供了一种非常有效的途径以确定长核酸片段和分子的序列。本文所定义的大核酸分子是在测序前需切成片段的那些分子。通常它们有至少约45或50个碱基对(bp)长，而且经常是更长的。事实上，可以用本发明方法测序的核酸分子的长度实际上没有上限，以致于可以确定约100bp，1kb，100kb，1Mb和50Mb或更长的序列，最多达到而且包括完整的染色体，例如长度约为100Mb人染色体。这样大的数目也在本发明范围内，而且确定所述数目碱基的序列需要两组8聚体或9聚体的寡核苷酸(以便使F+P≈16-18)。待测的核酸可以是DNA，例如cDNA，基因组DNA，显微解剖而得到的染色体带，粘粒DNA或YAC插入片段，或者可以是RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA或snRNA。
确定长核酸分子之序列的方法包括单纯地从所述分子中鉴定长度为F+P的序列，然后用适宜的规则系统组合所述序列。在实践中，人们最有可能首先将待测的核酸分子制成片段以得到较小的片段，例如中等长度的核酸片段。然后如上所述通过将所述片段与来自两组已知序列的小寡核苷酸探针的互补序列杂交，例如相继杂交而鉴定长度为F+P的序列。在所述方法中，从长度为F+P的重叠序列可以重建特大分子的完整核酸序列。
不论待测核酸本身是中等长度的片段还是先被处理然后得到如此长度的片段，通过与两组已知序列的小寡核苷酸探针杂交从而从核酸片段鉴测序列的方法是本文所公开的测序方法的中心内容。所述方法主要包括下列步骤(a) 在有效的杂交条件下，将附着或固定寡核苷酸探针组或阵与核酸片段接触，以使含有互补序列的片段与探针充分杂交，由此形成一级复合物，其中所述片段具有杂交的和未杂交的，或“游离”序列；(b) 在有效的杂交条件下，将一级复合物与溶液中标记寡核苷酸探针组接触以便使含有互补序列的探针与未杂交的或游离的片段序列杂交，由此形成二级复合物，其中所述片段与附着(固定)探针和标记探针均杂交；(c) 从二级复合物中除去与附着探针未邻接杂交的标记探针，由此只剩下邻接的二级复合物；(d) 通过检测标记探针中标记存在来检测邻接的二级复合物；和(e) 通过组合或连接杂交的附着及标记探针，从邻接的二级复合物的核酸片段鉴定寡核苷酸序列。
根据所选的特定的测序方案，可以操纵用于处理一个或两个杂交步骤中的杂交或“洗涤条件”。例如，设计两种杂交条件使含有互补序列，即基本上匹配的序列，例如与6个位点上有5个杂交的那些序列的寡核苷酸探针与所给的核酸片段杂交。正如在目前的测序方法中所常规使用的，优选用简单的机器人装置进行杂交步骤。
另外，可以设计杂交条件使只有含有完全互补序列的那些寡核苷酸探针和片段杂交。这些分辨力更高的或更“严紧”的条件可以用于相继杂交过程的两个不同步骤或只用于两个步骤中的任意一个中。在所述情况下，所述寡核苷酸探针不论是固定还是标记探针，都只能与所给片段享有完全互补序列时与所给的核酸片段杂交。
所选的杂交条件通常限定了分析所得的数据所需的复杂程度。同样，用于分析任何所得数据的计算机程序可以限定在指定实验室中所必须使用的杂交条件。例如，在分辨力最高的方法中，两个杂交步骤都要在只能使具有完全互补序列的寡核苷酸和片段杂交的条件下进行。由于没有失配的碱基，所述方法牵涉最不复杂的计算分析，因此，它是目前实施本发明的优选方法。然而，一个或两个杂交步骤中使用分辨力较低的条件，也在本发明范围内。
在任意一个或两个步骤中所用的适宜的杂交条件常规的可以通过最优化方法或‘导航研究’而得到确定。由核酸测序领域专业人员常规地进行各种导航研究，建立工作方法和为给定实验室改变方法。例如，可以改变条件例如温度；各组分的浓度；所述步骤的时间长度；所用的缓冲液及其pH和离子强度，从而使其最优化。
在优选的实施方案中，本发明的核酸测序方法包括一个分辨步骤，以筛选包括了紧邻的固定和标记探针的二级杂交复合物，它们不同于未紧邻并且由一个，两个或多个碱基分开的那些复合物。可以用各种方法除去未与固定探针紧邻杂交的标记探针，即未对头拼接杂交的标记探针，留下的每个都是紧邻的二级复合物。
所述的分辨过程可能仅依赖于严紧控制的洗涤步骤，其中设计所用的杂交条件使紧邻的探针仍保持杂交，这是由于相邻核苷酸叠加的相互作用使稳定性提高。此外，可以改变洗涤条件，例如温度，浓度，时间，缓冲液，pH，离子强度等，以便使除去未紧邻的标记探针的效果达到最佳。
在优选的实施方案中，在进行洗涤步骤前紧邻的固定和标记探针应连接起来，即使它们共价相连，以除去任何未连接的探针。通过用含有化学连接试剂处理例如，水溶性的碳化二亚胺或溴化氰的溶液来进行连接。更优选的，可以使用来自许多来源(例如，Biolabs)的市售的连接酶，例如来自T4噬菌体的T4DNA连接酶。在任何情况下，然后人们可以通过更严紧的洗涤条件除去未紧邻的标记探针，所述的洗涤条件不会影响共价相连的标记和固定探针。
通过观察复合物中标记探针的标记位置，可以保留的相邻二级复合物。可以用化学可检测标记，例如荧光染料，或者经足够的修饰以致可以由化学显色方法检测的，或放射性标记例如35S，3H，32P或33P，来标记寡核苷酸探针，目前用33P是优选的。也可以用非放射性同位素标记探针，然后用质谱检测。
目前，实施本发明最优选的方法包括在所设计的条件下完成杂交，所述条件只能使有完全互补序列的寡核苷酸探针和片段杂交，而且只能使紧邻的那些探针保持杂交状态。所述方法随后需要最不复杂的计算分析。
若未知序列的核酸分子长于45或50bp，则确定其序列的有效方法主要包括处理所述分子以得到中等长度的核酸片段，然后确定这些片段的序列。核酸分子不论它是DNA还是RNA，都可以通过多种方法中的一种切为片段，例如通过限制酶消化来切割，通过物理方法来剪切如超声处理，通过NaOH处理或通过低压剪切。
在特定的实施方案中，例如涉及约4bp到约9bp的小寡核苷酸探针，人们目的生产约10bp到约40bp的核酸片段。当然，通常用较长的探针来确定较长核酸片段的序列，反之亦然，在特定优选的实施方案中，所用的小寡核苷酸探针为约6bp长，待测的核酸片段通常为约20bp长。如果需要，可以按大小分离片段以得到适宜长度的片段，例如，可以进行凝胶电源，例如琼脂糖凝胶，然后切下约所需长度的片段。
用下列术语也可以举例说明确定核酸分子序列的方法。首先人们要将一定量的待测核酸随机制成片段以得到长度为T的核酸片段的混合物。然后制备长度为F的一批已知序列之固定寡核苷酸探针和一组溶液中已知序列的长度为P的寡核苷酸探针，其中，F+P≤T，且优选的T≈3F。
然后在杂交条件下，人们将固定寡核苷酸探针与混合核酸片段接触，所述的杂交条件可以促使有效地形成杂交的及长度为F的互补序列，长度为T-F的未杂交片段序列的一级复合物。优选的，长度为F的杂交序列只含有完全互补的序列。
然后在有效的杂交条件下，将一级复合物与标记寡核苷酸探针组接触，以形成二级复合物。所述二级复合物含有杂交的、长度为F的互补序列和邻接杂交的、长度为P的互补序列。在优选的实施方案中，只有带有完全互补序列的那些标记探针才能进行杂交，而且只有在紧邻固定探针处杂交的那些探针才能保持杂交状态。在最优选的实施方案中，在此阶段，将连接邻接的固定和标记寡核苷酸探针。
接下来，通过检测标记存在而检测二级复合物，然后通过组合已知序列的杂交的固定和标记探针，从二级复合物的核酸片段中鉴定长度为F+P的序列。然后鉴定重叠的长度为F+P的序列范围，由此重建或从确定的重叠序列组装完整的核酸序列。
在本发明的方法中，可以通过本领域专业人员熟知的任何方法将第一组寡核苷酸附着，即将其固定到固体支持物上。例如，可以经可寻址的激光激活的光去保护进行附着(Fodor et al.，1991；Pease et al.，1994)。一种优选的方法是使用试剂例如nocleosidephosphoramidite或nocleoside hydrogen phosphorate如Southern& Maskos所述(PCT专利申请WO90/03382，掺入本文作为参考)，通过磷酸酯基团附着寡核苷酸并使用玻璃，尼龙或特富龙(teflon)支持物。另一种优选的方法是由Pease等人描述的光引发的合成(1994；引入本文作为参考)。人们也可以购买支持物结合的寡核苷酸，例如，由Affymetrix和Beckman销售的产品。
可以将固定寡核苷酸形成含有全部探针或给定长度(优选的约4到10个碱基)的探针亚组的阵，而且更优选的形成多个排好的固定寡核苷酸的阵，以形成所谓“测序芯片”。一种芯片的实例是使用疏水部分以产生独特的空间区域。可以设计用于不同应用的测序芯片，例如用于制作图谱，部分测序，用于诊断目的的靶区域的测序，mRNA测序和大规模基因组测序。对于每种应用，一种特定芯片可设计有不同大小探针或有不整套的探针。
在一个举证性实施方案中，两组寡核苷酸探针均为6个碱基长的探针，即6-聚物。在这种情况下，每组寡核苷酸含有4096个不同的探针。优选的第一组探针成阵地固定在一个微芯片上，最好是排列在64排和64列中。用可检测标记标记第二组的4096个寡核苷酸，然后分配在一组不同的试管中。在该实施例中，4096个芯片将被组合在一个大的阵或数个阵中。杂交核酸片段后，少量标记寡核苷酸加到各微芯片中以便进行第二个杂交步骤，4096个核苷酸中只有一个被加到一个微芯片中。
本发明其它的实施方案包括用于核酸测序的试剂盒，所述试剂盒通常含有附着有已知序列寡核苷酸探针阵的固体支持物，如图2A，图2B和图2C所示，其中所述的寡核苷酸能够参与杂交反应，和一组含有已知序列的标记寡核苷酸探针溶液的容器。也可以按图4所示完成排列。这描述了广义碱基的使用，作为一种附着方法或在末端给杂交片段增长尺寸。
在所述的试剂盒中，附着和溶液中的寡核苷酸探针可以是约4bp到约9bp长，优选的为约6bp长。所述寡核苷酸可以用化学可检测的或放射性标记进行标记，一般用32P标记探针是优选的，33P-标记探针是更优选的。所述试剂盒也可以含有化学或其它连接试剂，例如DNA连接酶。所述试剂盒也可以包括各种其它附加组合物和材料，例如96-头或96-针装置，缓冲液，切割长核酸分子的试剂和进行DNA片段大小筛选的工具。所述试剂盒甚至还可以包括标记RNA探针以便用RNAase除去探针，然后重复使用测序芯片。
附图的简要描述图1杂交过程中的基本步骤。步骤1待测序的未标记靶DNA(T)在分辨条件下与一附着寡核苷酸探针阵杂交。描述了连接探针Fx和探针Fy点。Fx和Fy的互补序列在T的不同位置。步骤2标记探针Pi(每芯片一个探针)与所述阵杂交。所描述的是在T上有互补靶的邻接Fx而不是Fy探针。步骤3通过应用分辨条件或试剂，选择性地熔解没有邻接探针的复合物。一个特定的实例是标记探针与附着探针背对背杂交时标记探针与固定探针连接。只有在探针邻接的情况下才能检测到阳性信号如Fx和Pi，在一个特定的实施例中，只有在探针连接的情况下才能检测到。
图2A，图2B和图2C表述举证性测序试剂盒的组分。
图2A 测序芯片，表示4P相等单元的阵各含有相等(或不等)的寡核苷酸阵。通过物理屏障或疏水带可将单元分开。在所述阵中有4,000-16,000个寡核苷酸芯片。
图2B是一个含有4F点的芯片单元放大图，每一个点上都有一个特定的合成的或点在上面的寡核苷酸探针(4,000-16,000)。每个点有数微米那么小，单元的大小为约1到10mm。
图2C表示一组试管，或一个或多个多孔平板，具有适宜数目的孔(在此情况下为4P个孔)。每个孔含有一定量的特异性标记寡核苷酸。如果合成时未进行标记，则可以贮存另外的未标记探针；在这种情况下，测序试剂盒将含有进行探针标记所必需的组分。连接试管/孔与芯片单元的线描述测序过程中的一个步骤，其中，一定量的一种标记探针被转移到芯片单元。通过加样器(单或多道的)或通过利用表面张力的针阵转移溶液。测序试剂盒中也可以包括转移工具。
图3A，图3B和图3C。通过随机切割一定量的一种DNA分子而产生的DNA片段的杂交。在图3A中，DNA片段T1含有固定和非固定标记探针的完整靶。图3B表示未适当切割DNA片段的情况。在图3C中，有足够的空间使探针P进行杂交，但邻接的序列不与它互补。在B和C的情况下，由于附着探针F分子的饱和，信号将受到减弱。与DNA片段和标记探针同时杂交以及杂交过程的循环是一些提高正确邻接杂交率的可能的途径。
图4。广义碱基作为接头或处于杂交终止位置中的应用。在探针合成中可以加入广义碱基(M碱基，Nichols et al.，1994)或所有四种碱基。这是一种增加探针长度，从而提高双螺旋的稳定性但不增加探针的数目的途径。广义碱基在探针游离末端的使用还提供了可以在不同阅读框架中阅读序列的间隔。
优选实施方案的详细描述在基础和应用生物学研究中确定核酸分子的序列是很重要的(Drmanac & Crkvenjakov，1990)。本发明提供了新而有效的确定并分析核酸分子序列的方法。所述方法的一个预期用途是与其他测序技术结合用于人基因组项目(HGP)。
目前已知有两种通过杂交测序(SBH)的方法。在方式1中，首先未知的基因组DNA或长达100-2000个核苷酸的寡核苷酸被排列在固体支持物上。然后通过与一组通常为6到8聚物的标记探针杂交来探询这些DNA。在相反的技术方式2中，6到8个核苷酸的寡聚物被固定在固体支持物上，然后与克隆并标记DNA碎片退火。
在两种SBH分析方法中的任一种中，必须包括许多步骤以便得到确定的序列。现有SBH方法的特殊问题就是与合成大量探针以及难以有效进行分辨杂交有关的问题。由于两个原因而很难做到完全分辨匹配和失配。首先，长于10个碱基的探针的末端失配是很难分辨的，第二，在分析长DNA片段时，所得的标记DNA片段的复杂混合物产生了高背景。
本发明提供了不需大量探针或增加长度的探针的有效分辨杂交而且消除了许多标记和克隆步骤，而这正是目前已知的每种SBH方法的特别缺陷之处。公开的高效核酸测序方法(称为方式3测序法)是基于与两组已知序列的小寡核苷酸探针杂交，因此至少可以确定双倍长度的序列。这些方法也可以确定极大核酸分子，包括染色体的测序，并解决其他SBH方法的问题，例如，许多核酸片段的附着或标记。本发明的特别有效之处还在于可以用其确定RNA甚至未扩增的RNA样品的序列。
继本发明之后，如公布于美国系列申请No.08/127,402和Drmanac(1994)中，描述了另一种称为阳性SBH(PSBH)的SBH的变体(Broude et al.，1994)。PSBH基本上是方式2的变体(其中固定已知序列的寡核苷酸，然后用其与已标记未知序列的核酸杂交)。在PSBH中，固定探针不是简单的单链探针，而是含有单链3’突出端的双螺旋。生物素化的双螺旋探针被固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上，以形成一种固定探针，然后与32P标记待测靶核酸混合。然后加入T4DNA连接酶以便将任何杂交的靶DNA与双螺旋探针的较短末端相连。然而，尽管代表了一种有趣的方法，但是，PSBH(如Broude et al.，1994报告的)与现存的SBH技术相比并没有显著的进步。例如，与本发明的方式3方法学不同，在方法的一轮实验中PSBH并未延长可测测序列的长度。PSBH仍需进行繁重的工作以标记未知的靶DNA，而这在方式3中是不需要的。总而言之，PSBH建成用于比较性研究或作图，而不是用于从头进行基因组测序。因此尽管它被广泛地用于所有的测序领域，但是它与作为甚至最大的基因组测序的有效工具的方式3相比有着显著的不同。
首先可以将待测的核酸制成片段。用任何方法均可完成这一步骤，所述的方法包括，例如，用限制酶切割，特别是用Fitzgerald等人描述(1992)的Cvi JI；用物理方法例如超声处理剪切；用NaOH处理；等。如果需要，可以从凝胶中切出适宜长度，如约10bp到40bp之间的片段。源分子(如人染色体)的完整核酸序列是通过限定源分子中存在的F+P序列并组装F+P序列的重叠部分来确定的。因此本发明方法并不需要确定片段序列的中间步骤，而是从描述的F+P序列构建整个分子的序列。
出于下列所讨论的目的，通常可以假定四种碱基组成了待测核酸的序列。它们是用于DNA的A，G，C和T以及用于RNA的A，G，C和U。然而，在特定实施方案的小寡核苷酸探针中使用修饰的碱基可能是有利的。为了完成本发明，人们通常制备大量限定长度的小寡核苷酸探针，探针覆盖了所有的序列组合。所述的数目为4N(4的N次方)，其中，探针的长度为N。例如，对于6聚体的探针来说，有4096种可能序列(46＝4096)。
在1mm2或1cm2微芯片上的一个正方阵中，固定一组长度为F的所述探针(4F)。在本发明的实施例中，将以64行和64列而排列。当然，人们要确保将寡聚物探针附着，或者说固定在微芯片的表面上，以便所述的寡聚物探针能够参与杂交反应。还要合成另一组长度为P的寡聚物数目为4P。“P组”的寡聚物用可检测标记标记，将其分散在一组试管中(图2A，2B和2C)。
4P个芯片将组合在一个大的阵中(或对于一个方便的大小是，约10-100cm2的数个阵中)，其中P相当于第二组寡聚物组中的寡核苷酸长度(图2A，图2B和图2C)。另外作为一个方便的实施例，P可以选为6(P＝6)。
可以将待测核酸制成片段以便得到未知序列的小核酸片段。这些片段的平均长度(称为T)一般应大于F和P的组合长度，而且可以是F长度的3倍(即F+P≤T和T≈3F)。在本发明的实施例中，人们想制得约20个碱基对长的核酸片段。将这些片段变性并在有利于互补序列杂交的条件下加到大阵中。
在本发明最简单和目前最优选的形式中，选择杂交条件以使只有当核酸片段中的6个连续的核苷酸与F寡核苷酸探针的所有6个核苷酸互补时才发生显著的杂交。所述杂交条件可以通过常规的优化领航研究来确定，所述的条件包括例如温度，各组分的浓度，各步骤时间的长度，所用的缓冲液以及缓冲液的pH。
在该阶段，各微芯片含有特定的杂交复合物。这些将以探针片段复合物形式存在，其中整个探针序列与所述片段杂交，但所述的片段较长，有一些未杂交序列形成复合物的“尾”。在所述实施例中，互补杂交的序列的长度为F，而未杂交序列长为T-F。所述片段的互补部分可以在或朝向一个适宜的末端，以便是形成一个较长的未杂交的尾。另外，所述片段的互补末端可以朝向相反的末端以便形成两个未杂交的尾(图3A，图3B和图3C)。
洗涤除去未杂交的非互补核酸片段后，将少量的组P中的标记寡核苷酸加到各微芯片中以便与从探针片段复合物伸出的未知序列的核酸片段尾杂交。仅将4种核苷酸之一种加到各微芯片中。此外目前优选的是使用只有当标记探针的所有6个核苷酸与核酸片段尾的6个连续核苷酸互补时而发生显著结合的杂交条件。如上所述，可以经领航确定优化杂交条件，例如温度，浓度，时间，缓冲液等。
在该阶段，每微芯片含有特定的‘二级杂交复合物’。这些是探针片段探针复合物形式，其中各探针的整个序列与所述片段杂交，而且其中所述片段可能有一些未杂交的序列。在这些二级杂交复合物中，固定探针和标记探针都与所述片段杂交以便两个探针紧邻或“背对背”。但是，给定的所述片段一般比探针的总长度长，固定探针和标记探针可能在由一个或多个碱基分开的非邻接位置上与所述片段杂交。
然后用一种方法处理大阵以除去未杂交的标记探针。在优选的实施方案中，所用的方法不仅可从阵中除去未杂交的标记探针，也可以除去非邻接杂交的标记探针。所述方法将使用分辨条件，以便从其中核酸片段与未邻接的两个探针杂交的那些二级杂交复合物中，分辨出包括邻接的固定和标记探针的那些二级杂交复合物。这是本发明的一个重要方面，因为它最终描述对应于固定探针和标记探针之组合序列的片段序列部分。
用于从阵中除去未杂交的和未邻接杂交的探针而留下邻接杂交的探针附着分辨步骤又是一个控制的洗涤过程。由于邻接探针的叠加效应，利用其增加的稳定性可以使邻接杂交的探针不受所选条件的影响。但是，在优选的实施方案中，考虑例如通过用含有化学连接剂或优选的用连接酶例如T4 DNA连接酶(Landegren et al.1988 Wu & Wallace，1989)的溶液处理，人们可以处理大阵以便使邻接的探针共价相连。
在任何情况下，完整的阵都要经严紧的洗涤，以便只剩下与阵相连的探针是带有长度为F+P个之邻接杂交部分的双链探针-片段-探针复合物(即本发明实施例中的12个核苷酸)。使用这种两步杂交反应，可以达到很高的分辨，这是因为考虑了3或4个独立分辨过程片段T至F个碱基的探针的分辨杂交；P个碱基的探针与片段T的分辨杂交；与P杂交体或甚至与含有非邻接的F+P探针的失配的杂交体相比，完全匹配(F+T+P)杂交体的分辨稳定性；F和P两个末端碱基的分辨连接。
人们通过观察阵中保留标记位置检测所谓的邻接二级复合物。从所述标记位置，通过组合固定和标记探针的已知序列可以确定所述片段的F+P(例如12)个核苷酸长的序列。然后从因此确定的重叠的F+P序列可以重建或组装源分子，例如人染色体的完整核酸序列。
若在测序过程中使用连接，按目前优选的，则不能重复使用普通的寡核苷酸芯片。本发明人认为用各种方法进行再循环是，这不会成为限制。例如，人们可以在探针之间产生可特异性裂解的键，然后在检测后裂解所述的键。另外，人们也可以使用核糖核苷酸作为第二探针，探针P，或用核糖核苷酸作为探针P中的连接碱基，以便随后可以用RNA酶或通过尿嘧啶DNA糖基化处理(Craig et al.，1989)除去所述的探针。其他设想的方法是用可以被选择性切割的化学连接来产生键(Dolinnaya et al.，1988)。
也可以设想本测序方法学进一步改变和改进，而且也在本发明的范围之内。这包括使用修饰的寡核苷酸以提高所述方法的特异性或有效性，与Hoheisel & Lehrach(1990)描述的相似。也可以使用循环杂交以增加杂交信号，正如在PCR技术中所用的。在这些情况下，人们可以使用不同温度的循环以再杂交特定的探针。通过使用末端位置等摩尔量的不同碱基的探针，本发明还提供了确定移码的方法。例如，使用等摩尔的7聚体，其中前六个碱基相同，而最后位置上可以是A，T，C或G均可。
下列实施例将用于说明本发明优选的实施方案。本领域专业人员应接受，在表述了本发明人所发明技术之后，于下列实施例中公开的技术，以本发明的实施中起很好的作用，因此可以认为构成其实施的优选方式。但是，本领域专业人员从本发明的公开来看，应该理解在公开的特定实施方案中可以有许多改变，并且仍可得到相似的结果而不会偏离本发明的精神和范围。
实施例I制备支持物结合的寡核苷酸通过例如用化学方法直接合成寡核苷酸，实践中通常用自动寡核苷酸合成仪可以很容易地合成寡核苷酸，即小核酸片段。
用任何适宜的支持物，例如玻璃、聚苯乙烯或特富龙(teflon)，本领域专业人员用任何已知的方法可以很容易地制备支持物结合的寡核苷酸。一种策略是把用标准合成仪合成的寡核苷酸精确地置于一点。用被动吸附(Inouye & Hondo，1990)；用紫外光(Nagata et al.，1985’；Dahlen et al.，1987’；Morriey & Collins1989)或通过共价健合碱基修饰的DNA(Keller et al.，1988；1989)可以达到固定目的，所有文献均引入本文作为参考。
可以使用的另一策略是用强生物素-链霉抗生物素蛋白间的相互作用作为连接物。例如Broude等人(1994)描述了生物素化探针的使用，尽管这些是双螺旋探针，但还是将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。链霉抗生物素蛋白包被的磁珠可以从Dynal，Oslo处购买。这种相同的连接化学也适用于用链霉抗生物素蛋白包被任何表面。生物素化的探针可以从各种来源购买，例如，Operon Technologies(Alameda，CA)。
Nunc实验室(Naperville IL)也出售可以使用的适宜的材料。Nunc实验室已研制了一种方法，用这种方法可以将DNA共价健合到称为CovaLink NH的微孔表面上。CovaLink NH是用二级氨基(＞NH)嫁接的聚苯乙烯表面，所述的二级氨基作为进一步共价健合的键桥的头。可以从Nunc实验室购买CovaLinkModules。通过磷酰胺键DNA分子可以仅仅在5’-末端与CovaLink结合，固定1pmol以上的DNA(Rasmussen et al.，1991).
已描述了利用CovaLink NH条带在5’-末端共价健合DNA分子(Rasmussen等，1991)。在所述技术中，使用了磷酰胺键(Chu等，1983)。由于仅仅使用一个共价键，因而是优选的。磷酰胺键将DNA与CovaLink NH二级氨基相连接，所述的氨基位于通过一个2nm长的间隔臂共价连于聚苯乙烯表面的间隔的一端。为了通过磷酰胺键将寡核苷酸与CovaLink NH相连，所述寡核苷酸末端必须有一个5’-末端磷酸基。那么甚至可能将生物素与CovaLink NH共价健合，然后用链霉抗生物素蛋白结合探针。
更具体地说，连接方法包括将DNA溶解在水中(7.5ng/ul)然后于95℃变性10分钟，在冰上冷却10分钟。然后将冰冷的0.1M1-甲基咪唑，PH7.0(1-MeIm7)加到终浓度为10mM1-MeIm7.将ss DNA溶液分散在冰上的CovaLink NH条带(75μl/孔)中。
制备新鲜的溶于10mM 1-MeIm7的碳化二亚胺0.2M 1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)，每孔加入25ul。将条带在50℃温育5小时。温育后用例如Nunc-Immuno洗液洗涤条带；首先将孔洗涤3次，然后用洗涤溶液将其浸5分钟，最后再将其洗涤3次(其中洗涤溶液是0.4NaOH，加热到50℃的0.25％SDS)。
认为更适用于本发明的其他方法在PCT专利申请WO90/03382(Southern & Maskos)中作了描述，该申请引入本文作为参考。这种制备与支持物结合的寡核苷酸的方法包括将核苷3’-试剂通过磷酸酯基团经共价磷酸二酯键附着于支持物携带的脂肪族羟基上。在附着核苷上合成寡核苷酸，在不会从支持物上裂解所述寡核苷酸的标准条件下从合成的寡核苷酸中除去保护基团。适宜的试剂包括nocleoside phosphoramidite和nocleosidehydrogen phosphorate.
更详细地说，通过于90℃与二甲苯，glycidoxy丙基三甲氧基硅烷，和痕量的二异丙基乙基胺混合物接触过夜而得到用于所述方法的支持物，例如玻璃平皿。然后用甲醇，醚将其彻底洗涤，并空气干燥。然后在含催化量的浓硫酸的六乙基甘醇中将所得的支持物在氩气中于80℃加热并搅拌过夜以得到烷基羟基衍生的支持物。用甲醇和醚洗涤后，真空干燥支持物，然后在氩气中贮于-20℃。
然后用衍生的玻璃平皿为固体支持物，在标准条件下用手完成寡核苷酸的合成。第一个核苷酸是三乙基铵盐形式的3’-磷酸氢酯，所述方法可以得到高纯度的与支持物结合的寡核苷酸。
也可以使用在芯片上制备DNA探针列阵的策略。例如，按Fodor等人(1991)所述(该文献引入本文作为参考)，直接在玻璃表面化学合成寡核苷酸时可以使用可寻址的激光激活的光去保护作用。也可以按Van Ness等人(1991)所述将探针固定在尼龙支持物上，或用Duncan & Cavalier(1988)的方法与特富龙相连；所有文献均引入本文作为参考。
Fodor等人(1991)描述了光指导的二核苷酸的合成，所述二核苷酸适用于用于装置微制备的复杂化合物的空间指导的合成。这是以利用光在固体支持物上指导同时合成化学化合物的方法为基础的。通过一个罩暴露于光或其他形式能量的方式或通过其他空间可寻址方法确定支持物的哪个区域被激活用于化学偶合。通过光激活的原因在于从所选的区域中除去了对光不稳定的基团。去保护后，将第一个携带对光不稳定基团的化合物暴露于整个表面，但只与在前一步骤中由光访问的区域发生反应。透过第二个罩照射底物，激活与第二个保护的结构单元反应的不同区域。在这些照射中所用的罩的形状和反应剂的序列决定了终产物和其位置。高度缩小是可能的，因为合成位点的密度只是根据空间可寻址能力受物理照射，即光照射的限制。每个化合物都受影响并且可以精确地知道其位置，因此，用这种方法制备的寡核苷酸芯片都可用于SBH。
Fodor等人(1991)描述了如下光激活形成二核苷酸的方式。从3’-胸苷乙酯合成5’硝基-藜芦基胸苷。用碱去保护后，5’-硝基藜芦基胸苷通过其3’-羟基与一胺化的底物成键。透过一个500-um的方格罩照射而除去硝基藜芦基保护基团。然后用亚磷酰胺活化的2’-脱氧胞嘧啶核苷处理底物。为了用荧光方法跟踪反应，此脱氧胞苷已用连接于环外氨的Fmoc保护氨已基连接物加以修饰。用碱除去FMOC保护基团后，通过用FITC处理底物而荧光标记含有二核苷酸的区域。因此完成所述的方法后，就可以合成支持物结合的寡核苷酸。
按Van Ness等人(1991)所述，为了将寡核苷酸与尼龙支持物相连，按如下要求经烷基化活化尼龙表面同时选择性的用氰尿酰氯活化寡核苷酸的5’-胺。用三乙基氧翁四氢硼酸盐将尼龙表面乙基化以便在尼龙表面形成胺反应活性的亚氨酸酯(imidate)，用1-甲基-2-吡咯烷酮作为溶剂。尼龙表面是未磨光的以达到最大可能的表面面积。
然后使活化表面与聚(吖丙啶)(Mr-10 K-70K)反应以形成聚合物包被，从而提供了用于连接寡核苷酸的一个延伸的胺表面。带胺尾的寡核苷酸选择性地与过量的氰尿酰氯反应(仅仅在胺尾)，以便以定量的产率得到4，6-二氯-1，3，5-三嗪基-寡核苷酸。用氨基取代氰尿酰氯的一个氯会明显地降低其余氯基团的反应性。这样提高了4，6-二氯-1，3，5-三嗪基-寡核苷酸的水解稳定性，从而适于在缓冲的水溶液(pH8.3，4℃，1星期)中在延长的时期内都是稳定的，并且容易用大小排阻层析或超滤分离和纯化。
反应对于胺尾是特异性的，而在核苷酸部分没有明显的反应。然后PEI包被的尼龙表面与用氰尿酰氯活化的寡核苷酸反应。很容易将高浓度的‘捕获’序列固定在表面上，而在衍生过程的最后步骤中用琥珀酸酐封闭未反应的胺基。
一种制备支持物结合的寡核苷酸的特殊方法是由Pease等人(1994。引入本文作为参考)描述的利用光产生的合成。这些作者使用了目前的照相平版印刷技术以得到固定寡核苷酸探针的列阵(DNA芯片)。这些方法(其中用光以高密度、缩小的列阵指导寡核苷酸探针合成)利用了对光不稳定的5’-保护的N-酰基-脱氧nocleoside phosphoramidite，表面连接化学以及多种组合的合成策略。用这种方法可以得到256个空间限定的寡核苷酸探针的方阵，然后按本文所述用于有利的方式3测序。
Pease等人(1994)提出了一种适用于光指导的寡核苷酸合成策略。在所述方法中，透过照相平版印刷罩照射用对光不稳定的保护基团修饰的固体支持物的表面，在受到照射的区域得到反应性的羟基基团。然后将3’0-亚磷酰胺-活化的脱氧核苷(用对光不稳定的基团保护5’-羟基)置于表面上，在暴露于光的位点发生偶合。封闭，氧化后，漂洗底物，然后透过第二个罩照射表面以便暴露另一个进行偶合的羟基基团。将第二个5’-保护的3’0-亚磷酰胺-活化的脱氧核苷放在表面上。重复选择性光去保护和偶合循环直到得到所需的产物组。由于使用了照相平版印刷术，因而，得到高密度寡核苷酸探针阵的过程得以缩减，在各位点的序列是已知的。
制备必需的5’0-(α-甲基-6-硝基胡椒氧基羰基)-N-酰基-2’-脱氧nocleoside phosphoramidite(MeNPoc-N-酰基-2’-脱氧nocleoside phosphoramidite)的合成途径包括第一步，N-酰基-2’-脱氧核苷与1-(2-硝基-4，5-亚甲基二氧苯基)乙基-1-氯甲酸酯反应以得到5’-MeNPoc-N-酰基-2’-脱氧核苷。第二步，用标准方法使3’-羟基与2-氰乙基N，N’-异丙基亚磷酰胺氯反应以得到5’-MeNPoc-N-酰基-2’-脱氧核苷-3’-0-(2-氰乙基N-N-二异丙基)亚磷酰胺。在正常亚磷酰胺合成条件下，光保护的基团是稳定的，而且可以用含水碱除去。在4℃氩气中，这些试剂可以长期贮存。
已报道MeNPoc-dT，MeNPoc-dCibu，MeNPoc-dGPACMeNPoc-dAPAC的光解半衰期分别为28s，31s，27s和18s(Pease etal.，1994)。在平版印刷合成中，因此推荐采用4.5分钟的照射时间，可以确保除去＞99％的MeNPoc保护基团。
适宜的支持物是通过用浓NaOH清洗，然后用水彻底漂洗而制备的由5.1×7.6cm玻璃底物组成的支持物。然后用在95％乙醇中的10％(体积/体积)双(2-羟基乙基)氨基丙基三乙氧基硅烷(Petrarch Chemicals，Bristol，PA)溶液将表面衍生2小时，用乙醇和醚彻底漂洗，于40℃在真空中干燥，然后于100℃加热15分钟。在所述的研究中，通过将衍生的底物与4’4-二甲氧基三苯甲基(DMT)-六乙氧基-0-氰乙基亚磷酰胺反应而连接合成连接臂接头。
总之，为了开始合成寡核苷酸探针，应该将适宜的脱氧nocleoside phosphoramidite通过一个连接臂接到合成支持物上。透过一个照相平版印刷罩的800×12800um孔来照射，从而激活支持物的区域。可以完成其他亚磷酰胺合成循环(用DMT-保护的脱氧核苷)以得到任何所需的序列，例如，任何4-，5-，6-，7-，8-，9-或10-聚体的序列。用浓缩的NH4OH处理4小时除去磷酸和环外胺保护基团后，将底物嵌在水包的热稳定控制的杂交箱中以备使用。
当然，人们很容易从商业途径购买DNA芯片，例如上述的光活化的芯片。鉴于此，人们可以与Affymetrix of SantaClara，CA 95051，and Beckman联系。实施例II探针中所用的修饰的寡核苷酸在本发明方法中可以使用修饰的寡核苷酸以提高杂交的特异性或效率。达到此目的的一种方法是通过碱基修饰取代天然的核苷酸。例如，可以使用在C5-位置带有一个卤素的嘧啶。据认为通过影响碱基堆积而提高双螺旋的稳定性。也可以使用2，6-二氨基嘌呤以便在其与胸腺嘧啶进行碱基配对时形成一三个氢键，由此使DNA双螺旋热稳定。有报告认为用2，6-二氨基嘌呤可以明显提高短寡核苷酸的双螺旋稳定性。认为它的掺入使得可以在更严紧的条件下进行引物退火，由此提高双螺旋形成的特异性并抑制背景问题或短寡核苷酸聚物的使用。
由Hoheisel & Lehrach(1990，引入本文作为参考)公开了这些修饰核酸三磷酸酯合成的方式。简而言之，从Sigma购买5-氯-2’-脱氧尿苷和2，6-二氨基嘌呤2’-脱氧核苷。按如下完成磷酸化在氩气下，将50mg无水2-NH2-dAdo溶于500ul磷酸三乙酯中，搅拌。加入25μl POCl3，然后于-20℃将混合物温育。同时，将1mmol焦磷酸溶于0.95ml三-正-丁基胺，和2ml甲醇，然后在旋转蒸发器中蒸干。随后，通过用5ml吡啶蒸发两次而将其干燥，在第二次前还加入70μl三-正-丁基胺。最后，将其溶于2ml干燥的二甲基甲酰胺。
-20℃90分钟后，蒸发磷酸化混合物以除去过量的POCl3，加入在二甲基甲酰胺中的磷酸三-正-丁基铵。于室温温育1.5分钟。加入5ml 0.2M碳酸氢三乙基铵(pH7.6)而终止反应，然后在冰上保持4小时。对于5-Cl-dUrd，条件应是相同的，但应加入50μl POCl3，而且在室温进行4小时的磷酸化。
水解后，蒸发混合物，将pH调到7.5，然后用1体积二乙基醚抽提。用0.15M到0.8M碳酸氢三乙基铵的线性梯度在一Q-Sepharose柱(2.5×20cm)上分离产物。冷冻贮存，在很长一段时间内核苷酸是稳定的。
人们也可以使用Nichols等人(1994)设计的非分辨碱基类似物或广义碱基。产生这种新的类似物，1-(2’-脱氧-β-D-核糖呋喃基)-3-吡咯(称为M)是为了用于寡核苷酸探针和引物以解决因遗传密码兼并性而带来的，或在只能得到成片段的肽序列而引起的设计的问题。所述类似物使堆积最大化，而使氢键合的相互作用最小化，但又不会在空间上破坏DNA双螺旋。
设计M核苷类似物以便用与杂芳环相连的非质子极性取代基使叠加的相互作用最大化，提高链内和链间的相互作用以降低氢键在碱基配对特异性中的作用。Nichols等人(1994)倾向于3-硝基吡咯2’-脱氧核糖核苷，因为其结构和电子类似于对-硝基苯胺，其衍生物是已知最小的双链DNA掺入物。
也可以将二甲氧基三苯甲基保护的核苷M亚磷酰胺掺入用作引物的核苷酸中进行测序和聚合酶链反应(PCR)。Nichols等人(1994)表明了可以用M取代而不会丧失引物特异性的核苷酸基本数目。
M的特有特性在于其取代长区域内的连续核苷并且仍作为有功能的测序引物的能力。已报告了有3个，6个和9个M取代的序列，得到可读的测序阶梯，以及用含有3种不同M的引物进行PCR可以扩增正确的产物(Nichols等人，1994)。
含有3-硝基吡咯的寡核苷酸作为引物的能力明显说明双螺旋结构必须与互补链形成。从寡核苷酸对d(5’-C2-T5XT5G-3’)和d(5’-C2A5YA5G2-3’)(其中X和Y可以是A、C、G、T或M)得到的光学热图谱与从DNA双-到-单链过渡观察到的正常S形图一致。报告含有XM碱基对的寡核苷酸(其中X是A、C、G、T，Y是M)的Tm值均在3℃范围内(Nichols等人，1994)。
实施例III制备测序芯片和列阵本实施例描述由本发明人完成的测序芯片的物理实施方案。
基本的实施例是使用粘附于50μm表面的6-聚物以得到3×3mm的芯片，从而组合得到20×20cm的阵。另一个实施例是使用粘附于10×10μm表面的9-聚物以得到一个9聚物芯片，大小为5×5mm。可以使用4000个单元的所述芯片以得到30×30cm的阵。图2A、图2B和图2C表示还有另一种阵，其中4000到16000个寡核苷酸芯片被排在一个平方阵中。在阵中还包装了平皿或试管组，作为测序试剂盒的一部分。
阵彼此物理或经疏水表面而被分开。利用疏水带分离的一种可能的方法是使用如QA Laboratories Toronto，加拿大生产的Iso-Grid Microbiology System的技术。
疏水网格膜滤器(HGMF)用于分析食品微生物已有10年，它们在大的数字范围和自动计数菌落方面表现出了独特的魅力。一种市售的网格是来自QA Laboratories Ltd.(Toronto，加拿大)ISO-GRID，由聚砜类聚合物(Gelman Tuffryn HT-450，0.45μ的孔)方阵(60×60cm)组成，在其上有由1600(40×40)个方格组成的黑色疏水油墨网格。已用经真空过滤的细菌悬液接种HGMF，然后在所选的分化或选择培养基上温育。
由于微生物生长受到膜上已知位置和大小的网格小格的限制，所以HGMF比常规平皿或膜滤器更像MPN装置。Peterkin等人(1987)报告当与HGMF复制单元一起使用时，这些HGMF可用于增殖并贮存基因组文库。一种所述的仪器可以复制ISO-GRID 1600个细胞中每个细胞的生长，并且能够作成许多主HGMF的拷贝(Peterkin等人，1987)。
Sharpe等人(1989)还使用了来自QA Laboratories的ISO-GRID和自动HGMF计数仪(MI-100 Interprter)和RP-100 Replicator。他们报告了用于保持和筛选许多微生物培养物的技术。
Peterkin和同事后来描述一种用疏水网格-膜滤器筛选DNA探针的方法(Peterkin等人，1989)。这些作者报告了在HGMF上直接进行有效的克隆杂交的方法。以前，在其上印有HGMF的聚砜类聚合物只有很低的DNA结合能力，因此结果很差。但是Peterkin等人(1989)报告在与DNA接触前通过用聚吖丙啶-聚阳离子处理复制和温育的HGMF可以提高DNA与膜表面的结合。尽管这项早期的工作使用细胞的DNA连接，而且与本发明有不同的目的，但是描述的方法很容易经改进后用于方式3SBH。
为了快速鉴定有用的序列，Peterkin等人(1989)使用了来自不同克隆的放射标记质粒DNA，并检测了其对所制备的HGMF上的DNA的特异性。用这种方法，通过对HGMF复制物上的100个生物的菌落杂交，可以迅速筛选来自重组质粒的DNA，可以很容易重复制备所述的HGMF复制物。
必须要解决两个问题。用小芯片(2-3mm)操作，并且同时要完成许多反应。本发明的解决办法是将芯片和探针保持在相应的阵中。在一个实施例中，以8×8mM平皿(15μM/寡核苷酸，Pease等人，1994)的形式在硅片上合成含有250000个9-聚物的芯片，所述平皿以8×12方式(96芯片)，彼此间有1mm的槽而进行列阵。用多道移液管或针阵加入探针，一个芯片上一个探针，为了记录所有4000个6-聚物，要使用42个芯片阵，可以使用不同的芯片或将芯片阵重复使用数次。
在上述情况下，使用本说明书较早部分的说明，F＝9；P＝6；和F+P＝15。芯片可以有BxNn个探针，其中，x是特定碱基B的数目；n是非特定碱基数目；这样x＝4到10，n＝1到4。为了达到更有效的杂交，并且任何支持寡核苷酸的影响，可以用非特定碱基围住特定碱基，因此用公式(N)nBx(N)m表示(图4)。
实施例IV制备核酸片段可以从任何适当的来源，例如cDNA、基因组DNA、染色体DNA、显微切割的染色体带、粘粒或YAC插入片段和RNA，包括未经过任何扩增步骤的mRNA得到待测的核酸。例如，Sambrook等人(1989)描述了三种从哺乳动物细胞中分离大分子量DNA的方法(p.9.14-9.23)。
然后用本领域技术人员已知的方法将所述核酸制成片段，所述方法包括，例如，用Sambrook等人(1989)描述的限制酶，用超声剪切和NaOH处理。
也可以使用Schriefer等人(1990，掺入本文作为参考)描述的低压剪切方法。在所述方法中，DNA样品在从低到中的不同压力下通过小French压力小室。一个手柄装置可以使从低到中的压力施加给所述小室。这些研究的结果表明，低压剪切是除超声和酶促将DNA制成片段的方法以外的另一种有效的方法。
将DNA制成片段的一种特别适宜的方法是由Fitzgerald等人(1992)描述的使用识别两个碱基的核酸内切酶，CviJI.这些作者描述了将DNA快速制成特定大小的片段，然后进行分离的方法，它们适用于鸟枪法克隆和测序。本发明人认为对于产生随机的，但是相对小的用于本发明测序技术的DNA来说也是特别有用的。
限制性核酸内切酶CviJI常规地在G和C之间裂解识别序列PuGCPy以得到平整末端。改变这种酶(CviJI**)特异性的典型反应条件，由pUC19(2688个碱基对)小分子产生半随机分布的DNA片段。Fitzgerald等人(1992)定量分析了这种制片段策略的随机性，使用了经快速凝胶过滤按大小分级的pUC19的CviJI**消化片段，然后不进行末端修复直接与lacZ-M13克隆载体相连。76个克隆的序列分析表明，除PuGCPy外，CviJI**还限制酶切PyGCPy和PuGCPu，而且，新的序列元(sequence data)以一致于随机片段生成的速率积累。
正如文献中报告的，所述方法与超声处理和琼脂糖凝胶分离相比，其优点在于需要少量的DNA(0.2-0.5μg，而不是2-5μg)；涉及较少的步骤(不需要预连接，末端修复，化学抽提或琼脂糖凝胶电泳和洗脱)。在制备用于方式3的DNA测序时，这些优点也是有用的。
不考虑得到或制备核酸片段的方法，重要的是将DNA变性以得到用于杂交的单链片段。通过在80-90℃将DNA溶液温育2-5分钟就可以达到此目的。然后将所述的溶液迅速冷却到2℃以防止在将DNA片段与芯片接触前，所述DNA片段复性。按实施例VI中所述，还必须从基因组DNA中除去磷酸基团。
实施例V制备标记探针用自动合成仪可以制备寡核苷酸探针，这是本领域专业人员熟知的，例如使用Applied Biosystems系统。另外，利用使用数组多孔特富龙片的Genosys Biotechnologies Inc.方法也可以制备探针。
寡核苷酸探针可如下标记，例如可以用放射性标记物(35S、32P、33P，而优选的是33P)标记含有100-200μm或100-400μm点的阵；非放射性同位素(Jacobsen等人1990)；或荧光团(Brumbaugh等人，1988)。所有所述的标记方法是本领域专业人员熟知的，正如由Sambrook等人(1989)中的有关部分举证的，以及其他参考文献例如Schrbert dr(1990(，Murakami等人(1991)和Cate等人(1991)的，所有文献均引入本文作为参考。
就放射性标记而言，常用的方法是使用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记或使用Klenow或甚至T7聚合酶进行高比活标记。其描述如下。
合成在其5’末端没有磷酸基团的寡核苷酸，因而通过使用噬菌体T4多聚核苷酸激酶转移〔γ-32P〕ATP或〔γ-33P〕ATP的γ-32P或γ-33P很容易将其进行标记。如果有效地完成了此反应，所述探针的比活性可以与〔γ-32P〕ATP或〔γ-33P〕ATP本身的比活性一样高。如下描述的反应是设计来，以标记10pmol的寡核苷酸达到高比活性。通过增加或减少反应的大小，保持所有组分浓度不变可以很容易标记不同量的寡核苷酸。
用1.0μl寡核苷酸(10pmol/μl)；2.0μl 10×噬菌体T4多聚核苷酸激酶缓冲液；5.0μl〔γ-32P 〕ATP或〔γ-33P〕ATP(比活性5000Ci/mmol；10mCi/ml水溶液)(10pmol)和11.4μl水组成反应混合物。将8单元(约1μl)噬菌体T4多聚核苷酸激酶加到反应混合物中混匀，然后在37℃温育45分钟。将反应在68℃加热10分钟以使噬菌体T4多聚核苷酸激酶失活。
然后确定将32P或33P转移到寡核苷酸的效率及其比活性。如果探针的比活性是可接受的，就将其纯化。如果比活性太低，则再加入8个单元的的酶，于37℃再温育30分钟，然后于68℃将反应加热10分钟使酶失活。
通过用乙醇沉淀；用鲸蜡基吡啶翁溴化物沉淀；用通过bio-凝胶P-60的层析或通过在Sep-Pak C18柱上层析可以纯化放射性标记寡核苷酸。
用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段合成与合成寡核苷酸互补的DNA的一条链，可以得到有更高比活性的探针。将短引物与寡核苷酸模板杂交，所述模板的序列是所需放射标记探针的互补物。然后用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段延伸引物以便用模板指导的方法掺入〔α-32P〕dNTP或〔α-32P〕dNTP。反应后，通过变性，然后在变性条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离模板和产物。如果需要，用所述的方法，可以得到每个寡核苷酸分子含有数个放射性原子的寡核苷酸探针。
为了应用所述的方法，人们将在一个微离心管中混合达到所需比活性以及足以完全合成所有模板链所必需的计算量的〔α-32P〕dNTP或〔α-32P〕dNTP。在反应过程中的任何阶段，dNTP的浓度不应小于1μM。然后向试管中加入适量的引物和模板DNA，引物超过模板3-10倍。
然后加入0-1体积的10×klenow缓冲液并充分混心，每5μl的反应液中加入2-4单元的大肠杆菌DNA聚合酶工的klenow片段，混心，4℃温育2-4小时。如果需要，反应进程可通过取出小份(0.1μl)，测定已用10％三氯乙酸(TCT)沉淀配放射活性比例来监测。
用等体积的凝胶上样缓冲液稀释反应物，80℃加热了3分钟，然后将全部样品上样在变性的聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，将凝胶放射自显影，确定探针的位置，，然后从凝胶中取出。如下的荧光团标记方法也是可行的。Brumbaugh等人(1988)描述了荧光标记引物的合成。合成在C-5连接一个12原子的一级胺“连接臂”的脱氧尿苷类似物。类似物的合成包括通过金属有机化合物的中间产物衍生2’-脱氧尿苷以得到5’(甲基丙烯基(propenoyl))-2’-脱氧尿苷。与二甲氧基三苯甲基氯反应生产相应的5’-二甲氧基三苯甲基产物。将甲基酯水解，活化，然后与适当单酰基化的烷基二胺反应。纯化后，将所得的连接臂核苷转化成适用于寡核苷酸化学合成的核苷类似物。
用改进的phosphoridite化学方法制备含有一个或两个碱基带连接臂的寡核苷酸。将20μl 300mM FITC的二甲亚砜溶液加到25μl 500mM碳酸氢钠(pH9.4)，其中含50nmol连接臂寡核苷酸溶液中。在室温将混合物搅拌6小时。用1×30cmSephadexG-25柱经20mM乙酸胺(pH6)洗脱从游离FITC中分离寡核苷酸，合并第一个UV-吸收峰组分。
总之，在寡核苷酸5’-末端的荧光标记首先包括两步。第一，在自动的DNA合成过程中，将N-保护的氨基烷基亚磷酰胺衍生物加到寡核苷酸的5’-末端。除去所有的保护基团后，将适当荧光染料的NHS酯与5’-氨基基团偶联过夜，然后用反相HPLC或PAGE从过量的染料中纯化标记寡核苷酸。
Schubert等人(1990)描述了亚磷酰胺的合成，在自动DNA合成过程中可以生产用荧光素标记寡核苷酸。在DMF中，有K2CO3和KI存在的条件下，经17小时用4-氯(4’4-二甲氧基三苯甲基)丁醇-1将荧光素甲基酯烷基化。用含1％TFA的氯仿溶液除去三苯甲基后，用双(二异丙基氨基)甲氧膦经标准方法将产物phosphitylated.上述所得荧光素衍生物的磷酸化会得到相当产率的H-磷酸酯。用所得的amidite(0.1M的无水乙腈溶液)利用β-氰乙基亚磷酰胺化学方法和DNA合成仪自动合成不同的引物。在室温经36小时用25％氨水从支持物上裂解并去保护。用PAGE纯化粗产物，在310nm肉眼观察标记引物为淡绿色的荧光带。用RP 18盒洗脱并脱盐得到所需的产物。
在Schubert方法中，荧光标记探针的的5’-末端是在最后偶联循环的DNA合成过程中直接完成的。偶联产率与用正常亚磷酰胺的一样高。经脱保护并用speed vac冻干或乙醇沉淀除去氨后，可以将荧光标记寡核苷酸直接用于方式3 SBH的DNA测序。
Murakami等人也描述了荧光素-标记寡核苷酸的制备。所述的合成方法是以聚合物-支持的亚磷酰胺和氢磷酸酯方法为基础。用亚乙基二酰胺或六亚甲基二酰胺作为系链。经亚磷酰胺键将其导入，通过氢磷酸酯中间产物在CCI4溶液中的氧化作用而形成。用一级胺定向的试剂，FITC，在珠上标记修饰寡核苷酸。从珠上裂解所得的修饰寡核苷酸，随后经RPLC纯化。
Cate等人(1991)描述了将寡核苷酸探针直接与结合有直接的化学发光底物(AMPDD)的碱性磷酸酶结合以探针检测的应用。碱性磷酸酶可以与修饰的寡核苷酸碱基共价健合。杂交后，将寡核苷酸与AMPDD温育。碱性磷酸酶破坏AMPDD以得到产生不需激发的荧光，即不需激光的化合物。用所述的技术可以产生强信号。
从各种商业途径，包括GENsET很容易买到标记探针，而不必合成。
实施例VI除去磷酸基团细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛肠碱性磷酸酶(CIP)均催化从DNA和RNA除去5’-磷酸残基。因此它们适用于从DNA和/或RNA中除去5’磷酸以防止连接和不适当的杂交。按Sambrook等人(1989)的描述，在切割或剪切基因组DNA后再除去磷酸。
BAP是两种碱性磷酸酶中更有活性的一种，但是对热和去污剂的抗性较强。因此在去磷酸化反应完成后，很难完全抑制BAP。用蛋白酶K消化CIP，为了进行随后的有效连接，必须将其完全除去。另一种方法是在5mMEDTA(pH 8.0)存在的条件下，通过将CIP65℃加热1小时(或75℃，10分钟)使CIP失活然后经酚∶氯仿抽提而纯化去磷酸化的DNA。
实施例VII经两步杂交完成测序下面是描述本发明人完成的测序方法实施的特定实施例。首先，将全部芯片与1亿个bp(一个人的染色体)复杂的DNA混合物杂交。完成杂交的指导可以参见文献例如Drmanac等人(1990)；Khrapko等人(1991)；和Broude等人(1994)。这些文献说明了适用于方式3 SBH开始步骤的杂交温度的范围，缓冲液和洗涤步骤。
由于可以提供相对低浓度的靶DNA，所以本发明人特别考虑在高盐浓度于低温度(-2℃到5℃)下长达数小时的条件以完成杂交。为了达到此目的，用SSC缓冲液代替在10℃沉淀的磷酸钠缓冲液(Drmanac等人，1990)。若用杂交循环进行高度复杂的DNA样品的测序时，由于第二步骤，可以不必彻底洗涤(数分钟)，而且可以完全省去。
用于杂交和洗涤步骤的同一种缓冲液能继续用于与标记探针的二次杂交步骤。用各阵，例如8×8mm阵(实施例III)上的自动装置适当洗涤后，加入一个标记探针，例如6-聚体。使用96-针或96-针装置，在42个操作中完成。还可以使用在以前的科技文献中描述的分辨条件的范围。
本发明人特别使用了下列条件。首先，在低温(0-5℃)加入标记探针并温育数分钟(由于加入了高浓度的寡核苷酸)后，根据F+P的长度，将温度提高到3-10℃，加入洗涤缓冲液。此时，所使用的是与任何连接反应均可相容的缓冲液(例如100mM盐浓度范围)。加入连接酶后，将温度升到15-37℃以加速连接(少于30分钟)，然后再分辨完全匹配和失配的杂交物。
在方式3 SBH中，还使用了Pontius & Berg(1991，引入本文作为参考)描述的阳离子去污剂。这些作者描述了使用两种简单的阳离子去污剂，在DNA变性中的十二烷基和鲸蜡基三甲基胺溴化物(DTAB和CTAB)。
DTAB和CTAB是季胺四甲基胺溴化物(TMAB)的变体，其中甲基之一由一个12-碳(DTAB)或一个16-碳(CTAB)烷基基团所取代。TMAB是四甲基胺离子的溴化盐，用于核酸变性实验以降低熔解温度的G-C含量偏离的试剂。DTAB和CTAB在结构上与十二烷基磺酸钠(SDS)相似，只是带阳电荷的季胺取代了带负电荷的SDS磺酸盐。而在杂交缓冲液中常常使用SDS以减少非特异性结合并抑制核酸酶，它对变性速率没有太大的影响。
在使用连接过程时，可以将酶与标记探针一起加入或在适当的洗涤步骤后加入以降低背景。
尽管以前未考虑到在任何SBH方法中使用，但是，连接酶技术是分子生物学领域熟知的技术。例如，Hood和同事描述了连接酶介导的基因检测技术(Landegren et al.，1988)，很容易将改方法加以改变以适用于方式3 SBH。Landegren等人描述了检测是否存在给定的DNA序列的方法，它是基于两个寡核苷酸在互补靶DNA分子上能够紧邻着退火，然后通过DNA连接酶的作用将两个寡核苷酸共价连接，条件是连接处的核苷酸正确碱基配对的。尽管以前未实现，但是这种方法已用于方式3 SBH。Wu &Wallace还描述了用噬菌体T4 DNA连接酶连接两个相邻的短的合成寡核苷酸。他们的寡核苷酸连接反应是在50mM Tris HclpH7.6，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，5％PEG中完成的，将连接反应物加热到100℃5-10分钟，然后在加入T4 DNA连接酶(1单元，Bethesda Research Laboratory)前冷却到0℃。大多数连接反应是在30℃完成，加热到100℃5分钟而终止。
然后进行适当的最后洗涤以分辨检测杂交的相邻，或连接的寡核苷酸的长度(F+P)。洗涤步骤于40-60℃在水中进行数分钟以洗掉未连接的标记探针和所有其他的化合物以便最大程度地减少背景。由于共价健合标记探针，所以使检测简单化(没有时间和低温的限制)。
根据所用的标记，用不同的装置进行芯片成象。对放射性标记，可以用荧光贮存屏技术和PhosphorImager作为扫描仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)。将芯片放在盒中，用磷光屏盖上。暴露1-4小时后，扫描所述的屏，然后将图象贮存在计算机硬盘中。对于磷光标记检测，使用CCD摄像机和外荧光(epifluorescent)和共焦显微镜。于在CCD摄像机的象素上直接产生芯片，可以按Eggers等人(1994，引入本文作为参考)的描述完成检测。
电荷耦合的装置(CCD)检测仪作为活性固体支持物，定量检测和成象标记靶分子在探针为基础的检测中的分布。这些装置利用了微电子适应高平行检测，超敏检测，高流量，积分数据采集和计算的特性。Eggers等人(1994)描述了在探针为基础的检测，例如本发明的方式3 SBH中CCD的使用，由于高度的敏感性和直接耦合的使用，可以在数秒钟内完成定量估测。
积分CCD检测方法可以检测芯片上的分子结合过程。检测仪迅速产生独特地表征样品的二维图形。在CCD为基础的分子检测仪的具体操作中，不同的生物学探针被直接固定在CCD的象素上或附着于CCD表面一次性的盖片上。样品分子可以用放射性同位素，化学发光剂或荧光标记进行标记。
将样品暴露于CCD为基础的探针阵后，在方式3的情况下，在样品与互补探针结合的象素位置发射出光电子或放射性同位素衰减产物。当带电粒子或来自标记样品的射线入射在CCD网格上时，在硅上产生电子空穴对。然后将电子聚集在相邻的CCD网格下方，随后在显示存储体读出。在各象素上产生的光电子数在所述的接近度内与分子结合数直接成正比。从而定量地确定分子结合(Eggers等人，(1994))。
正如最近报告的，硅为基础的CCD作为固体状态的检测和成象传感器主要是由于所述装置在很宽的波长范围(从1-10000A)内都是高度敏感的。硅对可见光谱到软X-射线的电磁辐射很容易作出反应。对于可见光，一个光电子入射CCD网格会使得一个电荷束聚集在所述网格下。一个软X-射线β粒子(一般KeV到MeV的范围)产生数千到数万个电子。除高灵敏度外，由于可检测电荷束的范围在数个到105电子，所以Eggers等人(1994)描述的CCD有很宽的动态范围(放大4到5倍)。检测反应在很宽的动态范围内呈线性。
通过在样品附近放成象阵，聚集效率比基于透镜技术例如在常规CCD摄像机中所见到的要高至少10倍。即，样品(发射物)与检测仪(成象阵)紧紧接触，省去了常规成象镜片，例如透镜和反光镜。
当放射性同位素作为报告基团连接于靶分子时，就检测到能量粒子。发射不同能量粒子的报告基团已成功地被微加工检测仪所利用，包括32P，33P，35S，14C和125L。粒子的能量越高(例如来自32P)，则提供最高的分子检测灵敏度，而来自的能量越低(例如来自35S)，则分辨率越好。因此，可以按需要选择所选的放射性同位素报告基团。一旦选择了特定的放射性同位素标记，按Eggers等人(1994)所述，通过计算信噪比(SNR)可以预测检测性能。
另一种发光检测方法包括使用连接于靶分子的荧光或化学发光报告基团。荧光标记可以通过共价或相互作用而粘附。由于量子效率在激发波长比在荧光信号波长低数个数量级，因此，在UV附近(300-350nm)有强度吸收带并在可见(500-650nm)有主发射带的荧光染料，例如溴化乙锭最适于CCD装置。
从检测发光的角度看，聚硅CCD网格有内在的能力，可以过滤掉在UV范围的入射光组分，而对由荧光报告基团产生的可见发光仍很敏感。对UV激发的所述内在的大分辨率能够增大SNR(大于100)，达到Eggers等人(1994)在引入的文献中由CCD所达到的程度。
为了在检测仪上固定探针，可以在不昂贵的SiO2片上产生杂交基质，在杂交和干燥后放在CCD表面。由于DNA的杂交是在不昂贵的一次性SiO2片上进行的，因此可以重复使用比较昂贵的CCD检测仪。另外，可以将探针直接固定在CCD上以产生专用的探针基质。
为了将探针固定在SiO2涂层上，利用环氧-硅烷试剂和标准SiO2改性化学将均匀的环氧化物层与膜表面相连。利用与环氧环形成的仲胺，将氨-修饰的寡核苷酸探针通过与环氧环形成二级胺而与SiO2表面相连。所得的键合在寡核苷酸的3’碱基和SiO2表面之间提供了17个可旋转的键。为了在耦合过程中确保完全胺去质子化并且形成最少的二级结构，在0.1M KOH中完成反应，在37℃温育6小时。
总的来说，在方式3中，每各千兆点记录信号。不必在同时杂交所有的阵例如4000个5×5mm，而且可以连续使用较少数量的阵。
循环杂交是一种提高杂交信号的可能的方法。在一个循环中，大多数固定探针将与带有与标记探针不互补的尾序列的DNA序列杂交。通过提高温度，那些杂交物将被融化(图3)。在下一个循环中，它们之中的一部分(-0.1％)将与适宜的DNA片段杂交，连接其他的标记探针。在这种情况下，将会发生分辨熔解同时带有两组探针失配的DNA杂交物。
在循环杂交中，在循环开始前加入所有的组分，在37℃加T4，或在更高的温度加热稳定的连接酶。然后将温度降到15-37℃，并将芯片温育长达10分钟，再将温度升到37℃或更高保持几分钟，然后再降低。可将循环重复高达10次。在一种变体中，可以使用最佳的高温(10-50℃)而不必进行循环，并且可以完成较长的连接反应(1-3小时)。
由于只需要相对较少的寡核苷酸，所以本文所述的方法可以利用标准合成方法和精确的寡核苷酸点制备复杂的芯片。例如，如果合成了所有7-聚体(16384)，则可以确定256百万个14-聚体表。
本发明方法的一种重要变体是每基阵使用一种以上的不同标记探针。这可以考虑到两个目的而被完成；多重通道降低不同杂交阵的数目；或确定甚至更长的寡核苷酸例如3×6或3×7的表。在这种情况下，如果使用两个标记，由于阳性位点必须有两个标记足够的信号，所以3个连续寡核苷酸的特异性几乎是绝对的。
另一种变体是使用含有BxNy探针的芯片，其中y是1-4。这些芯片可以在不同的帧中进行序列阅读。这也可以通过使用适当组数的标记探针来达到或者F和P可能有一些不特定的末端位置(即一些末端简并性元素)。也可以用通用的碱基作为接头的一部分以便使确测序列的探针连接在固体支持物上。这样使得探针更易于杂交而且使得构建体更稳定。如果探针有5个碱基，人们可以例如使用3个广义碱基作为接头(图4)。
实施例VIII分析所得的数据通过图像分析程序，象DOTS程序(Drmanac et al.，1993)分析图像存储数据，然后通过例如在SCORES程序(Drmanac etal.，1994)中所包括的统计功能换算并评估。从信号的分布，确定将信号转化成+/-输出的最佳阈值。
从所检测的标记位置，通过组合对应于标记位置的固定和标记探针的已知序列确定片段的F+P核苷酸序列。然后从通过计算推测而确定的重叠的F+P序列组装完整核酸序列或源分子，例如人染色体的序列。
一个选择是在序列组装过程中将杂交信号例如记数转化成+/-输出。在这种情况下，组装将从有很高记数的F+P序列，例如，F+P序列AAAAAATTTTTT(SEQ ID NO1)开始。比较所有四种可能的重叠探针AAAAATTTTTTA(SEQ IDNO3)，AAAAATTTTTTT(SEQ ID NO4)，AAAAATTTTTTC(SEQ ID NO5)，和AAAAATTTTTTG(SEQ ID NO6)和三个在开始不同的其它三种探针(TAAAAATTTTTT，SEQ ID NO7；CAAAAATTTTTT，SEQ ID NO8；GAAAAATTTTTT，SEQ ID NO9)，得出三个结论(i)只有开始的探针和四个重叠探针中的一个具有相对于其它6个探针来说明显阳性的记数，在这种情况下，将AAAAAATTTTTT(SEQ ID NO1)序列向右延伸一个核苷酸；(ii)除起始探针外没有一个探针有明显阳性记数，在这种情况下，将停止组装，例如AAAAAATTTTTT(SEQ ID NO10)序列在待测序之DNA分子的末端；(iii)在重叠的和/或其它三种探针中发现了不止一个明显阳性的探针；由于错误或分支，将停止组装(Drmanac et al.，1994)。
计算推导过程将利用现存算法的计算机程序(参见例如Pevzner，1989；Drmanac et al.，1991；Labat和Drmanac，1993；所述文献引入本文作为参考)。
如果，除F+P外，还确定F(空1)P，F(空2)P，F(空3)P，或F(空4)P，将使用算法使所有的数据设置相符以改正潜在错误或处理有分支问题的情况(参见例如，Drmanac et al.，1989；Brain.，1988；所述文献均引入本文作为参考)。
实施例IX重复使用测序芯片在测序过程中使用连接时，其后不能立刻再使用常规的寡核苷酸芯片。本发明人用各种方法使其得到克服。
人们可以使用作为第二探针的核糖核苷酸，探针P，以便随后用RNAase处理除去该探针。RNAase处理可以使用RNAase A，一个内切核糖核酸酶，它特异性攻击单链RNA 3’的嘧啶残基并裂解相邻核苷酸的磷酸键。终产物是嘧啶3’磷酸和带有末端3’磷酸的寡核苷酸。RNAase A在不存在辅助因子和二价阳离子的情况下发挥作用。
为了使用RNAase，人们通常在含有适当RNAase的缓冲液中温育芯片，如Sambrook等人所述(1989；引入本文作为参考)。在10到60分钟之间于37℃每8×8mm或9×9mm阵使用30-50μl的含有RNAase的缓冲液是适当的。
尽管没有广泛的使用，在具体的实施方案中也可以使用尿嘧啶碱基，如Craig等人(1989)所述，所述文献引入本文作为参考。通过用大肠杆菌修复酶，从DNA中除去尿嘧啶的尿嘧啶-DNA糖基化酶(glycosylase)消化可以破坏连接的探针组合以得到可重复使用的芯片。
人们也可以在探针间产生特异性的可裂解的键，然后在检测后将其裂解。例如，通过Shabarova等人(1991)和Dolinnaya等人(1988)所述的化学连接可以达到此目的(所述的两篇文献均引入本文作为参考)Shabarova等人(1991)描述了用溴化氰作为缩合剂缩合寡脱氧核糖核苷酸。在其中的一步化学连接反应中，将寡核苷酸加热到97℃，缓慢冷却到0℃，然后加入1μl在乙腈中的10MBrCN。
Dolinnaya等人(1988)说明了如何将亚磷酰胺和焦磷酸核苷酸间键加入DNA双螺旋中。他们还用水溶性碳化二亚胺(CDI)作为偶合剂，使用化学连接方法修饰DNA的糖磷酸骨架。亚磷酰胺键的选择性裂解包括在95℃与15％CH3COOH接触5分钟。焦磷酸键的选择性裂解包括与吡啶-水混合物(9∶1)和新鲜蒸馏的(CF3CO)2O接触。
尽管已用优选的实施方案描述了本发明的组成和方法，但是，对于本文所述组合物，方法和所述方法的步骤或所述方法步骤的顺序，对于本领域专业人员来说显而易见在不偏离本发明概念，精神和范围的前题下进行改变。更特别地，显而易见可用化学上和生理上均相关的某试剂取代这里描述的试剂，而仍可得到相同或相似的结果。对于本领域专业人员显而易见的所有这些相似取代物和修饰相信是在所附权利要求所限定的本发明的精神，范围和概念内。可以制备和完成所有权利要求的物质和方法，而不需要过分的试验。
参考文献以下参考能够为上述内容提供举证性程序或补充性细节，特在此引入作为参考。Bains et al.，1988，J.Theor.Biol.，135303-307.Broude et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，913072-3076.Brumbaugh et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855610-5614.Cantor et al.，1992，Genomics，13，1378.Cate et al.，1991，GATA，8(3)102-106.Chu et al.，1983，Nucleic Acids Res.，116513-6529.Craig et al.，1989，Nucleic Acids Research，17(12)4605.Dahlen et al.，1987，Mol.Cell.Probes 1159-168.Dolinnaya et al.，1988，Nucleic Acids Research，16(9)3721-3738.Drmanac & Crkvenjakov，1990，Scientia Yugoslavica，16，97.Drmanac & Crkvenjakov，U.S.Patent 5,202,231.Drmanac et al.，1989，Genomics，4114-128.Drmanac et al.，1991，J.Biomol.Struct.& Dyn.，81085.Drmanac et al.，1991，In ″Electrophoreses，Supercomputersand the Human Genome″，pp 47-59，World ScientificPublishing Co.，Singapore.Drmanac et al.，1993，Proceedings of 2nd InternationalConference on Bioinformatics，Supercomputing，andComplex Genome Analysis，World Scientific PublishingCo.，pp.121-134.Drmanac，1994，Abstract Book for Genome Mapping andSequencing；arranged by Richard Myers，DavidPorteous and Robert Waterstone，Cold Spring HarborLaboratories，p.60.Drmanac et al.，1994，Proceedings of the 3rdInternational Workshop of Transcribed Sequences，InPress.Duncan & Cavalier，1988，Analytical Biochemistry，169104-108.Eggers et al.，1994，BioTechniques，17(3)516-524.Fitzgerald et al.，1992，Nucleic Acids Research，20(14)3753-62.Fodor et al.，1991，Science，251767-768.Hoheisel & Lehrach，1990，FEBS Lett.，274(1，2)103-106.Inouye & Hondo，1990，J.Clin.Microb.，281469-1472.Jacobsen et al.，1990，Genomics，8001-007.Keller et al.，1988，Anal.Biochem.，170441-450.Keller et al.，1989，Anal.Biochem.，17727-32.Khrapko et al.，1991，J.DNA Sequencing Mapping，1，375.Labat and Drmanac，1993，Proceedings of 2nd InternationalConference on Bioinformations，Supercomputing，andComplex Genome Analysis，World Scientific PublishingCo.，pp.555-565.Landegren et al.1988，Science，2411077-1080.Maxam & Gilbert，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，560.Morriey & Collins，1989，Mol.Cell.Probes 3189-207.Murakami et al.，1991，Nucleic Acids Research，19(15)4097-4102.Nagata et al.，1985，FEBS Letters，183379-382.Nichols et al.，1994，Nature，369492.Pease et al.，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.，915022-5026.Peterkin et al.，1987，BioTechniques 5(2)132-134.peterkin et al.，1989，Food Microbiology 5(2)281-284.Pontius & Berg，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，888237-8241.Rasmussen et al.，1991，Analytical Biochemistry，198138-142.Sambrook et al.，1989，Molecular cloningA laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory.Cold SpringHarbor，NY.Sanger，et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5463.Schriefer et al.，1990，Nucleic Acids Research，18(24)7455.Schubert et al.，1990，Nucleic Acids Research，18(11)3427.Shabarova et al.，1991，Nucleic Acids Research，19(15)4247-4251.Sharp et al.，1989 Food Microbiology，6261-265.Southern，PCT patent Application WO 89/10977.Southern & Maskos，PCT Patent Application WO 90/03382.Southern et al.，1992，Genomics，13，1008.Strezoska et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.，88，10089.Van Ness et al.，1991，Nucleic Acics Research，19(12)3345.Wu & Wallace，1989 Gene，76245-254.Zeremski and Crkvenjakow，1993，DNA SequenceDetermination by Hybridizationa Strategy forEfficient Large-Scale Sequencing，Science，2601649-1652.
序列表(1)一般资料(I)申请人名称ARCH DEVELOPMENT CORPORATION街道1101 East 58th Street城市Chincago州Illinois国家United States of America邮政编码60637电话(312)702-1692电传(312)702-0741(ii)发明人Drmanac，Radoje(iii)发明题目进行有效核酸测序的方法和组合物(iv)序列数10(v)相关地址(A)收件人Arnold，White & Durkee(B)街道P.O.Box 4433(C)城市Houston(D)州TX(E)国家USA(F)邮政编码77210-4433(vi)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS
(D)软件PatentIn Release #1.0，Ver.#1.25(vii)现有申请资料(A)申请号FILING HEREWITH(B)申请日申请时附上(C)分类(viii)先前申请资料(A)申请号USSN 08/303,058(B)申请日9月8日1994(08.09.94)(C)分类未知(A)申请号USSN 08/127,420(B)申请日9月27日1994(27.09.94)(C)分类未知(ix)代理人/代理资料(A)姓名Parker，David L.
(B)登记号32,165(C)参考/摘要号ARCD146P--\PAR(x)通讯资料(A)电话(512)418-3000(B)电传(512)474-7577(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性
(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1AAAAATTTT TT 12(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度13base pairs(B)类型nucleic acid(C)链型single(D)拓扑结构Linear(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AAAAAATTTT TTC13(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度12base pairs(B)类型nucleic acid(C)链型single(D)拓扑结构linear(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO 3AAAAATTTTT TA12(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单连(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4AAAAATTTTT TT12(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5AAAAATTTTT TC12(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6AAAAATTTTT TG12(2)SEQ ID NO7的资料
(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(Xi)序列描述SEQ ID NO7TAAAAATTTT TT12(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8CAAAAATTTT TT12(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO9GAAAAATTTT TT12(2)SEQ ID NO10的资料(I)序列特征(A)长度12个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9AAAAAATTTT T 1权利要求
1.确定核酸分子序列的方法，包括步骤(a) 通过将所述分子与两组已知序列的小寡核苷酸探针的互补序列杂交来鉴定来自所述分子的序列，其中第一组探针附着于固体支持物，第二组探针是溶液中的标记探针；(b) 从步骤(a)中鉴定的序列鉴定所述序列的重叠伸展范围；和(c) 从鉴定的所述重叠序列组装所述分子的核酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述杂交循环完成。
3.确定核酸分子序列的方法，包括步骤(a) 将待测序的核酸分子制成片段以得到中等长度的核酸片段；(b) 通过将所述片段与两组已知序列的小寡核苷酸探针的互补序列杂交来鉴定来自所述片段的序列，其中第一组探针附着于固体支持物，第二组探针是溶液中的标记探针；(c) 从步骤(b)中鉴定的序列鉴定所述序列的重叠伸展范围；和(d) 从鉴定的所述重叠序列组装所述分子的核酸序列。
4.权利要求3的方法，其中所述片段相继与两组已知序列的小寡核苷酸探针的互补序列杂交。
5.权利要求3的方法，其中所述片段同时与两组已知序列的小寡核苷酸探针的互补序列杂交。
6.权利要求3的方法，其中所述中等长度的核酸片段长度为约10个核苷酸到约40个核苷酸之间，所述小寡核苷酸探针长度为约4个核苷酸到约9个核苷酸长。
7.权利要求3的方法，其中所述寡核苷酸探针与来自所述片段的完全互补序列杂交。
8.权利要求3的方法，其中所述寡核苷酸探针与来自所述片段的紧邻的序列杂交。
9.权利要求8的方法，其中所述寡核苷酸探针与来自所述片段的完全互补和紧邻的序列杂交。
10.权利要求8的方法，其中将所述紧邻的寡核苷酸探针随后连接起来。
11.权利要求3的方法，其中步骤(b)包括步骤(a) 在奏效的只让具有完全互补序列的那些片段与探针杂交的杂交条件下，将所述的第一组附着寡核苷酸探针与所述中等长度的核酸片段接触，由此形成一级复合物，复合物中所述片段有杂交的和游离的序列；(b) 在奏效的只让具有完全互补序列的那些探针与游离的片段序列杂交的杂交条件下，将所述的一级复合物与所述第二组寡核苷酸探针接触，由此形成二级复合物，复合物中所述片段与附着和标记探针杂交；(c) 从所述二级复合物中除去未与附着探针紧邻的标记探针，由此只剩下相邻的二级复合物；(d) 通过检测标记存在而检测所述相邻的二级复合物；和(e) 通过连接杂交的附着和标记探针的已知序列而鉴定在所述相邻二级复合物中的所述核酸片段的序列。
12.核酸测序的方法，包括步骤(a) 将待测序的核酸制成片段以得到长度为T的核酸片段；(b) 制备已知序列且长度为F的固定寡核苷酸探针阵和一组在溶液中已知序列的长度为P的标记寡核苷酸探针，其中F+P≤T；(c) 在奏效的只让带有杂交的长度为F的完全互补序列和未杂交的长度为T-F的片段序列的一级复合物形成的杂交条件下，将固定寡核苷酸探针阵与所述的核酸片段接触；(d) 在奏效的只让带有杂交的长度为F的完全互补序列和紧邻杂交的长度为P的完全互补序列的二级复合物形成的杂交条件下，将所述的复合物与所述的标记寡核苷酸探针组接触；(e) 通过检测标记存在而检测所述二级复合物；(f) 通过组合杂交的固定和标记探针的已知序列，从所述二级复合物的核酸片段中鉴定长度为F+P的序列；(g) 鉴定重叠的长度为F+P的所述序列的伸展范围；和(h) 从所述的重叠序列组装完整的核酸序列。
13.权利要求12的方法，其中长度T比长度F长约3倍。
14.权利要求12的方法，其中长度T为约10个核苷酸到约40个核苷酸之间，长度F为约4个核苷酸到约9个核苷酸之间，长度P在约4个核苷酸到约9个核苷酸之间。
15.权利要求14的方法，其中长度T为约20个核苷酸，长度F为约6个核苷酸和长度P为约6个核苷酸。
16.权利要求12的方法，其中将所述紧邻的固定和标记寡核苷酸探针连接起来。
17.核酸测序的方法，包括步骤(a) 将待测序的核酸制成片段以得到中等长度的核酸片段；(b) 在奏效的只让具有完全互补序列的那些片段与探针杂交的杂交条件下，将已知序列的固定小寡核苷酸探针阵与所述核苷酸片段接触，由此形成一级复合物，复合物中所述片段含有杂交的和未杂交的序列；(c) 在奏效的只让具有完全互补序列的那些探针与未杂交片段序列杂交的杂交条件下，将所述的一级复合物与一组溶液中的标记小寡核苷酸探针接触，由此形成二级复合物，其中所述片段与固定探针和标记探针杂交；(d) 从所述二级复合物中除去未与固定探针紧邻的标记探针，由此只剩下相邻二级复合物；(e) 通过检测标记存在而检测所述相邻二级复合物；(f) 通过组合杂交的固定和标记探针的已知序列，从所述相邻二级复合物的核酸片段鉴测序列；(g) 确定重叠的所述序列的伸展范围；和(h) 从鉴定的所述重叠序列组装完整的核酸序列。
18.权利要求17的方法，其中所述的核酸是克隆的DNA或染色体DNA。
19.权利要求17的方法，其中所述的核酸是mRNA。
20.权利要求17的方法，其中通过限制酶消化，超声处理，NaOH处理或低压剪切而将所述的核酸制成片段。
21.权利要求17的方法，其中所述核酸片段长度为约10核苷酸至约100个核苷酸之间。
22.权利要求17的方法，其中所述的寡核苷酸探针长度为约4个核苷酸到约9个核苷酸之间。
23.权利要求22的方法，其中所述的寡核苷酸长度为约6个核苷酸。
24.权利要求17的方法，其中所述的固定寡核苷酸附着于玻璃，聚苯乙烯或特富龙固体支持物。
25.权利要求17的方法，其中所述的固定寡核苷酸经磷酸二酯键附着于固体支持物。
26.权利要求17的方法，其中所述固定寡核苷酸经光激活的合成机制附着于固体支持物。
27.权利要求17的方法，其中所述标记探针用非放射性同位素或荧光染料标记。
28.权利要求17的方法，其中所述标记寡核苷酸探针用35S，32P，或33P标记。
29.权利要求17的方法，其中所述核酸片段或所述寡核苷酸探针之一含有修饰的碱基或广义碱基。
30.权利要求17的方法，其中通过严紧的洗涤条件从二级复合物中除去未与固定探针紧邻的标记探针。
31.权利要求17的方法，其中将与固定探针紧邻的标记探针与所述固定探针连接，随后通过洗涤除去未连接的标记探针。
32.权利要求31的方法，其中所述相邻探针经酶促连接。
33.权利要求17的方法，其中多个固定寡核苷酸阵以测序芯片的方式排列。
34.核酸测序的方法，包括步骤(a) 将待测核酸制成片段，以得到长度为约10个核苷酸到40个核苷酸的核酸片段；(b) 在奏效的只让具有完全互补序列的那些片段与探针杂交的杂交条件下，将已知序列的长度为约4核苷酸至约9个核苷酸固定寡核苷酸探针阵与所述核酸片段接触，由此形成一级复合物，复合物中所述片段含有杂交的和未杂交的序列；(c) 在奏效的只让具有完全互补序列的那些探针与未杂交的片段序列杂交的杂交条件下，将所述的复合物与一组32P-标记或33P-标记已知序列的长度为约4核苷酸至约9个核苷酸寡核苷酸探针接触，由此形成二级复合物，二级复合物中所述片段与固定探针和32P-标记或33P-标记探针杂交；(d)用DNA连接酶将紧邻的固定探针和标记探针连接在一起，由此形成连接的二级复合物；(e) 从二级复合物中除去任何未连接的标记探针；(f) 通过检测32P或33P标记存在而检测所述连接的二级复合物；(g) 通过组合连接探针的已知序列而鉴定在所述连接的二级复合物中的核酸片段的序列；(h) 确定重叠的所述序列伸展范围；和(i) 从所述重叠序列组装完整的核酸序列。
35.用于核酸测序的试剂盒，含有具有附着已知序列的寡核苷酸探针之排列的固体支持物芯片，所述寡核苷酸能够参与杂交反应，和一组包含已知序列的标记寡核苷酸探针溶液的容器。
36.权利要求35的试剂盒，其中所述多个固定寡核苷酸探针芯片以测序阵的形式排列。
37.权利要求35的试剂盒，其中所述寡核苷酸长度为约4个核苷酸到约9个核苷酸之间。
38.权利要求37的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针长度为约6个寡核苷酸。
39.权利要求35的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针附着于玻璃，聚苯乙烯或特富龙固体支持物。
40.权利要求35的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针经磷酸二酯键附着于固体支持物。
41.权利要求35的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针经光激活的合成机制附着于固体支持物。
42.权利要求35的试剂盒，其中所述标记寡核苷酸探针用非放射性同位素或荧光染料标记。
43.权利要求35的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针之一含有修饰的或通用的碱基。
44.权利要求35的试剂盒，其中所述标记寡核苷酸探针用35S，32P，或33P标记。
45.权利要求35的试剂盒，还含有连接试剂。
46.权利要求45的试剂盒，其中连接试剂是DNA连接酶。
全文摘要
公开了以与两组已知序列的小寡核苷酸探针杂交为基础的快速高效地进行核酸测序的新方法和组合物。也可以对极大的核酸分子，包括染色体和非扩增的RNA进行测序而预先不必进行克隆或亚克隆。本发明还解决了目前与测序技术有关的各种问题，例如，高噪信比和分辨，表面附着许多核酸片段，制备许多更长或更复杂的探针以及要标记更多的种类。
文档编号C12Q1/68GK1136330SQ94194301
公开日1996年11月20日 申请日期1994年9月27日 优先权日1993年9月27日
发明者R·德曼阿克 申请人:阿奇发展公司