通过定相合成来进行核酸测序的系统和方法

专利名称：通过定相合成来进行核酸测序的系统和方法
通过定相合成来进行核酸测序的系统和方法
背景技术：
2003年完成的揭示人DNA的所有30亿个碱基的序列的“人类基因组”计划已经在 医学诊断学、预后学、治疗学等方面实现大量应用。这些中许多依赖于对个体的部分或整个 基因组再测序，这对可靠的、快速的且负担得起的DNA测序技术产生需要。致力于解决此需要，在过去几年中已经开发出数种不同技术，而且新生代的测序 系统已经出现。所有这些新系统分组在下一代测序称号下以区分它们与直至“人类基因组” 计划(1990-200 时及之内使用的第一代技术。这些下一代测序办法中最先进的采用固体表面(例如芯片、珠、纳米孔等)进行测 序反应。此类表面实现较低的试剂体积、较高的多路驱动(multiplexing)、较高的准确度和 可重复性及较简单的方案，它们对于满足下一代测序的严格要求都是至关重要的。仍迫切需要用于下一代测序的改进系统。理想的系统会提供升高的灵敏度、消除 或减少清洗步骤及简化与微射流技术的整合。本发明满足此需要，而且提供相关优点。发明概述—般而言，一方面，提供了一种用于对核酸测序的扫描传感器系统。该系统包括基 片(例如如

图1中所显示的)，其包含多个基本上平行的激发波导和多个基本上平行的收集 波导，所述激发波导和收集波导交叉以形成相交区的二维阵列，在那里激发波导和收集波 导交叉并以每个交叉处的所述相交区提供光学通信；多个光学感测位点，其安排得与所述 相交区光学通信；一个或多个可变换光源，其与所述基片的激发波导偶联且光学通信，并包 含扫描光源输入和光切割光源输入；光色散模块，其与所述基片的收集波导偶联且光学通 信，并包括元件的阵列；检测仪，其与所述光色散模块偶联且光学通信。在一个实施方案中，所述扫描光源与第一可变换光源偶联，所述第一可变换光源 在基片的第一侧与激发波导偶联且光学通信，而光切割光源与第二可变换光源偶联，所述 第二可变换光源在基片的第二侧与激发波导偶联且光学通信。一般而言，在又一个方面，一种用于对核酸测序的扫描传感器系统包括基片，其包 含多个基本上平行的激发波导和多个基本上平行的收集波导，所述激发波导和收集波导交 叉以形成相交区的二维阵列，在那里激发波导和收集波导交叉并以每个交叉处的所述相交 区提供光学通信；多个光学感测位点，其安排得与所述相交区光学通信；可变换光源，其与 激发波导光学通信，并包含扫描光源输入；光切割光源和光投递系统，其安排在所述基片外 部(例如如图2C中所显示的)；光色散模块，其与所述基片的收集波导偶联且光学通信，并 包括元件的阵列；检测仪，其与所述光色散模块偶联且光学通信。所述光投递系统可以包括光切割光源输入。可以配置所述色散模块以将光从一个或多个所述收集波导分散至所述检测仪中 的多个元件。在一个实施方案中，配置所述色散模块以将光从给定的收集波导分散至所述 检测仪中的四个或更多个元件。在一个具体的实施方案中，所述色散模块将光分散至检测 仪中的四个元件。在一个不同的实施方案中，所述色散模块将光分散至检测仪中的五个或 更多个元件。
自所述色散模块分散的光可以包含多种光波长。在一个实施方案中，所述多种波 长包括四种或更多种光波长。在另一个实施方案中，所述多种波长包括五种或更多种波长。所述光切割光源可以发射具有范围为400nm和2000nm之间的波长的光。所述光切 割光源输入可以与紫外光源偶联。在一个实施方案中，所述紫外光源发射具有范围为IOOnm 和400nm之间的波长的光。一般而言，在一方面，提供了一种通过检测在增长中的核酸链的3’端掺入的荧光 核苷酸类似物的身份来对核酸测序的方法。该方法包括下列步骤(a)将多个包含模板核 酸、配置成与所述模板杂交的引物和聚合酶的复合物固定化于基片的多个光学感测位点， 其中所述基片是基于波导的光学扫描系统的一部分；(b)使用聚合酶延伸反应用所述聚合 酶和一种或多种荧光核苷酸类似物将所述引物延伸单个核苷酸，其中每种类型的荧光核苷 酸类似物包含任选地配置成抑制进一步的引物延伸的独特荧光标签和/或3’端的封闭剂， 且其中所述荧光核苷酸类似物的掺入可逆地终止所述聚合酶延伸反应；(c)通过使用所述 光学扫描系统来光学扫描所述基片以检测所述荧光核苷酸类似物的独特标签，从而鉴定通 过所述聚合酶反应掺入的所述荧光核苷酸类似物；(d)记录所述基片的光学扫描结果；(e) 通过向所述基片的一个或多个所述光学感测位点提供光切割脉冲光来切割所述荧光标签 或所述封闭剂，从而逆转所述聚合酶延伸反应的终止；并(f)重复步骤(b)到(e)。在一个实施方案中，在所述多个复合物形成和固定化前将所述引物固定化于所述 多个光学感测位点。在一个具体的实施方案中，将所述引物共价固定化于所述光学感测位 点。在另一个实施方案中，使用所述光学感测位点处的光可切割接头来将所述引物固定化。在一个实施方案中，在所述多个复合物形成和固定化前将所述聚合酶固定化于所 述多个光学感测位点。在一个具体的实施方案中，在固定化所述多个复合物前将所述聚合 酶共价固定化于所述光学感测位点。在所述方法的一个实施方案中，在步骤(C)前进行步骤(b)，步骤(b)和(C)之间 没有清洗步骤。在所述方法的另一个实施方案中，步骤(f)进一步包括在重复步骤(b)前 进行步骤(e)，步骤(e)和(b)之间没有清洗步骤。所测序的核酸可以是DNA。在一个实施方案中，在所述多个复合物形成和固定化前使用所述光学感测位点处 的光可切割接头来将所述引物固定化并将所述聚合酶共价固定化于所述光学感测位点。在 一个相关的实施方案中，在步骤(b)前，形成固定化的引物和模板双链体，并提供光切割脉 冲光以切割所述光可切割接头并释放所述双链体，其中所释放的双链体随后结合所述固定 化的聚合酶并形成固定化的多个复合物。所述荧光核苷酸类似物可以包括四种不同dNTP，其中每种dNTP是用不同荧光标 签标记的。在一个具体的实施方案中，所述荧光标签是经由光可切割的化学键来附着至所 述dNTP的。一般而言，在另一方面，提供了一种对单一核酸分子测序的方法，其通过在将荧光 核苷酸类似物掺入增长中的核酸链中后检测所述核苷酸类似物的身份来进行。该方法包括 下列步骤(a)将包含模板核酸、配置成与所述模板杂交的引物和聚合酶的复合物固定化 于基片的光学感测位点，其中所述基片是基于波导的光学扫描系统的一部分；(b)使用聚 合酶延伸反应用所述聚合酶和一种或多种荧光核苷酸类似物将所述引物延伸单个核苷酸，其中每种荧光核苷酸类似物包含任选地配置成抑制进一步的引物延伸的荧光标签和/或 在所述核苷酸类似物3’端的封闭剂，且其中所述荧光核苷酸类似物的掺入终止所述聚合酶 延伸反应；(C)通过使用所述光学扫描系统来光学扫描所述基片以检测附着至所述荧光核 苷酸类似物的独特标签，从而鉴定通过所述聚合酶反应掺入的所述荧光核苷酸类似物；(d) 记录所述基片的光学扫描结果；(e)向所述基片的一个或多个所述光学感测位点提供光切 割脉冲光来切割所述荧光标签或所述封闭剂；并(f)重复步骤(b)到(e)。可以在所述复合物形成和固定化前将所述引物固定化于所述多个光学感测位点。 在一个具体的实施方案中，将所述引物共价固定化于所述光学感测位点。在另一个实施方 案中，使用所述光学感测位点处的光可切割接头来将所述引物固定化。可以在所述复合物形成和固定化前将所述聚合酶固定化于所述多个光学感测位 点。在一个实施方案中，在固定化所述复合物前将所述聚合酶共价固定化于所述光学感测 位点。在所述方法的一个实施方案中，在步骤(C)前进行步骤(b)，步骤(b)和(C)之间 没有清洗步骤。在所述方法的另一个实施方案中，步骤(f)进一步包括在重复步骤(b)前 进行步骤(e)，步骤(e)和(b)之间没有清洗步骤。所测序的核酸可以是DNA。在所述方法的一个具体的实施方案中，在所述复合物形成和固定化前使用光可切 割的接头来将所述引物固定化于所述光学感测位点并将所述聚合酶共价固定化于所述光 学感测位点。在一个实施方案中，在步骤(b)前，形成固定化的引物和模板双链体，并提供 光切割脉冲光以切割所述光可切割的接头并释放所述双链体，其中所释放的双链体随后结 合所述固定化的聚合酶并形成固定化的复合物。所述荧光核苷酸类似物可以包括四种不同dNTP，其中每种是用不同荧光标签标记 的。在一个实施方案中，所述荧光标签是经由光可切割的化学键来附着至所述dNTP的。通过提及而收录本文通过提及而收录本说明书中所提及的所有出版物、专利、和专利申请，其程度 就像明确且单独指明通过提及而收录每篇单独的出版物、专利、或专利申请一样。附图简述本发明的新特征在所附权利要求书中详细列出。本发明的特征和优点的更好理解 会通过参照列出利用本发明原则的例示性实施方案的以下详细描述及其附图来获得图1是依照本发明一个实施方案的扫描感测系统(scanning sensing system) 的示意图，所述扫描感测系统包含可变换光源(switchable light source)、基片 (substrate)、光学感测位点(optical sensing site)、色散模块(dispersive module)禾口 检测仪(detector)阵歹Ij (array)。图2A是依照本发明另一个实施方案的扫描感测系统的示意图，所述扫描感测系 统包含可变换光源、基片、光学感测位点、色散模块和检测仪阵列，其中所述可变换光源包 括光学开关(optical switch)、扫描光源输入(scanninglight source input)和光切割光 源输入(photo-cleaving light source input) 图2B是依照本发明另一个实施方案的扫描感测系统的示意图，所述扫描感测系 统包含两个可变换光源、基片、光学感测位点、色散模块和检测仪阵列，其中一个可变换光源包含光学开关和扫描光源输入，而另一个可变换光源包含光学开关和光切割光源输入。图2C是依照本发明一个实施方案的扫描感测系统的示意图，所述扫描感测系统 包含可变换光源、基片、光学感测位点、色散模块、检测仪阵列、光切割光源输入和光切割光 投递系统(photo-cleaving light delivery system)，其中所述可变换光源包含光学开关 和扫描光源输入。图3A是依照另一个实施方案的本发明基片的示意图，所述基片包含连同光学感 测位点和遮栏(barrier)的激发和收集光学波导(excitation and collectionoptical waveguides)。图;3B是图3A中所显示的本发明实施方案的基片的透视图，所述基片包含连同光 学感测位点的激发和收集光学波导。图3C是图3A和图;3B中所显示的基片的两种横断面视图(AA和BB)的示意图。图3D是与传热元件(thermal transfer element)有关的本发明一个实施方案的 基片的侧视图的示意图。图3E是本发明基片的一个实施方案的示意图，其显示了包含加热器(heater)和 热敏电阻(thermistor的光学感测位点的详情。图3F是本发明基片的一个实施方案的示意图，所述基片包括与光学感测位点有 关的贮液器(reservoir)和微通道(micro channel)。图4A是本发明基片的示意图，所述基片包含连同光学感测位点、遮栏和漏斗 (funnel)的激发和收集光学波导。图4B是显示依照一个实施方案的基片特征的放大视图的示意图。图4C是依照一个实施方案的基片的横断面视图的示意图。图5A是本发明基片的一个实施方案的示意图，所述基片包含连同光学感测位点、 遮栏和分支(branch)的激发和收集光学波导。图5B是显示依照如图5A中所显示的一个实施方案的基片特征的放大视图的示意 图。图5C是依照一个实施方案的基片的平面(AA)中的横断面视图的示意图。图5D是依照一个实施方案的基片的平面(BB)中的横断面视图的示意图。图6A是通用基片的示意图，所述通用基片包含代表本发明的那些层和波导的典 型的层和波导。图6B是代表本发明的那些波导的波导和硅土层的显微照片图像。图6C是波导和相关基片层的透视视图。图7A是本发明可变换光源的示意图，所述可变换光源包含输入和输出。图7B是本发明可变换光源的输入和输出之间的分支结构的示意图。图7C是本发明可变换光源的另一个实施方案的示意图，所述可变换光源包含光 发生器(light generator)和波导。图8A是通过依照本发明一个实施方案的定相合成(phased synthesis)进行核 酸测序的例示，所述定相合成包括具有在波导的感测位点处的固定化的引物、DNA双链体和 DNA双链体+聚合酶复合物的基片。图8B是通过依照本发明另一个实施方案的定相合成进行核酸测序的例示，所述定相合成包括具有在波导的感测位点处的固定化的聚合酶、DNA双链体和聚合酶+DNA双链 体复合物的基片。图8C是通过依照本发明另一个实施方案的定相合成进行核酸测序的例示，所述 定相合成包括具有在波导的感测位点处的固定化的聚合酶和固定化的引物、DNA双链体和 光切割固定化的引物后的聚合酶+DNA双链体复合物的基片。图9是显示通过本发明的定相合成方法进行测序的一个实施方案的流程图。图IOA-图IOD是显示用于本发明基片和波导的代表性制备方法的示意图。图11是显示用于基片的代表性制备方法的流程图。图12是显示与下述装置通信的代表性例子逻辑器件(logic device)的框图，所 述装置与本发明的扫描感测系统一起使用。图13是显示试剂盒的代表性例子的框图。发明详述本发明提供了一种用于对核酸(DNA、RNA等)测序的新方法，其中在含有包埋波导 的微阵列芯片的表面上进行固相测序反应，所述包埋波导能够指引光至反应位点并从反应 位点指引光。基于波导的感测的一项优点是该技术固有的表面选择性。感测仅发生在离波 导的边界数十纳米内的反应同时避免大量(bulk)显著地降低检测噪音，而且实现较少的 或无清洗步骤。本发明还简化与微射流投递技术的整合，其能使用芯片的上部表面而不干 扰询问系统。核酸可以是脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其单链或 双链形式的聚合物。除非明确限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其 与参照核酸具有相似的结合特性，而且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有 明确限制，该术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似 物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另有指明，特定的核酸序列还暗示地涵盖其保守修 饰变体(包括但不限于简并密码子替代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，通过 生成其中用混合的碱基和/或脱氧肌苷残基替代一个或多个选定的(或所有)密码子的 第三位的序列来实现简并的密码子替代(Batzer等，Nucleic AcidRes. 19 :5081(1991)； Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985)；及 Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 91-98(1994))。本文中的多态性是群体中存在两种或更多种遗传决定的备选序列或等位基因。多 态性标志物或位点是发生趋异的基因座。优选的标志物具有至少两种等位基因，每种以选 定群体的大于1%，且更优选地大于10%或20%的频率存在。多态性可以包含一处或多处 碱基变化、插入、重复、或删除。多态性基因座可以小到一个碱基对。多态性标志物包括限 制性片段长度多态性、可变数目串联重复(VNTR)、高变区、小卫星、二核苷酸重复、三核苷酸 重复、四核苷酸重复、简单序列重复、和插入元件诸如Alu。首先鉴定的等位形式任意地称为 参照形式，而其它等位形式称为备选或变体等位基因。在选定群体中最频繁存在的等位形 式有时称为野生型形式。二倍体生物体在等位形式方面可以是纯合的或杂合的。双等位多 态性具有两种形式。三等位多态性具有三种形式。单核苷酸多态性(SNP)在作为等位序列间的变异位点的由单核苷酸占据的多态 性位点处发生。该位点通常前后有等位基因的高度保守序列(例如在占群体的小于1/100或1/1000的成员中有所变化的序列)。单核苷酸多态性通常由于多态性位点处用一种核苷酸替换另一种而引起。 转换(transition)是一种嘌呤被另一种嘌呤或一种嘧啶被另一种嘧啶替换。颠换 (transversion)是嘌呤被嘧啶替换或者反之亦然。单核苷酸多态性也可以源自相对于参照 等位基因的一个核苷酸的删除或一个核苷酸的插入。在本文中，个体不限于人类，而且还可以包括其它生物体，包括但不限于哺乳动 物、植物、细菌或自任何上述项衍生的细胞。本发明的各方面可以包括下列一项或多项有利特征。可以使用平面光波回路技术 来实现光学操作元件的密集且精确的整合。关于如本文中所描述的平面光波回路的应用包 括可用于针对如下应用的核酸序列分析，所述应用包括但不限于疾病研究、生物标志发现、 SNP关联研究(包括毒理学和疾病易感性)、和诊断学(包括鉴定易感疾病的患者和鉴定具 有特定药物敏感性的患者)。光学扫描系统本文中所公开的光学扫描感测系统涉及那些记载于2007年3月8日提交的美国 专利申请流水号11/683，808 (代理人案号34646-701. 201)和2007年9月12日提交的美 国专利申请流水号60/971，878 (代理人案号34646-703. 101)的。图1中描绘了光学扫描 系统的一个实施方案的框图。在一个实施方案中，如图1中所显示的，可变换光源102与在基片104的第一边缘 的一个或多个激发波导108偶联且光学通信。另外，色散模块105和检测仪阵列106与在 基片104的第二边缘的一个或多个收集波导110偶联且光学通信。虽然显示了在基片的一 个边缘的单个检测仪，但是涵盖两个或更多个检测仪可以与在基片的多个边缘的一个或多 个收集波导偶联且光学通信(未显示)。例如，在一个实施方案中，在可变换光源与基片的 第一边缘偶联的情况中，第一检测仪可以与相邻边缘偶联，并与收集波导的第一末端光学 通信，而第二检测仪可以与另一相邻边缘偶联，并与收集波导的第二末端光学通信(未显 示)。第三检测仪可以与偶联至可变换光源的边缘相对的边缘偶联且与激发波导的第二末 端光学通信(未显示)。基片104可以包括相交区114，在那里收集波导110和激发波导108交叉或相交。如图1中所显示的，在一个实施方案中，系统100可以基本上是平面的。例如，可 变换光源102可以是平面芯片。这可以偶联至作为第二芯片的平面基片104，该平面基片 104进一步偶联至平面色散模块105，该平面色散模块105是第三芯片，并进一步偶联至作 为其一部分或第四芯片的检测仪阵列106。在一个具体的实施方案中，如图1中所显示的， 系统100是平面光波回路，其包括四个偶联的芯片。在一个实施方案中，将两个芯片整合成 单个芯片(例如光学开关芯片和基片芯片)。此类结构在基片芯片可再用的情况中会是有 用的，而且可以有效地用于长的时间期限。另外，将两个芯片在单个基片上整合解决维持两 个芯片(例如可变换光源芯片和基片芯片)的相对排列的问题。在图1的实施方案中，涵盖的是激发波导与收集波导的交叉或相交可以是直接物 理交叉或相交，例如，在那里将激发波导和收集波导在单层或多层中包埋于基片内。或者， 涵盖的是交叉或相交牵涉激发波导与收集波导间的物理间隔或距离，例如，在将激发波导 和收集波导在不同层中包埋于基片内的情况中。如图1中所显示的，系统100的光学感测位点112通常与相交区114有关。典型地，一个光学感测位点112与每个相交区114有关。如 显示的，在一个实施方案中，相交区114和光学感测位点112的数目是100个相交区114和 100个光学感测位点112的排列。涵盖的是，基片芯片上的相交区和光学感测区的数目可以 大于10个、大于100个、大于1，000个、大于10，000个、大于100，000个或大于1，000, 000 个。进一步涵盖的是，相交区的密度可以大于每Cm2IO个、大于每Cm2IOO个、大于每Cm2IOOO 个、大于每cm210，000个、大于每cm2100，000个、或大于每cm2l，000, 000个。在一个实施方 案中，相交区的密度大于每cm22，000个。如图1中进一步显示的，激发波导108和收集波导110的交叉或相交可以基本上 是垂直的，例如，为90°的角。或者，在某些实施方案中，交叉或相交可以形成小于或大于 90°的角。还涵盖的是，在图1的实施方案中，激发波导中由可变换光源产生的第一光波诱 导传感器转换光学信号，在收集波导中产生第二光波，所述第二光波是检测仪可检测的。如图1中所显示的，在一个有利的实施方案中，系统100是平面二维扫描系统。此 实施方案中的系统100包括平面可变换光源102，例如平面光学开关或可变换激光的阵列。 此外，可变换光源102可以为相对于各个激发波导108的选择性且程序性激发提供动态光 源，向沿着所述激发波导108的所有光学感测位点112提供激发。动态光源包括但不限于 可调波长和/或可调带宽光源。另外，此实施方案的系统100提供了自收集波导110中的 所有激发的感测位点112平面收集发射光，特别在基片104的平面中，使得光收集基本上与 激发波导108中产生的光的方向垂直。如图1中所显示的，色散模块105可以安排得与基片104(包括例如收集波导110) 光学通信。色散模块105用来分开退出收集波导110的光中存在的不同波长，而且可以配 置成将离开给定激发波导110的每种波长引导至ID或2D检测仪阵列106中的不同检测仪 元件116。涵盖的是，在经由色散模块来引导多种波长(例如四种或更多种颜色的光)的情 况中，可以安排模块以经由所述模块向检测仪阵列垂直地提供不同波长。在此情况中，检测 仪阵列可以是二维检测仪阵列，其包括安排成接受垂直分散的光的多个元件。在一个备选 的实施方案中，可以安排色散元件以向水平安排的一系列检测仪阵列元件提供水平分散的 多种波长的光，从而自色散模块接受色散光。在此情况中，检测仪阵列可以是一维检测仪阵 列。虽然色散模块105在图1中显示为分开的模块，但是在一个具体的实施方案中，可以将 色散模块105与检测仪阵列106整合成单个模块。作为非限制性例子，色散模块105可以 包括任何种类的色散光栅，包括但不限于全息的、机械控制的、计算机产生的或UV写入的 光栅以及棱镜、狭缝和该领域中已知的任何其它种类的色散结构。涵盖的是，可以配置色散模块以将退出收集波导的光分成多种不同波长。在一个 例示性的实施方案中，将光分成可用于例如四色核酸测序的四种不同波长。在另一种实施 方案中，可以分开超过四种不同波长。例如，可以分开五种或更多种波长。在四色测序应用 中，别的分开的波长(超过四种)可以是有用的，例如以帮助校准和标准化。如图1中所显示的检测仪阵列106可以包括元件116的阵列。涵盖的是，可以将 任何数目的元件与色散模块105光学排列以接受想要波长的光。在一个实施方案中，如图1 中所显示的，可以将一组的四个元件与色散模块105排列，使得可以自给定的收集波导110 检测出四种不同波长的光(例如来自四种不同荧光染料)，其源自光学感测位点112处的
11测序相关染料活性。如关于色散模块105所讨论的，可以采用5种或更多种波长的光，并且 因此涵盖每个收集波导1105个或更多个元件116。因此，可以以多种有用的结构安排检测 仪阵列106的元件116，例如，4乘10、5乘10、或6乘10。虽然显示了一系列的10个元件 116，但是涵盖的是，任何数目的元件可以是有用的，包括但不限于10个或更多个、20个或 更多个、100个或更多个或甚至1，000个或更多个。还涵盖的是，色散模块可以水平分散自单个收集波导出现的不同波长，将它们定 位入一维检测仪阵列的不同检测仪元件中(未显示)。光学扫描系统的备选实施方案披露于2007年3月8日提交的美国专利申请流水 号11/683，808 (代理人案号34646-701. 201)和2007年9月12日提交的美国专利申请流 水号 60/971，878 (代理人案号 34646-703. 101)。本发明的光学系统的第二部分是光学或光切割系统。光切割系统包括光源和用于 将发射光投递至一个或多个光学感测位点的光学手段。在一个具体的实施方案中，光切割系统的光源发射具有在UV(紫外)光谱范围中 的波长的光。在具体的非限制性实施方案中，光源发射具有IOOnm至400nm之间的波长的 UV光。在又一个实施方案中，发射的波长在400nm和2000nm之间的可见或红外光谱范围中。涵盖用于将光从光切割光源投递至感测位点212的许多可能的实施方案。图2A描绘了本发明的扫描感测系统的一个具体的实施方案。在此实施方案中，使 用用于光学扫描系统200的可变换光源202的同一光学开关203来投递来自光切割光源的 光。在一个实施方案中，光学开关203包括两个输入和和N个输出。涵盖的是，光学开关 203中可以包括两个或更多个输入。可以配置光学开关203以将任何输入转换成任何输出。 可以将用于光学扫描的第一光源207作为第一输入连接，而可以将光切割光源输2209连接 至光学开关203的第二输入。光学开关203可以用来偶联来自任一光源输入(207或209) 的光与部分或所有激发波导208，其将光投递至光学感测位点212。图2B描绘了本发明的扫描感测系统的另一个实施方案。在此实施方案中，将光切 割光源输入209连接至与基片204的第二边缘(例如基片204的相对边缘)偶联的第二光 学开关203。在第一光学开关203的对面布置第二光学开关203的情况中，这两个光学开关 可以单独偶联光与一个或多个激发波导208，其将光投递至与其光学通信的感测位点212。图2C描绘了本发明的又一个实施方案。在此实施方案中，使用光切割光投递系统 211，将来自光切割光源的光从基片204上方和/或下方照射在基片204和感测位点212上。 涵盖的是光切割光投递系统可以包括透镜、镜和用于将光指引至单独的光学感测位点或通 过溢满整个基片来同时指引至所有光学感测位点的机械手段(未显示)。在光切割光投递系统从下方将光照射至基片上的情况中，基片可以由光学透明材 料(例如玻璃或塑料)制成以容许光还照射在光学感测位点上(未显示)。在一个具体的 实施方案中，基片可以由UV透明塑料制成。图3A显示了本发明系统的例示性基片304，其进一步包含遮栏318，所述遮栏318 意图封闭基片内的杂散光，并降低基片的不同元件间的串扰。遮栏318可以是光吸收的或 光反射的。遮栏318可以是各种大小的、形状的且以多种用于实现想要的光学效果的取向 之任一种位于收集波导310和/或激发波导308之间。如图3A中所显示的，可以将遮栏318安排在两个相邻收集波导之间且接近光学感测位点312和相交区314的行中。如图3B中所显示的，(在此视图中，没有显示顶部包覆层)在一个实施方案中，基 片304可以在多层中包含基片304表面下包埋的激发波导308和收集波导310。如显示的， 激发波导308与收集波导310在相交区314处交叉，物理上相交，而且处于光学通信。在图 3B中所显示的实施方案中，光学感测位点312安放在激发波导308上方且与其光学通信的 相交区314处。如图3B中进一步显示的，基片304包含多层，包含硅层320和硅土(SiO2) 层322，其中收集波导310包埋于硅土(SiO2)层322内。如图3C中所显示的，在另一个实施方案中，基片可以在单层中包含基片304表面 下包埋的激发波导308和收集波导310。如显示的，激发波导308与收集波导310交叉，物 理上相交，而且处于光学通信。与图3B中显示的实施方案形成对比，在这里，激发波导308 与收集波导310间的相交发生在收集波导310的内部。如图3C中进一步显示的，基片304 包含多层，包含硅层320、硅土(SiO2)层322、和包覆层324。如显示的，可以将激发波导308 和收集波导310包埋于硅土(SiO2)层322内，另外，可以将光学感测位点312包埋于包覆层 324和硅土(SiO2)层322 二者内。任选地，可以将光学感测位点仅仅包埋于包覆层内(未 显不)ο涵盖的是，激发波导和收集波导可以是单模或多模波导。在一个实施方案中，激发 波导是单模的，而收集波导是多模的。涵盖的是，波导结构可以包括波导内垂直或侧面取向 的单模或多模结构。例如，在一个具体的且非限制性的实施方案中，激发波导308可以支持 垂直尺度的单模和侧面尺度的多模。任选地，如图3A中所显示的，激发波导308和收集波 导310可以从一个边缘至另一个边缘跨越整个基片。如图3C中进一步显示的，基片304元件和光学感测位点312可以包括多个尺寸 (dimension) 0图3C显示了基片304的两幅横断面视图。视图AA是平面A中的横断面视 图，如图3A和图3B中所标示的。视图BB是平面B中的横断面视图，如图3A和图3B中所标 示的。如图3C中所显示的，激发波导上方的包覆层324的厚度可以是约0. 1 μ m至20 μ m。 在一个实施方案中，包覆层324厚度是约1-2 μ m。作为一个非限制性例子，如图3C中所显 示的，光学感测位点312的开口可以包括下列尺寸约20μπι χ 2μπι。收集波导310间的 距离可以在约Iym至1000 μ m的范围。例如，如图3C中所显示的，收集波导310间的距离 可以是约100 μ m。收集波导310与硅层320之间的距离可以是约1 μ m至ΙΟΟμπι。例如， 如图3C中所显示的，收集波导310与硅层320之间的距离可以是约1-20 μ m。如图3B和图3C中所显示的，激发波导308和收集波导310可以是通道波导。图 3B和图3C中所显示的实施方案中的波导尺寸的例示性范围包括厚约0. 1至100 μ m和宽约 1至100 μ m。仅作为非限制性例子，激发波导208可以包含约0. 1 μ m χ 2 μ m的剖面尺寸， 而收集波导210可以包含约0. Iym χ 20 μ m的剖面尺寸。侧视图中的图3D显示了与传热元件303(例如热电冷却器(TEC))有关的本发明 基片304的另一个实施方案。传热元件303是一种可用于加热或冷却芯片(例如基片304) 的温度控制系统。虽然传热元件在本文中可以称为冷却元件，但是要理解的是，在配置传热 元件以提高和降低芯片温度的情况中，该元件随电流的感应方向而基本上发挥加热元件功 能和发挥冷却元件功能。传热元件可以提供一定范围的有用温度。例如，可以配置传热元 件以根据需要提供范围为约-40°C至约120°C的温度。可以改编传热元件以接受本发明的基片。可以改编传热元件以接触本发明基片的部分或整个表面。连同本发明的基片提供传热元件对于例如使用聚合酶的测序反应是有用的。或 者，它对于诸如如本文中所描述的经由聚合酶链式反应(PCR)等方法来扩增所测试的样品 分子是有用的。使用中，如对图3D所描述的实施方案提供了使用传热元件303来控制整个 基片的温度以使整个基片304的温度能保持恒定或循环的能力。如此，这样可以同时通过 核酸聚合酶或其它延伸方法来延伸和/或通过PCR或其它核酸扩增方法来扩增任何光学感 测位点处的样品。图3E显示了本发明的基片304的另一个实施方案，其中光学感测位点312包括加 热器305和热敏电阻307。在此实施方案中，基片304的光学感测位点312可以包含每个感 测位点321附近的加热器305，例如薄膜加热器。可以改编加热器305以对每个感测位点 312实现单独的温度控制。在加热器305外，热敏电阻307可以位于每个感测位点321处或 附近，由此提供测量局部温度。使用中，此实施方案为每个感测位点提供了运行相同或任何 想要的不同数目的循环和相同或任何想要的不同温度序型的能力。有利地，对图3D和图3E描述的实施方案可以支持实时核酸测序和/或PCR或其 它核酸扩增方法。如本文中所描述的，因为自基片内完成光学检测，所以可以在样品在测序 和/或扩增的过程中时完成这些实施方案(参见图3D和图3E)中的信号检测，由此实现对 过程的实时分析。图3F显示了本发明的基片304的又一个实施方案，其中基片304另外包含与光学 感测位点312有关的贮液器311和微通道309 (注意到为了更容易观察，在此例示中没有显 示波导)。因此，在此实施方案中，将微射流学整合入基片中。可以改编微射流学以使用毛 细管效应来驱动液体(在此情况中为所测试的样品)穿过基片。如图3F中所显示的，这可 以通过安排任选地具有不同宽度的微通道309来实现，所述微通道309迫使样品从一个或 多个贮液器311至光学感测位点312，其可以包含蚀刻孔以接受样品。或是可以在芯片自身 的表面上蚀刻微通道或是可以在感测芯片的表面上作为外部结构添加微通道。使用中，涵盖的是，可以将要测试的样品移入基片一端的贮液器中。然后可以使用 微射流系统来将样品分布至光学感测位点和感测孔，在那里容许它结合预定点的探针，随 后可以进行光学扫描和分析。可以使用数个贮液器来分开不同样品/患者或运行数项平行 测试。涵盖的是，可以使用打印头来将一种或多种引物寡核苷酸或核酸聚合酶应用至光 学感测位点。此外，涵盖的是，样品向系统的光学感测位点的投递包括使用附着于基片304 的上表面的测定头或流动池来投递样品。一种可能的打印头技术记载于2005年9月30日 提交的美国专利申请流水号11/241，060和2005年7月6日提交的美国专利申请流水号 11/632，086。顶视图中的图4A显示了本发明系统的例示性基片404，其中收集波导410包含用 于收集光的漏斗417 (在图4B中详细显示)。如图4A中的例子中所显示的，基片404可以包括10x10阵列，由10个激发波导 408(例如宽5μπι χ深2μπι)、10个收集波导410(例如宽30μπι χ深10 μ m)、100个光学 感测位点412 (例如孔长30 μ m χ宽5μπι χ深10 μ m)、100个用于自光学感测位点412收 集光的漏斗417和用于降低光学感测位点412间串扰的遮栏418 (例如光吸收通道)组成。虽然图4A中所显示的例子包括激发波导408和收集波导410的10x10阵列，涵盖的是，基 片可以包括大于10、大于100或大于1，000个激发波导408和收集波导410。在图4A中所显示的实施方案中，可以经由例如芯片间对接偶联(buttcoupling) 将激发光偶联入基片404的左手侧的一个或多个激发波导408中。激发光可以沿着激发波 导408传播，并且经由隐失场尾(evanescent field tail)偶联入光学感测位点(例如孔) 中。另外，可变换光源可以包含一个或多个波导，并且可以经由基片的一个或多个可变换光 源波导和一个或多个激发波导的紧接安排来隐失地偶联至基片。可以将光学感测位点412 中产生的激发荧光沿着光学感测位点412的长的小平面收集入漏斗417中。漏斗417可以 将光引导入收集波导410中。可以将收集波导410中的光在基片404的“底部”向外偶联 入检测仪阵列中(未显示)。可以通过一系列遮栏418 (例如光吸收器)来阻断光学感测位 点412外部散射的光以避免平行收集波导410间的串扰。在一个实施方案中，图4A中所显示的基片包含两个波导层。如图4C中的横断面 视图中所显示的，第一 2μπι厚底层可以包含激发波导408。底层可以具有较高的折射率以 提高光学感测位点中的隐失场尾存在。 ο μ m厚上层可以含有光学感测位点和光收集结构 (漏斗和波导)。上层可以具有比底层低的折射率以使偶联离开基片的光与检测仪时的光 损失最小化。在上文的一个具体的实施方案中，激发和收集波导两者都是多模的。此外，可变换 光源(例如与波导阵列偶联的光学开关或光发生器阵列)可以包括单模波导，其可以是对 接偶联的或者可以隐失地偶联至基片。如图4C中的横断面视图中所显示的，为了使由于从收集波导410进入激发波导 408的光偶联所致波导交叉点处的光损失最小化，激发波导408可以比收集波导410细。例 如，如图4B和图4C中所显示的，激发波导408可以具有5 μ m的宽度(参见图4B)和2 μ m 的高度(参见图4C)。如进一步显示的，收集波导410可以具有30 μ m的宽度(参见图4A 和图4B)和10 μ m的高度(参见图4C)。涵盖的是，激发波导与收集波导之间的波导交叉点处偶联的光可以直接照射入光 学感测位点中，由此提高光激发，而不是使光激发损失。如图4B中所显示的，光学感测位点可以是窄的(Ιμπι)且长的(30μπι)孔，其中沿 着长的小平面可收集光。此类结构提高光收集的效率。另外，偶联入孔中的光激发可以由 于长的偶联长度而升高。孔尺寸(5x 30x IOym3)产生1. 5皮升的体积。还涵盖多种大小 的更大的孔，以产生范围为约0. 1皮升至100微升的体积。漏斗可以具有用于收集、限制及将光偶联入收集波导中的半径。合适的半径范围 可以包括约100 μ m至约1000 μ m。如图4A和图4B中所显示的遮栏418可以是充满吸光材料(例如金属诸如金)的 槽。在遮栏418是槽的情况中，槽可以包括激发波导408上方的开口以避免交叉点处的损 失(未显示)。图4A中所显示的基片的总体尺寸可以是1.2x 1.2mm2。任选地，基片周围可以包 括边缘以根据需要调节总体尺寸。图5A显示了本发明系统的例示性基片504，其中激发波导508包含多个分支 521 (图5B中详细显示)，用于分接来自激发波导的光并将其偶联入感测孔中。
在图5A中所显示的实施方案中，基片504可以由数个波导层(例如三个波导层) 构成。此类结构可以用于例如优化激发和荧光收集，同时使损失和串扰最小化。图5C和图 5D是基片504分别穿过(AA)和(BB)处平面的示意性横断面视图，如图5B中所标示的。在一个实施方案中，基片由具有核心折射率1. 7和包覆折射率1. 4的三个波导层 构成。有用的核心折射率数值范围为约1. 45至2. 2，而有用的包覆折射率数值范围为约1. 4 至2。如图5C和图5D中所显示的，在一个实施方案中，在基片504包含三个波导层的情 况中，第一底层可以厚约10 μ m，而且包含收集波导510。在图5A中所显示的实施方案中， 收集波导510可以宽30 μ m、多模、而且基本从边缘至边缘横越基片510。第二中间波导层 可以厚0. Ιμπι至Ιμπι，而且包括偶联波导分支521 (参见图5Α和图5Β)。分支521可以将 激发光偶联入可以为孔的光学感测位点中。第三顶层可以厚2 μ m，而且包括单模激发波导 508，并基本从边缘至边缘横越基片。本文中所描述的各种特征的尺寸范围包括波导厚度20nm至50 μ m ；波导宽度 1 μ m至500 μ m ；波导长度Imm至IOOmm ；光学感测位点长度1 μ m至IOOmm ；光学感测位点 宽度1μπι至500μπι;光学感测位点深度:0至20μπι;波导间距(pitch) :10μπι至10mm; 基片厚度IOOym至5mm ；上部包覆厚度0至20 μ m ；和下部包覆厚度0. 1 μ m至20 μ m。扫描感测系统的基片可以由任意数目适合于用于平面光波回路的公知材料制成。 例如，有用的基片材料包括但不限于硅、硅土(SiO2)、玻璃、环氧树脂、铌酸锂和磷化铟及其 组合。本文中所公开的波导可以由硅、硅土(SiO2)及其衍生物、氮氧化硅(SiOxNy)及其衍 生物、氮化硅(Si3N4)及其衍生物、聚合物、铌酸锂和磷化铟及其组合制成。在一个实施方案 中，使用UV光来改变波导材料沉积后的折射率。图6A显示了基片604的例示性硅层620。例如，硅层620可以由具有约0. Imm至 2mm的厚度的硅片制成。在另一个例子中，硅片可以具有约0.3至Imm的厚度。在如图6A 中所显示的一个具体的例子中，硅片具有0. 65mm的厚度。如图6A中所显示的，在一个实 施方案中，硅土(SiO2)层622是通过将硅放置在高温炉内部的富含氧的环境中产生的硅土 (SiO2)的14μπι热氧化物层。顶部硅层随时间(数小时)氧化，产生SiO2层。另外，如图 6Α中所显示的，在一个实施方案中，包覆层624厚15 μ m，并在蚀刻后通过PECVD (等离子增 强的化学蒸发沉积)方法来沉积以生成波导608。涵盖的是，基片的各层可以包括不同折射率特性。例如，波导层(例如Si3N4)具有 比其上沉积的硅土的包覆层要高的折射率。如图6B中所显示的(通过包覆层沉积前的显微照片显示)，在一些实施方案中， 基片604可以包含安排用于在硅土(SiO2)层622上光波偶联的两个波导608。或者，如图 6C中所显示的，可以安排两个波导608以引导硅土(SiO2)层622上的未偶联光波，并用包 覆层624夕卜包覆(over-clad)。图7A显示了本发明系统的例示性可变换光源702，其包含作为用于与光发生器偶 联的主要光源的一个或多个输入701。光发生器可以是发射一种或多种离散光谱线或连续 光谱的任何电磁辐射源(未显示)。在一个实施方案中，光发生器是在一种或多种充分限定 的波长中发射的激光源。在第二个实施方案中，光发生器是一种可调激光，其可以进行调整 以发射预定范围内的一种波长中的光。如显示的，可变换光源702进一步包含图7A中显示为N个输出的多个输出703。可变换光源702中包含的输出703的数目可以是可变的，这基 于预期的用途。例如，在某些应用中，输出703的数目可以大于10个输出。在一个实施方 案中，输出703的数目可以大于100个输出。在又一个实施方案中，输出703的数目可以大 于1，000个输出。在另一个实施方案中，输出703的数目范围为约50至500。可变换光源可以是被动IxN分路器，其中N例如在1和1，000之间。进一步涵盖 的是，N可以大于1，000、大于10，000或大于100，000。此类安排是有利的，因为它容许如 本文中所描述的系统的波导中的同时(例如平行)激发。在一个具体的实施方案中，输出703的数目是约128。如图7A中所显示的，在一个 实施方案中，可变换光源包括自输入701散开至输出703，将输入701处的光均等地分开至 所有输出703。如图7B中所显示的，在一个实施方案中，可以使用自输入701至输出703衍 生的分支结构。虽然图7A和图7B中仅显示了一个输入，涵盖的是，可以使用多个输入701。图7C显示了本发明系统的另一个例示性可变换光源702，其包含多个输出。在此 实施方案中，可变换光源702包含多个波导709、扫描光发生器707、光切割光发生器708和 电子导体705。如图7C中所显示的，在一个非限制性例子中，可以穿过基片711平行安排波 导709。在其它实施方案中，以非平行方式安排波导(未显示)。波导709可以终止于输出 703，如本文中所描述的。如图7C中所显示的，可以经由光组合器710将多个扫描光发生器707和光切割光 发生器708偶联入波导709中。如图7C中进一步显示的，光发生器707和708可以与电子 导体705电通信。继而，电子导体可以与任意数目的装置(包括但不限于电源或电子驱动 回路)电通信(未显示)。涵盖的是，可变换光源可以是动态光源，其容许经由一个或多个单独的输出选择 性且编程性产生初始光波。在一个实施方案中，可变换光源是光学开关，例如平面光学开 关。可变换光源可以是光操作装置，用于将光从给定的输入转换成任何给定的输出。此外， 可变换光源可以同时将输入光多播至数个输出。在一个实施方案中，可变换光源是经由一 个或多个光纤与光发生器偶联的光学开关(未显示)。在一个具体的实施方案中，将光发生 器与可变换光源的一个或多个输入偶联。作为非限制性例子，光发生器可以提供可变波长 的光。在一个实施方案中，光发生器是宽带源。在另一个实施方案中，光发生器是可调源。可变换光源可以包括K ( = 1,2,3...)个输入和N个输出。在一些实施方案中，输出的数目会等于系统的感测基片中激发波导的数目。在一 个具体的实施方案中，光发生源与可变换光源输入之间的界面包括光纤。可变换光源输出 间的界面在间距方面应当匹配感测基片中的激发波导以容许这两种元件对接偶联并将光 从可变换光源转移至感测基片的激发波导。在一个实施方案中，光学开关包含基于Mach Zehnder干涉仪的单独开关元件。可变换光源输入可以包括光发生器元件的阵列。在一个实施方案中，光发生器元 件是发光二极管(LED)。在另一个实施方案中，光发生器元件是激光芯片。将每个单独的 光发生器元件分开控制，并能根据需要开启或关闭。在一个实施方案中，可变换光源输入包 含10个或更多个光发生器元件。在另一个实施方案中，可变换光源输入包含100个或更多 个光发生器元件。在又一个实施方案中，可变换光源输入包含1000个或更多个光发生器元 件。在一个具体的实施方案中，可变换光源输入包含10-100个光发生器元件。
检测仪阵列可以包含检测仪元件的阵列。在一个实施方案中，检测仪元件是PIN 二极管。在另一个实施方案中，检测仪元件是雪崩光二极管(APD)。将每个单独的检测仪 元件分开控制并读取。在一个实施方案中，检测仪阵列包含10个或更多个检测仪元件。在 另一个实施方案中，检测仪阵列包括100个或更多个检测仪元件。在又一个实施方案中， 检测仪阵列包括1000个或更多个检测仪元件。在一个具体的实施方案中，检测仪阵列包含 10-100个检测仪元件。可变换光源和检测仪阵列可以包含光操作元件诸如色散元件、滤光器、开关、调制 器、分路器、组合器、镜和循环器。可变换光源和检测仪阵列的控制可以或是在与光发生器元件、检测仪元件和波导 同一个芯片上整合或是备选地可以在芯片外部。可变换光源输入和检测仪阵列可以与外部 驱动器或内部控制器具有电界面或者与外部控制系统具有逻辑界面。可变换光源和检测仪 阵列的控制容许分开驱动每个光发生器元件和检测仪阵列。它进一步容许控制可变换光源 和检测仪阵列诸如例如调制器和开关上存在的其它特征。可变换光源和检测仪阵列可以以数种不同方式偶联至基片。在一个实施方案中， 通过使两个芯片(可变换光源和基片)上的波导末端极其接近，并容许光从一个波导直接 偶联至另一个来实现偶联。在另一个实施方案中，这两个芯片上的波导的一部分在彼此的 顶部、彼此平行地且极其接近地排列，如此经由隐失电磁场将光从一个波导偶联至另一个。涵盖可用于平面光波回路的别的元件(包括但不限于色散元件、耦合器、滤光器、 镜、循环器、分路器、调制器、开关和槽)作为本文中所描述的系统的一部分(未显示)。 此类元件在整合入基片中或整合入可变换光源和检测仪阵列中时可以用来操作入偶联 (in-coupling)波导中的输入第一光波或出偶联波长中的输出第二光波。在一个非限制性的例子中，检测仪是具有400至IOOOnm之间的光谱范围、大于0.3 的光灵敏度(A/W)、0. 005mm2的每个元件的有效面积、128个元件、和小于0. Imm的间距的检 测仪阵列。在一个实施方案中，检测仪是硅光电二极管(PN、PIN或APD)阵列。合适的检测仪 阵列的例子是Hamamatsu S85504X8硅APD阵列。一般而言，在一方面，提供了用于对核酸测序的扫描传感器系统。系统包含基片 (例如如图1中所显示的)，其包含多个基本上平行的激发波导和多个基本上平行的收集波 导，所述激发波导和收集波导交叉以形成相交区的二维阵列，在那里激发波导和收集波导 交叉，并以每个交叉处的所述相交区提供光学通信；多个光学感测位点，其安排得与所述相 交区光学通信；一个或多个可变换光源，其与所述基片的激发波导偶联且光学通信，并包括 扫描光源输入和光切割光源输入；光色散模块，其与所述基片的收集波导偶联且光学通信， 并包括元件的阵列；检测仪，其与所述光色散模块偶联且光学通信。在一个实施方案中，扫描光源是与第一可变换光源偶联的，所述第一可变换光源 在所述基片的第一侧与所述激发波导偶联且光学通信，而光切割光源是与第二可变换光源 偶联的，所述第二可变换光源在所述基片的第二侧与所述激发波导偶联且光学通信。一般而言，在又一个方面，一种用于对核酸测序的扫描传感器系统包括基片，其包 含多个基本上平行的激发波导和多个基本上平行的收集波导，所述激发波导和收集波导交 叉以形成相交区的二维阵列，在那里激发波导和收集波导交叉，并以每个交叉处的所述相交区提供光学通信；多个光学感测位点，其安排得与所述相交区光学通信；可变换光源，其 与激发波导光学通信，并包含扫描光源输入；光切割光源和光投递系统，其安排在所述基片 外部(例如如图2C中所显示的)；光色散模块，其与所述基片的收集波导偶联且光学通信， 并包括元件的阵列；检测仪，其与所述光色散模块偶联且光学通信。所述光投递系统可以包括光切割光源输入。可以配置所述色散模块以将光从一个或多个所述收集波导分散至所述检测仪中 的多个元件。在一个实施方案中，配置所述色散模块以将光从给定的收集波导分散至所述 检测仪中的四个或更多个元件。在一个具体的实施方案中，所述色散模块将光分散至检测 仪中的四个元件。在一个不同的实施方案中，所述色散模块将光分散至检测仪中的五个或 更多个元件。自所述色散模块分散的光可以包含多种光波长。在一个实施方案中，所述多种波 长包括四种或更多种光波长。在另一个实施方案中，所述多种波长包括五种或更多种波长。所述光切割光源可以发射具有范围为400nm和2000nm之间的波长的光。所述光切 割光源输入可以与紫外光源偶联。在一个实施方案中，所述紫外光源发射具有范围为IOOnm 和400nm之间的波长的光。控制系统涵盖用于管理操作扫描感测系统的不同步骤的控制系统。在转换可变换光源中的光、读取检测仪阵列和报告检测出的结果外，控制系统可 以管理诸如排列光源、色散模块、和检测仪阵列，及感测基片等步骤。可以包含逻辑器件的 控制系统还可以管理并控制与如本文中所描述的扫描感测系统一起使用的样品投递系统 和其它射流或机械特征。通过定相合成讲行的测序使用本文中所描述的光学扫描感测系统，实现用于对核酸测序的方法。制备例如如图1中所显示的扫描感测系统的基片后，可以将核酸、模板、引物、测 序衔接头、和/或聚合酶固定化至基片的光学感测位点。在图8A中所描绘的一个实施方案中，通过共价固定化方法(包括但不限于使用 (3_缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(GOPTS)、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、或(3-巯丙 基)三甲氧基硅烷)将DNA引物821经由其5’端固定化至基片804的一个或多个感测位点 812。作为一个例子，首先可以用GOPTS包被基片804，并将脱氧寡核苷酸经由位于脱氧寡核 苷酸的5’端的伯氨基团共价偶联至GOPTS环氧基团。在一个具体的实施方案中，使用间隔 物臂将氨基基团与所述脱氧寡核苷酸的5’磷酸酯基团间隔0. 5至5nm。测序方法前，连同 聚合酶825诸如逆转录酶或DNA聚合酶一起将与一种或多种固定化的DNA引物827互补的 一种或多种核酸靶物823 (RNA或DNA)添加至基片804。容许靶物和引物杂交，由此提前或 就在测序方法前产生双链体829。可以在与靶核酸的同时或者就在测序前添加聚合酶825。 可以通过将独特的靶物特异性引物序列固定化至两个或更多个不同感测位点之每个来在 单个基片上对多个靶物测序。可以经由使用基于诸如微射流学和针定点(pin-spotting) 等技术的高分辨率定点装置或通过在点上合成引物来实现将独特的且不同的靶物特异性 引物固定化至一个或多个感测位点812。在一些实施方案中，可以通过物理吸附、共价偶联至例如经GOPTS包被的感测位点、或与生物素_间隔物_胺(例如Pierce的EZ-连接胺-PEO-生物素或戊胺-生物素) 非共价偶联来将中性亲合素(neutravidin)或链霉亲合素固定化至感测位点812。然后可 以经由上文所讨论的相同种类的间隔物臂来将引物进行5’生物素化。在图8B中示意性显示的另一个实施方案中，将聚合酶822固定化在基片804的感 测位点812。可以提前或就在测序方法前安排固定化。可以将DNA引物821和靶核酸杂交 为DNA双链体824，之后添加至基片804，或者可以将它们分开添加至基片804，并容许它们 在基片804的表面上(例如在感测位点812处)杂交。然后，DNA双链体824可以与一个 或多个感测位点12处固定化的聚合酶822复合为聚合酶和DNA双链体复合物830。在图8C中所描绘的又一个实施方案中，可以通过在两个或更多个不同感测位点 812之每个的独特的靶物特异性固定化引物827来在单个基片804上对多个靶物测序。可以 经由光可切割接头来将固定化引物827附着至感测位点812。可以使用基于诸如微射流学 和针定点(pin-spotting)等技术的高分辨率定点装置或者通过在点上合成它们来实现将 独特的且不同的靶物特异性引物固定化至一个或多个感测位点812。接着，可以与靶物-特 异性固定化引物827接近地将聚合酶822固定化至一个或多个感测位点812。然后，可以 将靶核酸823添加至基片804的表面，并容许与不同固定化引物827杂交并产生核酸双链 体829。就在测序前，将来自光切割源的光脉冲投递至所有感测位点以自基片释放DNA双链 体，使它们能够结合一个或多个感测位点处固定化的聚合酶(未显示)。Olejnik等的美国专利号7，145，019披露了光可切割接头家族，其可以掺入图8C 中所描绘的合成核苷酸中。如Olejnik等所披露的，对于本方法有用的接头(光反应性基 团)可以包括能够与基片形成一个或多个共价键的化学基团(例如生物素或氨基基团)，其 可以用电磁辐射切割。可以与基片上的化学基团诸如例如胺、酚、咪唑、醛、羧酸或硫醇形成 这些键。光反应剂可以是取代的芳香环，其含有至少一个多原子基团和任选地一个或多个 单原子基团。在一个实施方案中，芳香环是5或6个成员的环。取代包含多原子的和任选 的单原子的基团。多原子基团赋予电子沟道特性以将电子吸引或排斥至化学结构内的某些 位置，由此创建或建立用于产生选择性可切割共价键的条件。一些单原子基团诸如卤化物 可以调节会诱导切割的电磁辐射的频率或波长。因此，单原子基团细微地调整切割事件以 使偶联物对预定的辐射频率或强度灵敏。应当注意到，即使对单一靶物/引物杂合物描述以下测序方法，它适用于单一感 测位点或多个感测位点处结合并测序的任意数目相同或不同的核酸链。每个感测位点的靶 物/引物杂合物的数目可以是1和大于109之间的任何数。合适的聚合酶包括那些本文中 关于核酸扩增描述的(例如DNA聚合酶和逆转录酶)。测序方法中的下一步包括投递含有聚合酶延伸在感测位点812处固定化的DNA双 链体829的核酸引物需要的所有试剂的“主混合物”。可以使用上文所描述的样品投递系统 之一来完成所述投递。此“主混合物”包含预定浓度的四种核苷酸(dNTP)，每种类型用发射 不同波长的光的不同荧光标签标记。经由光可切割化学键将所有荧光标签附着至相应的核 苷酸，从而可以在鉴定(“调用”)每个新添加的碱基后释放并洗去标签，由此阻止测序过程 中多色标签在感测位点处的积累。还可以使用光切割事件来使测序反应同步。在一个实施方案中，将荧光标签设计成大得足以一旦由聚合酶添加至核酸引物便抑制进一步的延伸。在另一个实施方案中，荧光标签是标准的荧光染料(其太小以致不 能抑制聚合酶)，但是每种经荧光标记的dNTP的3’ OH基团用本文中又称为“封闭基团” 的光可切割笼封闭。笼型核苷酸在其3’ OH基团处具有笼结构。笼结构是可除去的封闭 基团，其阻止3’ OH基团参与核苷酸添加反应。笼型核苷酸在用于如本文中所描述的测序 反应的引物和探针中是有用的。许多笼结构是已知的。例示性的笼结构是光不稳定性结 构，其容许通过暴露于光而除去它们。可用于可逆地封闭3’ OH基团的具体笼结构记载于 美国专利号 6，632，609 ;Metzker 等，Nucleic Acids Res. 22 :4259_4267 (1994) ；Burgess 和 Jacutin，Am. Chem. Soc.摘要卷 221，摘要 281 (1996) ；Zehavi 等，J. Organic Chem. 37 2281-2288(1972) ；Kaplan 等，Biochecm. 17 1929-1035 (1978) ；McCray 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7237-7241 (1980)；及 Pillai，Synthesis 1-26(1980)。光可切割笼结 构的有用例子包括2’ -脱氧-3’ -0-(2-硝基苄基)衍生物、2’脱氧-3’ -0-(2-氨苄基) 衍生物、2，脱氧-3，-0-(4-硝基苯甲酰)衍生物(Metzker等，Nucleic Acids Res. 22 4259-4267(1994))。有用的笼结构包括那些基于使用硝基苯基基团的。可以作为有用的笼的数种不 同硝基苯基衍生物记载于Gee等的美国专利号5，872，243。例如，Gee等描述了一种笼框 (caging)基团，其是具有下式的邻硝基芳香基次甲基的衍生物
权利要求
1.一种用于对核酸测序的扫描传感器系统，其包含基片，其包含多个基本上平行的激发波导和多个基本上平行的收集波导，所述激发波 导和收集波导交叉以形成相交区的二维阵列，在那里激发波导和收集波导交叉并以每个交 叉处的所述相交区提供光学通信；多个光学感测位点，其安排得与所述相交区光学通信；一个或多个可变换光源，其与所述基片的激发波导偶联且光学通信，并包括扫描光源 输入和光切割光源输入；光色散模块，其与所述基片的收集波导偶联且光学通信，并包括元件的阵列； 检测仪，其与所述光色散模块偶联且光学通信。
2.权利要求1的系统，其中扫描光源是与第一可变换光源偶联的，所述第一可变换光 源在所述基片的第一侧与所述激发波导偶联且光学通信，而光切割光源是与第二可变换光 源偶联的，所述第二可变换光源在所述基片的第二侧与所述激发波导偶联且光学通信。
3.一种用于对核酸测序的扫描传感器系统，其包含基片，其包含多个基本上平行的激发波导和多个基本上平行的收集波导，所述激发波 导和收集波导交叉以形成相交区的二维阵列，在那里激发波导和收集波导交叉并以每个交 叉处的所述相交区提供光学通信；多个光学感测位点，其安排得与所述相交区光学通信；可变换光源，其与激发波导光学通信，并包括扫描光源输入；光切割光源和光投递系统，其安排在所述基片外部；光色散模块，其与所述基片的收集波导偶联且光学通信，并包括元件的阵列；检测仪，其与所述光色散模块偶联且光学通信。
4.权利要求3的系统，其中所述光投递系统包含光切割光源输入。
5.任何前述权利要求的系统，其中配置所述色散模块以将光从一个或多个所述收集波 导分散至所述检测仪中的多个元件。
6.权利要求5的系统，其中配置所述色散模块以将光从给定的收集波导分散至所述检 测仪中的四个或更多个元件。
7.权利要求6的系统，其中自所述色散模块分散的光包含多种光波长。
8.权利要求7的系统，其中所述多种波长包含四种或更多种光波长。
9.任何前述权利要求的系统，其中所述光切割光源发射具有范围为400nm和2000nm之 间的波长的光。
10.任何前述权利要求的系统，其中所述光切割光源输入是与紫外光源偶联的。
11.权利要求10的系统，其中所述紫外光源发射具有范围为IOOnm和400nm之间的波 长的光。
12.一种通过检测在增长中的核酸链的3’端掺入的荧光核苷酸类似物的身份来对核 酸测序的方法，包括(a)将多个包含模板核酸、配置成与所述模板杂交的引物和聚合酶的复合物固定化于 基片的多个光学感测位点，其中所述基片是基于波导的光学扫描系统的一部分；(b)使用聚合酶延伸反应用所述聚合酶和一种或多种荧光核苷酸类似物将所述引物延 伸单个核苷酸，其中每种类型的荧光核苷酸类似物包含任选地配置成抑制进一步的引物延伸的独特荧光标签和/或3’端的封闭剂，且其中所述荧光核苷酸类似物的掺入可逆地终止 所述聚合酶延伸反应；(c)通过使用所述光学扫描系统来光学扫描所述基片以检测所述荧光核苷酸类似物的 独特标签，从而鉴定通过所述聚合酶反应掺入的所述荧光核苷酸类似物；(d)记录所述基片的光学扫描结果；(e)通过向所述基片的一个或多个所述光学感测位点提供光切割脉冲光来切割所述荧 光标签或所述封闭剂，从而逆转所述聚合酶延伸反应的终止；并(f)重复步骤(b)到(e)。
13.权利要求12的方法，其中在所述多个复合物形成和固定化前将所述引物固定化于 所述多个光学感测位点。
14.权利要求13的方法，其中将所述引物共价固定化于所述光学感测位点。
15.权利要求13的方法，其中使用所述光学感测位点处的光可切割接头来将所述引物 固定化。
16.权利要求12的方法，其中在所述多个复合物形成和固定化前将所述聚合酶固定化 于所述多个光学感测位点。
17.权利要求16的方法，其中在固定化所述多个复合物前将所述聚合酶共价固定化于 所述光学感测位点。
18.权利要求12的方法，其中在所述多个复合物形成和固定化前使用所述光学感测位 点处的光可切割接头来将所述引物固定化并将所述聚合酶共价固定化于所述光学感测位点ο
19.权利要求18的方法，其中在步骤(b)前，形成固定化的引物和模板双链体，并提供 光切割脉冲光以切割所述光可切割接头并释放所述双链体，其中所释放的双链体随后结合 所述固定化的聚合酶并形成固定化的多个复合物。
20.权利要求12至19中任一项的方法，其中在步骤(c)前进行步骤(b)，步骤(b)和 (c)之间没有清洗步骤。
21.权利要求12至20中任一项的方法，其中步骤(f)进一步包括在重复步骤(b)前进 行步骤(e)，步骤(e)和(b)之间没有清洗步骤。
22.权利要求12至21中任一项的方法，其中所述核酸是DNA。
23.权利要求12至22中任一项的方法，其中所述荧光核苷酸类似物包含四种不同 dNTP，其中每种dNTP是用不同荧光标签标记的。
24.权利要求23的方法，其中所述荧光标签是经由光可切割的化学键来附着至所述 dNTP 的。
25.—种对单一核酸分子测序的方法，其通过在将荧光核苷酸类似物掺入增长中的核 酸链中后检测所述核苷酸类似物的身份来进行，包括(a)将包含模板核酸、配置成与所述模板杂交的引物和聚合酶的复合物固定化于基片 的光学感测位点，其中所述基片是基于波导的光学扫描系统的一部分；(b)使用聚合酶延伸反应用所述聚合酶和一种或多种荧光核苷酸类似物将所述引物延 伸单个核苷酸，其中每种荧光核苷酸类似物包含任选地配置成抑制进一步的引物延伸的荧 光标签和/或在所述核苷酸类似物3’端的封闭剂，且其中所述荧光核苷酸类似物的掺入终止所述聚合酶延伸反应；(C)通过使用所述光学扫描系统来光学扫描所述基片以检测附着至所述荧光核苷酸类 似物的独特标签，从而鉴定通过所述聚合酶反应掺入的所述荧光核苷酸类似物；(d)记录所述基片的光学扫描结果；(e)向所述基片的一个或多个所述光学感测位点提供光切割脉冲光来切割所述荧光标 签或所述封闭剂；并(f)重复步骤(b)到(e)。
26.权利要求25的方法，其中在所述复合物形成和固定化前将所述引物固定化于所述 多个光学感测位点。
27.权利要求沈的方法，其中将所述引物共价固定化于所述光学感测位点。
28.权利要求沈的方法，其中使用所述光学感测位点处的光可切割接头来将所述引物 固定化。
29.权利要求25的方法，其中在所述复合物形成和固定化前将所述聚合酶固定化于所 述多个光学感测位点。
30.权利要求27的方法，其中在固定化所述复合物前将所述聚合酶共价固定化于所述 光学感测位点。
31.权利要求25的方法，其中在所述复合物形成和固定化前使用所述光学感测位点处 的光可切割接头来将所述引物固定化并将所述聚合酶共价固定化于所述光学感测位点。
32.权利要求31的方法，其中在步骤(b)前，形成固定化的引物和模板双链体，并提供 光切割脉冲光以切割所述光可切割的接头并释放所述双链体，其中所释放的双链体随后结 合所述固定化的聚合酶并形成固定化的复合物。
33.权利要求25至32中任一项的方法，其中在步骤(c)前进行步骤(b)，步骤(b)和 (c)之间没有清洗步骤。
34.权利要求25至33中任一项的方法，其中步骤(f)进一步包括在重复步骤(b)前进 行步骤(e)，步骤(e)和(b)之间没有清洗步骤。
35.权利要求25至34中任一项的方法，其中所述核酸是DNA。
36.权利要求25至35中任一项的方法，其中所述荧光核苷酸类似物包含四种不同 dNTP，其中每种是用不同荧光标签标记的。
37.权利要求36的方法，其中所述荧光标签是经由光可切割的化学键来附着至所述 dNTP 的。
全文摘要
提供了通过检测在增长中的核酸链的3’端掺入的荧光核苷酸类似物的身份来对核酸测序的系统和方法。一种方法包括下列步骤(a)将多个包含模板核酸、配置成与所述模板杂交的引物和聚合酶的复合物固定化于基片的多个光学感测位点，其中所述基片是基于波导的光学扫描系统的一部分；(b)使用聚合酶延伸反应用聚合酶和一种或多种荧光核苷酸类似物将所述引物延伸单个核苷酸，其中每种类型的荧光核苷酸类似物包含任选地配置成抑制进一步的引物延伸的独特荧光标签和/或3’端的封闭剂，且其中所述荧光核苷酸类似物的掺入可逆地终止所述聚合酶延伸反应；(c)通过使用所述光学扫描系统来光学扫描所述基片以检测所述荧光核苷酸类似物的独特标签，从而鉴定通过所述聚合酶反应掺入的所述荧光核苷酸类似物；(d)记录所述基片的光学扫描结果；(e)通过向所述基片的一个或多个光学感测位点提供光切割脉冲光来切割所述荧光标签或所述封闭剂，从而逆转所述聚合酶延伸反应的终止；并(f)重复步骤(b)到(e)。
文档编号C12Q1/68GK102124128SQ200980131813
公开日2011年7月13日 申请日期2009年6月10日 优先权日2008年6月16日
发明者詹姆斯·赫伦, 鲁文·杜尔 申请人:Plc诊断股份有限公司