染色体畸变检测的制作方法

专利名称：染色体畸变检测的制作方法
染色体畸变检测本发明涉及检测损伤DNA分子的制剂的改进方法，并涉及可有效地用在该等方法 中的遗传工程化的细胞。
背景技术：
DNA损伤可由多种制剂诱发，诸如紫外光、X射线、自由基、甲基化剂、拓扑异构酶 抑制剂、DNA合成抑制剂、活性氧产生器和其它诱变。这些制剂可影响基因组DNA的完整性， 这是由生物中DNA分子的改变、变化、重排或损伤所引起的，包括但不限于基因突变或染色 体重排。这些突变在多细胞生物中可产生致癌，或在有性繁殖生物中会损伤配子从而导致 后代中的先天性缺陷。这些DNA损伤剂可化学改性包括DNA的核苷酸，也可破坏连接核苷酸的磷酸二酯 键或破坏碱基(T-A或C-G)之间的缔合。为抵消这些DNA损伤剂的影响，细胞已经发展了 多种机制。比如大肠杆菌中的SOS响应是由DNA损伤诱发的良好表征的细胞响应，其中表 达了一系列蛋白质，包括修复损伤的DNA的DNA修复酶。许多情况下确定什么制剂会引起或加重DNA分子的改变是非常重要的。当评估使 人或动物接触引起DNA损伤的制剂是否安全时，对这些制剂的检测就尤其重要。比如检测 这些制剂的方法可用作基因毒性试验而用于筛选作为候选药物、食品、食品添加剂或化妆 品的化合物，以评估受关注化合物是否诱发DNA损伤。或者，检测DNA损伤剂的方法可用来监测可疑污染点的水源和土壤样本污染被含 有诱变的污染物污染的情况。用于确定制剂毒性的多种方法诸如染色体异常测试是已知的，但这些方法因多种 原因而不尽人意。比如样本的孵育需要许多天，而通常希望在较短的时间期限内获得遗传 毒性数据。此外，许多已知的检测DNA损伤的方法检验永久性DNA损伤为端值，其以错误修 复DNA(突变和重组)的形式或者以未修复的片段DNA的形式而存在。然而大多数DNA损 伤在可测到该端值之前已被修复，并且永久性DNA损伤仅在条件太苛刻以致修复机制已经 饱和的情况下才发生。因此与可辨别的遗传损伤或其它遗传端值相比，与DNA损伤修复过 程相关的变化在较大程度上发生在较高比例的细胞中。尽管缺乏一些代谢途径，但在动物和人中发现那些相当的可替代的途径，作为对 遗传性损伤响应的基本DNA修复机制在酵母和哺乳动物之间是相似的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中对DNA损伤的响应已被很好的 表征。RAM4编码同源重组修复途径(见下文)的结构元件，并响应于将酵母暴露于广谱的 基因毒素而被转录上调，其中广谱的基因毒素包括但不限于UV和X照射和烷基化剂，因此 RAM4是用于监测遗传端值的良好替代品(Cole等人，Molecular and CellularBiology, 7 :1078-1084)。RAM4编码DNA修复酶的成员并由多种不同DNA损害或损伤转录诱导至组 成型水平以上，但是启动子不对非基因毒性氧化或还原应激、热或渗透冲击或氨基酸饥饿 作出反应。鉴于所述特征，可通过诸如例如Greenscreen试验中的绿色荧光蛋白(GFP)的 报告蛋白的RAM4诱导转录而对DNA损伤进行监测。
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Greenscreen基因毒性试验公开在1998年10月8日所公布的W098/44149 (RAD54) 中，并且提供了包括调节元件的重组DNA分子，该调节元件响应于DNA损伤激活基因表达并 可操作地连接至编码发光报告蛋白的DNA序列。这种DNA分子可用于转化细胞，而这类细 胞可用在基因毒性试验中来检测引起或加重DNA损伤的制剂的存在。可使细胞接触制剂， 并且细胞中发光报告蛋白表达的增加表明该制剂引起DNA损伤。WO 98/44149中描述的基因毒性试验检测DNA修复活性的诱导。因此WO 98/44149 中描述的方法以更具体的方式用于检测DNA损伤剂的存在。WO 98/44149进一步描述了许多可用于转化宿主细胞，尤其是酵母细胞的有用的 遗传构建体，从而其可用在基因毒性试验中。一种这样的构建体是yEGFP-444(示出在WO 98/44149 的图 12 中)。许多酵母突变株现在以改变的表型存在，其包括更具渗透性的细胞膜和受损的或 降低的输出泵活性，其通常通过删除其相应基因而提供对异生物质的有效解毒。2005年2月10日公布的WO 05/12533描述了 Greenscreen试验的修改版，其包括 W098/44149中所述的载体的自发重排，从而产生更亮的报告蛋白。Knight 等人开发了 Greenscreen 试验的新方案(Mutagenesis 22 :409-416,2007) 以通过添加大鼠肝脏S9提取物而增强酵母的代谢能力，旨在从更大量的前诱变剂中检测
基因毒性。遗传分析和随后的生物化学表征已经定义了三种主要的DNA辐射损伤修复途径， 即核苷酸切除修复途径(NER)，重组修复途径和复制后修复和诱变途径(PR 。NER主要识 别引起螺旋畸变的损害，重组修复途径负责双链断裂的修复，PRR被定义为在不实际移除复 制阻断损害的情况下将DNA损伤诱发的单链缺口转化为大分子量DNA的活性，这通常被称 为DNA耐受或避免途径(avoidance pathway)。除了以上所识别的三种DNA辐射修复途径 外，负责损伤碱基修复的基因属于碱基切除修复途径(BER)。BER途径识别并修复特定的碱 基修饰损害，所述碱基修饰损害主要是由DNA烷化剂和氧化剂所产生的DNA的相对较小的 修饰。BER途径和NER途径之间可以存在强的相互作用。通过使某些DNA修复途径失活可 进一步提高真核生物基因毒性检测系统的敏感性(Jia等人kiences 75 :82_88，2003)。所有的BER反应都由称作DNA糖基化酶的特异类的DNA酶的作用而引发。糖基化 酶识别并以损害特异的方式结合于损伤位点，并且介导糖主链上受损碱基的裂解。MAGl编 码具体参与烷基化损害修复的3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶。Magl具有广泛的底物，其包括 由甲基化剂和乙基化剂以及其它工业烷基化剂所产生的损害。用出芽酵母中APm和APN2 编码的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶进一步处理由MaglDNA糖基化酶所产生的脱碱基 位点。主要需要精确的预调节筛选和遗传工程化细胞，这可有助于滤出投入相对可以忽 略时的产品开发(例如，药物开发)早期的基因毒素。本发明检测BER、NER和重组修复途径中修复机制的诱导。特别有用的是显示本转 化的细胞和方法可用于化合物的实际药物库的高通量的筛选，以检测在哺乳动物细胞中可 能有基因毒性但是被Ames、Vitotox或其它基于原核的筛选漏掉的化合物。通过修复途径 的失活并通过由萤光素/萤光素酶反应对β-半乳糖苷酶报告蛋白的修复信号的诱导的放 大，本发明对诱导修复的检测极其灵敏并与Greenscreen试验一样以更灵敏和更可预知的方式滤出致畸变的化合物。

发明内容
根据本发明的第一方面，提供了包括调节元件的真核细胞，该调节元件被设置为 响应于DNA损伤而调节报告蛋白的表达，其中所述细胞的特征在于其在DNA修复途径中是 有缺陷的。调节元件可存在于重组载体中。重组载体序列可整合入基因组。提供了具有改变的表型的细胞，其包含更具渗透性的细胞膜和通过删除相应基因 而提供有效解毒的受损的输出泵。更具体地讲，所述受损的输出泵可以是Snq2(SEQ ID NO 4 禾口 5)、Pdr5 (SEQ ID NO :6 禾口 7)禾口 Yorl (SEQ ID NO :8 禾口 9)。提供了细胞，其中有缺陷的DNA途径是切除修复(BER)途径。DNA修复途径中的缺 陷可以由MAG1(SEQ ID N0:10和11)的失活引起，并且调节元件可包括酵母RAM4启动子 (SEQ ID NO :1)。在本发明的另一方面，提供了细胞，其中除了调节元件外重组载体还包括编码报 告蛋白的DNA序列。所述报告蛋白可以是酶。更具体地，所述报告酶可以是半乳糖苷 酶(SEQ ID NO 2 和 SEQ IDNO 3)。在本发明的另一方面，提供了包含图1的重组载体或其功能衍生物的细胞。所述 细胞可以是诸如酿酒酵母的酵母细胞。更具体地讲酿酒酵母细胞是SKAM4细胞，所述SKAM4 细胞-具有受损的输出泵Snq2、Pdr5和^rl活性；-具有BERDNA修复途径中的由MA Gl失活所引起的缺陷，以及-具有重组载体序列，其中RAM4调节元件可操作地连接于β-半乳糖苷酶基因。雷敏德股份有限公司(ReMynd NV)于2008年7月16日将上述SKAM4细胞保存于 比利时协调微生物保藏中心(Belgian Coordinatedcollections of Microorganisms)并 收到保藏号IHEM 22765。在本发明的另一个方面，提供了一种制备SKAM4细胞的方法，包括以下步骤-删除输出泵，-制备RAD54-β -半乳糖苷酶重组载体，-将RAD54_i3-半乳糖苷酶重组载体整合入酵母基因组，以及-使MAGl 失活。在本发明的另一方面，提供了检测引起或加重DNA损伤的制剂的存在的方法，该 方法包括使细胞和制剂接触并监测基因表达，其中报告基因表达的增加表明该制剂引起或 加重DNA损伤。更具体地，提供了检测引起或加重DNA损伤的制剂的存在的方法，该方法包 括使细胞和制剂接触并监测报告蛋白的活性，其中报告蛋白活性的增加表明该制剂引起或 加重DNA损伤。该方法可包括以下步骤-制备指数生长期的酵母细胞，-加入待检测的制剂，-孵育细胞，并-监测报告基因的表达或报告蛋白的活性。制剂可以是辐射、自由基、化学品、生物制品、环境样本、候选药物、食品添加剂或化妆品。在本发明的另一方面，该方法中的报告蛋白是酶，更具体地，报告蛋白是半乳 糖苷酶。在本发明的另一方面，通过向细胞培养物中添加包含β -半乳糖苷酶底物的裂解 缓冲液而测定报告蛋白的活性，其中所述底物直接或间接地被转化成发光产物。在具体 实施例中，半乳糖苷酶底物由可被半乳糖苷酶切割成萤光素和半乳糖的D-萤光 素-O-B-吡喃半乳糖(BetaGlo )组成。萤光素可用在萤火虫萤光素酶反应中以产生光。 裂解缓冲液可包含β-半乳糖苷酶底物和萤火虫萤光素酶，并且细胞的裂解和报告蛋白活 性的监测可在一个步骤中进行。 在本发明的另一方面，所述方法进一步的特征在于其包括在使所述细胞和所述制 剂接触之前向细胞培养物添加S9提取物的步骤。这种肝提取物允许模拟检测制剂的代谢 以及通过肝代谢活性向DNA损伤剂的可能转化。本发明的另一方面提供了基于原核的基因毒性筛选与本文所述方法的结合。本发明的另一方面涉及将本发明的细胞用在鉴别引起或加重DNA损伤的制剂的 方法中，或涉及将本发明的细胞用在鉴别断裂剂(clastogen)的方法中。在本发明的最后一个方面提供了包含本发明的细胞的试剂盒。


图 1 :212T(I)-pRAD54/@GAL(FS-SK2)质粒图2 使用甲磺酸甲酯的Radarscreen试验结果。对于参考化合物的图(图2至 图13)的解释，参见实施例3f。图3 使用丝裂霉素C的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图4 使用4-硝基喹啉-氧化物的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色 未使用S9。图5 使用萘啶酮酸的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图6 使用苯并(a)芘的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图7 使用溴化乙锭的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图8 使用顺钼的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图9 使用2-氨基芴的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图10 使用环磷酰胺的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图11 使用2-氨基蒽的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图12 使用甲基紫精的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图13 使用利福平的Radarscreen试验结果。黑色使用S9，灰色未使用S9。图14 具有Raderscreen试验中参考化合物的结果的表4。对于表4 (图14)的解 释，参见实施例3f。
具体实施例方式定义通过“DNA损伤”我们是指细胞中DNA分子的任何变化、改变或重排。
通过“DNA修复”或“DNA修复途径”我们是指为恢复DNA的完整性而给出的过程 或途径。这种过程或途径可用于检测对细胞中DNA分子的损伤。通过“断裂剂”我们是指引起染色体断裂从而使得染色体区段被删除、添加或重排 的制剂。通过“致癌物质”我们是指与癌症的促成有关的任何制剂。通过“重组载体”我们是指带有选择标记基因的DNA分子，其作为附加体质粒或基 因组中的整合片段可在一个或多个宿主细胞(例如大肠杆菌和酵母)中繁殖，而且其也可 以携带可衍生自不同物种并对其繁殖不是必需的另外的DNA片段。通过“调节元件”我们是指调节可以与其相关的基因的转录的DNA序列。通过“可操作地连接”我们是指调节元件能够调节报告蛋白的转录。通过“报告基因”我们是指编码蛋白质的基因，其中该蛋白质的表达可由调节元件 进行调节。通过“报告蛋白”我们是指由报告基因所编码的蛋白质，可以借助于适当的试验程 序量化其水平。通过〃 212T (I) -pRAD54/ β GAL(FS-SK2)质粒〃我们是指本说明书的图1中示出 的重组载体，其可以整合入酵母基因组。通过〃 SKAM4"我们是指通过遗传修饰W303-1A菌株而构建的酵母菌株(Thomas B.J.等人，Cell 56 :619-630,1989)，方式是删除编码外排泵的基因和DNA修复基因，转化 并随后与含有可操作地连接至β -半乳糖苷酶基因的RAM4启动子的线性重组载体整合； 并且该酵母菌株保藏于比利时协调微生物保藏中心，保藏号是IHEM 22765。通过“S9提取物”我们是指含有细胞色素Ρ450酶的肝微粒体组分。本发明的实施方式本发明的方法提供一种新型的成本效益好的基因毒性筛选，其可用于提供预调节 筛选试验，该预调节筛选试验在制药工业和其它大量化合物需要检测的应用中使用。该基 因毒性筛选提供高通量和低化合物消耗并且对广谱的诱变剂，尤其是断裂剂极其敏感。本发明的染色体畸变检测适用于评估制剂是否可引起DNA损伤。当评估人和DNA 损伤剂接触是否安全时，其对于检测引起DNA损伤的制剂特别有用。比如，该方法可用作试 验以筛选已知的制剂，诸如辐射、自由基、化学品、生物制品、候选药物、食品添加剂或化妆 品是否诱发DNA损伤。作为另外一种选择，本发明的该方法可用来监测水源或污染土壤被 含有DNA损伤剂的污染物污染的情况。本发明的筛选方法同样可用于评估制剂是否会加重DNA损伤。例如，某些制剂会 通过抑制DNA修复(比如通过阻止修复蛋白的表达或功能)引起DNA损伤的积聚而不直接 造成DNA损伤。这些制剂通常被称为共诱变剂(co-mutagen)。因此，在本发明的第一方面，提供了包括调节元件的真核细胞，该调节元件被设置 为调节报告蛋白响应于DNA损伤的表达，其中所述细胞的特征在于其在DNA修复途径中是 有缺陷的。在具体的实施方式中，细胞包括重组载体，其中调节元件可操作地连接于报告基 因。用在本发明的一个方面的细胞中的载体骨架可包括本领域技术人员已知的任何 合适的载体骨架，其可用于携带报告蛋白和调节元件。本发明的重组载体例如可以是质粒、
8粘粒或病毒载体。当复制DNA分子时这种重组载体非常有用。此外，重组载体也对用DNA 转化细胞非常有用。骨架可包括低拷贝数的质粒、高拷贝数的质粒或整合载体。骨架可优选地选自 熟知的载体 YCplac22、Y印lacll2、YIplac204、Ylplac211、Ulplacl28、pRS303、pRS304、 pRS305、pJW212T(BBA1762(2006)312-318)或 pRS306(R. Daniel Gietz and Akio Sugino, New yeast-escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitromutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Laboratory of Molecular Genetics. National institute of environmentalhealth sciences, research triangle park, NC, 277709. Gene (1988) 527-534)。如下文的实例所提供，在具体的实施方式中，骨架 由质粒PJW212T构成。在制药工业中，在实验室中对新型化合物进行基因毒性筛选时重组载体特别有 用。应当理解，由于立法涉及到经遗传修饰的生物的使用，因此尤其优选载体仅用在封闭的 环境中，而不将其释放到环境中。可对重组载体进行设计从而使得其可以在细胞核中自主复制。在这种情况下，诱 导DNA复制的元件在重组载体中是必需的。因此，对于酵母来说，优选地，载体可包括复制 起点。对本领域的技术人员来说合适的复制起点是已知的。例如，来自酵母的合适元件是 来自酵母染色体DNA的酵母2mm质粒DNA复制起点或ARS (自主复制序列)。这种复制载体 可在转化体细胞中产生DNA分子的多个拷贝，并因此在需要过表达报告蛋白时是有用的。 YCplac和YEplac载体依靠与着丝粒序列结合的ARS或2u质粒DNA复制起点，并且限制为 在每个细胞中有一个拷贝。转化体细胞将是依据本发明的细胞。作为自主复制载体的替代，可对重组载体进行设计以便使载体和DNA分子整合入 宿主细胞的染色体。与复制的质粒相比，这种整合的优点是稳定性高。在这种情况下，优选 靶向整合(例如，通过同源重组)的DNA序列是理想的。例如，并入酿酒酵母染色体IV的 HO基因片段的重组载体有利于酿酒酵母或由其衍生的细胞系的靶向整合。也可以将整合载 体的多个拷贝整合入宿主细胞的基因组。这将实现更高的表达并甚至进一步增加报告蛋白 的信号输出。重组载体可以包括至少一个可选择标记以允许选择经载体转染的细胞，且优选地 允许选择具有重组载体的细胞，该重组载体并入第一方面的DNA分子。合适的可选择标记 的例子包括对诸如卡那霉素、氨苄青霉素等的抗生素赋予抵抗力的基因。作为另外一种选 择或另外，可选择标记可包括营养缺陷标记，即恢复原养型的那些，例如，酵母URA3、HIS3、 TRPl或LEU2基因，特别是URA3。编码报告蛋白的DNA序列可编码任何可被量化的蛋白质。然而，优选的是DNA序 列编码酶。优选的编码酶的DNA序列是半乳糖苷酶的基因。用在本文中的半乳糖 苷酶包括酿酒酵母酶，该酿酒酵母酶由具有由SEQ ID NO :2所表示的核酸序列的基因编码， 但其旨在包括等位基因变体及其含有保守或非保守变化的生物活性片段，以及任何基本相 同的核酸分子，即其与编码酿酒酵母β -半乳糖苷酶(SEQID NO 2)的核酸分子70%、75%、 80%,85%,87%,89%,90%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。上述基因编码具有由SEQ ID NO :3所表示的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶，但 其旨在包括等位基因变体及其含有保守或非保守变化的生物活性片段，以及基本上相同的人工合成蛋白质，即其与 SEQ IDNO 370%,75%,80%,85%,87%,89%,90%,92%,93%, 94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。通过向细胞培养物中添加半乳糖苷酶底物而测量报告蛋白的报告活性。具体 的底物是D-萤光素-O-B-吡喃半乳糖苷，任选地进一步包括萤光素酶，由于其不是细胞通 透性的，所以萤光素酶必须加入到裂解缓冲液中。这种底物被半乳糖苷酶切割为萤光 素和半乳糖。然后萤光素用在萤火虫萤光素酶反应中以产生光。由于测量简单并且酶报告蛋白与萤光素酶反应的结合使得DNA损伤信号被放大， 因此半乳糖苷酶可用作报告蛋白。当DAN损伤发生时，优选地，重组DNA分子的调节元件激活报告蛋白的表达。这种 调节元件理想地包括启动子序列，该启动子将RNA聚合酶调动到开放读码框的起始密码子 的DNA附近，并开始转录编码报告蛋白的DNA。调节元件也可以包括其它诸如用于核糖体结 合的翻译初始序列的功能DNA序列，或结合促进DNA损伤后的基因表达的转录因子的DNA 序列。调节元件甚至可以编码蛋白质，该蛋白质作用以从调节的基因中驱逐转录抑制剂并 从而增强该基因的转录。优选的调节元件是与DNA修复蛋白的表达的调节天然相关的DNA序列。比如，来 自酵母基因的调节元件可用于制备存在于本发明的细胞中的重组DNA分子，上述酵母基因 是诸如但不限于 RAD2、RAD6、RAD7、RAD18、RAD23、RAD51、RAD52、RAD54、CDC7、CDC8、CDC9、 MAGI、PHRU DINT、DDR48和UB14。因此，用在本发明方法中的调节元件可包括来自酵母的 基因，诸如 RAD6、RAD7、RAD18、RAD23、RAD51、RAD52、RAD54、CDC7、CDC8、CDC9、MAGl、PHRl、 DINT、DDR48 或 1JB14。优选的调节元件包括启动子和RAM4修复基因的5'调节序列。这种调节元件可 来自酵母并优选地来自酿酒酵母。在本文中使用RAM4基因，尤其包括具有由SEQ ID NO 1所表示的核酸序列的酿酒酵母RAM4启动子，但其旨在包括等位基因变体及其含有保守 或非保守变化的生物活性片段，以及任何基本相同的核酸分子，即其与编码酿酒酵母RAM4 启动子(SEQ ID NO :1)的核酸分子 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、 94%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。因此，大多数优选的重组DNA分子包括如本文所定义的RAM4调节元件，其可操作 地连接于编码酶的DNA序列。因此，在本发明的一个实施方式中，优选的重组载体包括可操 作地连接于β-半乳糖苷酶基因的RAM4基因。优选的载体可包括可操作地连接于β-半乳糖苷酶基因的RAM4调节元件和适于 整合入靶细胞的基因组的核苷酸序列。促进靶向整合入基因组并且可并入重组载体的其它DNA序列包括来自酿酒酵母 核糖体DNA阵列的序列。这类rDNA序列促进向酿酒酵母的染色体XII或向衍生自酿酒酵 母的细胞系的靶向整合。因此优选的载体可包括可操作地连接于β-半乳糖苷酶基因的RAM4调节元件和 适于整合入靶细胞基因组的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可以是rDNA序列。优选的重组载体是图1所示的212T (I)-pRAD54/β GAL(FS-SD)质粒。根据本发明的一方面，重组载体并入细胞。这类宿主细胞可以是真核的。优选的 宿主细胞为诸如酿酒酵母的酵母细胞。优选酵母是因为它们像细菌一样可易于处理但它们是真核的，因此具有相对于细菌而言与人类更加紧密相关的DNA修复系统。通过遗传修饰W303-1A菌株而构建优选的酵母菌株(Thomas B. J等人，Cell 56 619-630，1989)，方式是破坏外排泵和DNA修复基因、转化以及随后与线性化的重组载体整 合，该线性化的重组载体包含可操作地连接于报告基因的调节元件。提供了具有改变的表型的细胞，其包括更具渗透性的细胞膜和通常通过删除相应 基因而提供有效解毒的受损的输出泵。更具体地讲，所述受损的外排泵选自Snq2 (SEQ ID NO 4 和 5)、Pdr5 (SEQ ID NO :6 和 7)和 Yorl (SEQ ID NO :8 和 9)。因此，在本发明的一方 面，具有改变的表型的细胞，即，酵母细胞的特征在于具有至少一个，特别是二个或三个选 自 Snq2 (SEQ ID NO :4 和 5)、Pdr5 (SEQ ID NO :6 和 7)和 Yorl (SEQ ID NO :8 和 9)的受损 的输出泵。如本文所用，编码上述外排泵，即Snq2 (SEQ ID NO :4)、Pdr5 (SEQ ID NO :6)和 YorKSEQ ID NO :8)的核酸序列旨在包括等位基因变体及其含有保守或非保守变化的生物 活性片段，以及任何基本上相同的核酸分子，即其与上述编码输出泵的多核苷酸的任一个 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同。同样，上述外排泵蛋白质，即 Snq2 (SEQ ID NO :5)、Pdr5 (SEQID NO 7)和 Yorl (SEQ ID NO 9)旨在包括等位基因变体及其含有保守或非保守变化的生物活性片段，以及基本 相同的人工合成蛋白质，即其与上述输出泵蛋白质的任一个70^^75^^80^^85%,87%、 89%,90%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。根据本发明，具有改变的表型的细胞的受损DNA修复途径可以是NER、BER或重组 修复途径中的任一个，并且通常通过所述DNA修复途径中一个或多个基因的失活而实现。BER途径中失活的基因可以是MAG1、APN1或APN2基因。NER途径中失活的基因可 以是RAD2基因。重组修复途径中失活的基因可以是RAD50或RAD52基因。在本发明优选的实施方式中，本发明的具有改变的表型的细胞中的受损DNA修复 途径包括BER途径或NER途径，更特别是BER途径。BER途径中优选的失活基因是MAGl基 因。NER途径中优选的基因是RAD2基因。如本文所用MAGl基因，尤其包括具有由SEQ IDNO 10所表示的核酸序列的酿酒酵母MAGl基因，但其旨在包括等位基因变体及其含有保守或 非保守变化的生物活性片段，以及任何基本上相同的核酸分子，即其与编码酿酒酵母RAM4 启动子(SEQ IDNO 10)的核酸分子 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同。同样，MA Gl蛋白质(SEQ ID NO=Il)旨在包括等位基因变体及其含有保守或非 保守变化的生物活性片段，以及基本相同的人工合成蛋白质，即其与具有SEQ ID N0:11的 酿酒酵母 MA Gl 蛋白质 70%、75%、80%、85%、87%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或 99%相同。更优选的酵母菌株是修饰的W303-1A菌株-具有删除的外排泵；-具有至少一个失活DNA修复途径；-包括含有可操作地连接于报告基因的RAM4调节元件的线性化重组载体。本发明优选的酵母细胞具有BER途径的失活。
最优选的酵母细胞是SKAM4细胞，其中-输出泵Snq2、Pdr5和Yorl的活性受损；-在BERDNA修复途径中具有由MAGl失活引起的缺陷；以及-包括重组载体，其中RAM4调节元件可操作地连接于β-半乳糖苷酶基因。根据本发明的一方面，使转化细胞的DNA修复途径中的一个失活。失活的DNA修 复途径可以是NER、BER或重组修复途径。本发明优选的酵母细胞具有BER途径的失活。BER途径中失活的基因可以是MAGl、APm或ΑΡΝ2基因。NER途径中失活的基因可 以是RAD2基因。重组修复途径中失活的基因可以是RAD50或RAD52基因。BER途径中优选的失活基因是MAGl基因。NER途径中优选的基因是RAD2基因。可对上述外排泵或上述DNA修复途径中的失活基因进行突变或删除或降低其相 应的mRNA水平。失活的蛋白质可以是非功能性的或不表达的。通过表达下调造成的失活可以包括但不限于例如，反义RNA分子、核酶和小干扰 RNA(RNAi)分子。本发明的反义核酸分子是在细胞条件下特异性杂交(例如结合)至编码DNA修 复蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA的那些，方式是例如通过抑制转录和/或翻译来抑 制DNA修复蛋白的表达。该结合可以通过常规的碱基对互补，或例如在与DNA双链结合的 情况下，通过双螺旋的大沟中的特定相互作用来实现。设计反义分子的方法对本领域的技 术人员来说是熟知的。构建在反义治疗中有用的寡聚物的一般方法已经进行了评论，例如， 由 Van der Krol 等人，(1988) Biotechniques 6 :958_976、Mein 等人，(1988) Cancer Res 48 :2659-2668 以及 Narayanan，R.禾口 Aktar， S. (1996) =Antisense therapy. Curr. Opin. Oncol. 8 (6) :509-15.作为非限制性实例，反义寡核苷酸可靶向与下列区域杂交mRNA帽 区、翻译起始位点、翻译终止位点、转录起始位点、转录终止位点、多腺苷化信号、3'非翻译 区、5'非翻译区、5'编码区、中间编码区和3'编码区。反义构建体例如可作为表达质粒被递送，当在细胞中转录时产生与编码修复基因 产物的细胞mRNA的至少唯一部分互补的RNA。或者，反义构建体可表现为体外产生的寡核 苷酸探针的形式，当被引入表达修复基因的细胞时，该寡核苷酸探针通过与mRNA和/或编 码修复基因的基因组序列杂交而产生对相应基因的选择性抑制。这种寡核苷酸探针优选 为修饰的寡核苷酸，其对诸如核酸外切酶和/或核酸内切酶的内源性核酸酶有抵抗力，因 此在体内稳定。就反义DNA而言，衍生自编码修复基因的核苷酸序列的翻译起始位点(例 如，-10和+10之间的区域)的寡脱氧核苷酸是优选的。反义分子可以被递送到体内表达修复基因的细胞内。已经开发了许多将反义DNA 或RNA递送至细胞内的方法，并且这些方法在本领域是熟知的。由于反义分子的细胞内浓 度要达到足以抑制内源性mRNA的翻译通常是困难的，因此优选的方法是利用重组DNA构建 体，其中反义寡核苷酸被置于强启动子的控制之下。用这样的构建体转染受试者的靶细胞 优选会导致单链RNA的转录，该单链RNA会以足够的量与编码受关注基因产物的内源性转 录物杂交以阻止各个mRNA的翻译。例如，可在体内引入载体以便使其被细胞摄入并指导反 义RNA的转录。只要其可以被转录以产生所需的反义RNA，这样的载体可保持为附加体或可 变成染色体整合的。可通过本领域标准的重组DNA技术方法构建这种载体。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其它载体，其用于在哺乳动物细胞中复制和表达。编码反义RNA的序列的表达可通过本领域已知的在哺乳动物中作用并优选在人 类细胞中起作用的任何启动子进行。这种启动子可以是可诱导的或组成型的。这种启 动子可以包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290 304-310)、包含在劳氏肉瘤病毒的3'长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人，1980， Cell 22 :787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner 等人，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :1441-1445)以及金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，Nature 296 :39-42)。核酶也可以下调修复基因产物的表达。核酶分子被设计用来催化地裂解受关注基 因的转录物，阻止其翻译为多肽。(参见例如，Sarver等人，(1990) Science 247 :1222-1225 和美国专利No. 5，093，246)。一般而言，核酶催化RNA中磷酸二酯键的位点特异性的切割或 接合。尽管在位点特异性识别序列处切割mRNA的多种形式的核酶可用来破坏修复基因的 mRNA,但优选使用锤头状核酶。锤头状和发夹状核酶是RNA分子，其通过与互补性RNA靶序 列碱基配对以及在特定位点进行切割反应而起作用。对于锤头状核酶来说，该核酶在UX 二 核苷酸之后切割，其中X可以是除鸟苷之外的任何核糖核苷酸，尽管当X是胞嘧啶时切割速 率最高。催化效率进一步受到尿苷之前的核苷酸的影响。在实际中，NUX三联密码(通常 为⑶C、⑶C或UUC)在靶mRNA中是必需的。这类靶mRNA用于设计大约12或13个核苷酸 的反义RNA，这些核苷酸包围该位点但跳过不与核酶形成常规碱基对的C。合成锤头状核酶可被工程化改造为选择性地结合和切割互补的mRNA分子，然后 释放片段，以蛋白酶的功效重复该过程。与例如不是催化的但可是化学计量的，与靶序列形 成1 1复合物的反义寡核苷酸相比，这可显示出显著的优势。本发明的锤头状酶可被设计 为6-4-5茎-环-茎的结构或适用于该目的之任何其它的结构。一般而言，由于化学切割 步骤是迅速的而释放步骤是限速的，因此如果核酶的杂交“臂”(螺旋I和III)相对较短， 比如约5或6个核苷酸，则速度和特异性提高。使用本领域技术人员已知的各种试验，可以 经验地确定具体结构设计的适用性。通过本领域已知的任何用于合成这类分子的方法可制备本发明的反义RNA和核 酶分子。这些包括用于化学合成本领域熟知的寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术， 如固相磷酰胺化学合成。作为另外一种选择，可通过在体外和体内转录编码反义RNA分子 的DNA序列产生RNA分子。这类DNA序列可被并入多种包含合适的RNA聚合酶启动子的载 体。或者，可以使用组成型地或诱导性地合成反义RNA(取决于所用的启动子)的反义cDNA 构建体。在删除或敲除中，靶基因表达是检测不到的或可忽略的。修复基因的敲除指修复 基因的功能表达显著减少以使得修复蛋白表达是检测不到的或以降低的水平存在。这可 以通过多种机制来实现，这些机制包括对编码序列引入破坏，如插入一个或多个终止密码 子、插入DNA片段等、删除或部分删除编码序列、用终止密码子取代编码序列等。在一些情 况下，最终从基因组中删除外源转基因序列，留下自然序列的净变化。可使用不同的方法 来进行“敲除”。可以诱导全部或部分自然基因的染色体删除，包括非编码区，特别是启动 子区、3'调节序列、增强子的删除，或激活修复基因表达的基因的删除。也可以通过引入 阻断自然基因表达的反义构建体来进行功能敲除(例如，参见Li和Cohen(1996)Cell 85:319-329)。“敲除”还包括条件敲除，例如通过使细胞与促进靶基因改变的物质接触而使靶 基因发生改变、在靶基因位点(例如Cre-Iox系统中的Cre)引入促进重组的酶或本领域已 知的其它方法。用于同源重组的DNA构建体将包括带有所需遗传修饰的修复基因的至少一部分， 并将包括与靶基因座同源的区域。通过同源重组而产生具有靶基因修饰的细胞的方法 在本领域是已知的。对于转染真核细胞的各种技术，参见Keown等人(1990)Methods in Enzymologyl85:527_537。本发明的另一酵母细胞可具有不止一种的失活修复基因。提供了具有改变的表型的细胞，其包括更具渗透性的细胞膜和通过删除相应基因 而提供有效解毒的受损的输出泵。更具体地讲，所述受损的输出泵可以是Snq2、Pdr5和 ^rl。根据本发明的方面，所述转化的细胞可具有改变的表型，其包括更具渗透性的细 胞膜和/或细胞壁以及提供有效解毒的受损的输出泵。如本文上面所描述，可以通过反义 RNA分子、核酶、经由同源重组的删除或通过抑制剂而获得这种改变的表型。与细胞壁的完 整性有关的基因是例如ERG6。在优选的实施方式中，受损的输出泵为Snq2、Pdr5和Yorl。尽管不排除不稳定地转化(瞬态)细胞的使用，但是用于表达由DNA分子编码的 蛋白质的宿主细胞最好是被稳定地转化。在本发明的另一个方面，提供了制备SKAM4细胞的方法，该方法包括以下步骤-删除输出泵；-制备RAD54-β -半乳糖苷酶重组载体；-将RAD54-β -半乳糖苷酶重组载体整合入酵母基因组；以及-使MAGl 失活。根据本发明的方面的遗传工程化细胞可通过实施例中描述的步骤来制备。根据本 发明的一个方面的细胞最好是诸如酵母的单细胞生物(比如上述菌株中的一种)。本发明的方法可包括使细胞(诸如SKAM4酵母细胞)与制剂接触并监测基因表 达，其中报告基因表达的增加表明该制剂引起或加重DNA损伤。本发明的方法可包括使诸 如SKAM4酵母细胞的细胞和制剂接触并监测报告蛋白的活性，其中报告蛋白活性的增加表 明该制剂引起或加重DNA损伤。根据本发明的方法，这种遗传工程化细胞可用于评估制剂是否诱发或加重DNA损 伤。响应于DAN损伤诱导半乳糖苷酶的表达。底物由半乳糖苷酶进行切割。依据 所用的底物和可能的另外的反应，可通过适当的方式(例如但不限于色度计、荧光计或光 度计)测量最终的反应产物以作为所引起的DNA损伤的指标。断裂之后，可在限定数目的完整细胞的悬浮液中或从细胞所释放的限定量的材料 来评估对DNA损伤的反应。本发明的一方面的方法对检测在低浓度下诱发DNA损伤的制剂 特别有用。该方法可用于筛选诸如辐射、自由基、化学品、生物制品、环境样本、候选药物、食 品添加剂或化妆品的制剂以评估活生物体(尤其是人)与这种制剂接触是否安全。本发明的方法可用来检测来自可疑污染点的水源或土壤样本是否被DAN损伤剂 或加重DNA损伤的制剂所污染。比如，这类方法可用来监测工业废水中污染物的存在，该污 染物可导致与污染接触的人或其它生物中DNA损伤的加重。
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本发明的方法可包括以下步骤-制备指数生长期的酵母细胞；-加入待检测的制剂；-孵育细胞；以及-监测报告基因的表达或报告蛋白的活性。本发明方法中的报告蛋白可以是酶，最优选的酶是半乳糖苷酶。通过向细胞培养物中添加含有β -半乳糖苷酶底物的裂解缓冲液而测定报告蛋 白的活性，其中底物被直接或间接地转化为可测的产物，诸如但不限于有色产物、化学发光 产物或荧光产物。β -半乳糖苷酶可将β -半乳糖苷酶底物切割成例如萤光素和半乳糖，其中萤光 素然后被用在萤火虫萤光素酶反应中以产生光。在本发明的方法中，裂解缓冲液可含有β-半乳糖苷酶底物和萤火虫萤光素酶， 并且细胞的裂解和报告蛋白活性的监测可以在一个步骤中进行。当开始实验时，指数生长中的酵母细胞优选地具有1至3之间的密度。可以使用 不同类型的多孔板，优选使用96孔板。制剂可以不同的浓度加入。多孔板的孵育可在1小 时至12小时之间完成，优选为6小时。孵育温度应该在20°C和37°C之间，优选在30°C。可以使用适当的不同裂解缓冲液，优选Beta-Glo 细胞裂解缓冲液。 Beta-Glo 细胞裂解缓冲液含有β -半乳糖苷酶底物和用于萤光素酶反应所有必需的 因子。可向裂解缓冲液中加入不同的β -半乳糖苷酶底物，诸如但不限于 -Galacton 、Galacton-start 或Galacton-plus -萤光素二-β-D-吡喃型半乳糖、试卤灵β-D-吡喃型半乳糖、甲基伞形酮 酰- β -D-吡喃型半乳糖、4-甲基伞形酮酰- β -D-吡喃型半乳糖、萤光素二(β -D-吡喃型 半乳糖)-邻-硝基苯-β -D-吡喃型半乳糖、氯酚红(chlorofenol red)-β-D-吡喃型半 乳糖或D-萤光素-ο- β -吡喃型半乳糖。优选地，底物是D-萤光素-ο- β -吡喃型半乳糖。在孵育的开始和结束，通过在595nm下用分光光度法测定浊度而确定细胞的数 量。加入例如底物之后，用发光仪测量产生的光。针对细胞密度校正发光信号。用样本发 光值除以参考发光值来计算标准发光值。在本发明的方法中制剂可被代谢。可通过在酵母报告菌株中表达各个哺乳动物酶 而完成被测制剂的代谢。作为另外一种选择，存在于后线粒体(post mitochandriaDsg提 取物并包括微粒体的哺乳动物肝脏酶可加入本发明的方法中。因此可用附加的步骤进行如上描述的方法，其中在待测制剂加入之前将S9提取 物加入到细胞中。S9提取物是含有细胞色素P450酶的肝微粒体组分。所以本发明的方法的进一步特征在于其包括在使所述细胞和所述制剂接触之前 向细胞培养物中添加S9提取物的步骤。诸如例如Vitotox 的基于原核的基因毒性筛选对诱变化合物的检测非常灵敏。 本发明在检测致畸变和致癌化合物方面非常灵敏。当基于原核的基因毒性筛选与本发明结 合时，将以非常灵敏的方式检测全部范围的DNA损伤剂。
因此本发明另一方面是基于原核的基因毒性筛选和本发明方法的结合。本发明还包括在鉴定引起或加重DNA损伤的制剂的方法中使用本发明的细胞，而 且更具体地，包括在鉴定断裂剂的方法中使用细胞。可将本文描述的制剂和细胞包装进试剂盒。因此，在第一容器中可存在一种或多 种制剂，而且试剂盒可任选地在第二容器中包括一种或多种制剂。试剂盒可包括描述本发 明方法的说明书。制剂、细胞、容器和/或说明书可存在于包装内。试剂盒的内容物可包含但不限于冷冻的细胞、生长培养基、缓冲液、多孔板、S9提 取物+辅因子、酶底物、参考化合物等。实验部分实施例1 :S9提取物的制备从成年雄性Wi star大鼠制备S9提取物。对大鼠腹膜内注射Aroclor 1254 (500mg/ kg体重)在玉米油中的溶液(20% w/v)。五天后，大鼠被断颈处死。将肝在搅拌机中切碎并 用波特勻浆器(potterhomogenizer)在3倍体积的磷酸盐缓冲液中均浆。将勻浆物在9000g 下离心15分钟。将上清液(S9组分)转移到保存在液氮中的无菌安瓿(sterile ampule) 中。实施例2 :SKAM4菌株的构津酵母菌株SKAM4具有整合在URA3基因座的β -半乳糖苷酶基因(其在RAM4启 动子的转录控制下)。另外，编码外排泵(Snq2、Pdr5*^rl)的基因和编码涉及DNA修复 的蛋白质的基因(Magl)被删除。实施例加=SPY菌株的构建菌株 W303-1A (参见B. J. Thomas, R. Rothstein, Elevatedrecombination rates in transcriptional active DNA, Cell 56 (1989) 619-630)用于通过同源重组删除 SNQ2。使用引物SNQ2F和SNQ2R以及使用酵母snq2: KanMX删除菌株(Euroscarf Acc. NO.Y03951)的基因组DNA作为模板生成PCR片段。该片段转化进入W303-1A细胞，并在合 适的含有抗生素G418的固体生长培养基上选择转化株。这样得到了菌株W3_dS。接下来，用引物PDR5F1和PDR5R以及适当的携带HIS3基因的质粒(酿酒酵母) 作为模板生成PCR片段。该片段转化进入菌株W3_dS，并在合适的缺乏组氨酸的固体生长培 养基上选择转化株。这样得到了菌株W3_dSP。接下来，用引物Y0RF1和Y0R1R以及合适的携带TRPl基因的质粒(酿酒酵母)作 为模板来生成PCR片段。该片段转化进入菌株W3_dSP，并在合适的缺乏色氨酸的固体生长 培养基上选择转化株。这样得到了菌株W3_dSPY。实施例2b 质粒 212T(I)-pRAD54/0 GAL(FS-SK2)的构建用XbaI切割质粒pJW212T(BBA 1762 (2006) 312-318)，并且将载体骨架连接到称 为pXY212T(I)的环形质粒。随后，将含有β-半乳糖苷酶基因的DNA片段克隆(用限制酶 BamHI 和 MuI)进入 ρΧΥ212Τ (I)，得到质粒 212Τ (I)-LacZ。用引物RAM4P_R 以及酵母(酿酒酵母)基因组DNA作为模板通过PCR生成含有RAM4启动子的DNA片段， 并将该片段克隆(使用限制酶BamHI和NgoMVI)进入质粒212T (I)-LacZ。这样得到了质粒 212T (I) -pRAD54/ β GAL (FS-SK2)，其包含RAM4启动子和β -半乳糖苷酶基因的功能性融合。
实施例2c 质粒 212T (I) -pRAD54/ β GAL (FS-SK2)整合入 W3_dSPY用SbfI切割质粒2121(1)- 肌054/0 641^尔5-51(2)，并随后转化到菌株13_(15卩￥。 在合适的缺乏尿嘧啶的固体生长培养基上选择转化株。这样得到了菌株SK2A3。实施例2d 菌株SK2A3中Magl的删除然后，用引物MAG1/Leu2-Fl和MAG1/Leu2-Rl以及适当的携带LEU2基因的质粒 (酿酒酵母)作为模板生成PCR片段。该片段转化进入SK2A3细胞，并且在合适的缺乏亮氨 酸的固体生长培养基上选择转化株。这样得到了菌株SKAM4。基因型SKAM4 MATa leu2_3/112 ura3_l trpl-92 his3_ll，15 ade2-lcanl_100s nq2::kanMX4pdr5::HIS3yorl::TRP1 ura3::URA3/pRAD54-β GAL magi::LEU2。在实施例2a、2b和2d中所用的引物序列SNQ2F5' -CCGCCCATTTCCGTTTAAATCCG-3‘SNQ2R5' -TTTTCCTGTGTCCAATTTTTTTATTTTC-3'YORFl5' -AAAAGATTAATATTACTGTTTTTATATTCAAAAAGAGTAAAGCCGTTGCTATATACGAATCAGATTTTATGTTTAGATCTTTTATGCTT-3‘YORlR5' -GTACCATCGGCAACATATAAATAAATAAAAGAGAAAAATCATGCAACAAATAATATAAATGAGGGCCAAGAGGGAGGGCAT-3‘PDR5F15' -AAGAAATTAAAGACCCTTTTAAGTTTTCGTATCCGCTCGTTCGAAAGACTTTAGACAAAAGAGTGCACCATAATTCCGTTTTAAGA-3‘PDR5R5' -ATGTTTATTAAAAAAGTCCATCTTGGTAAGTTTCTTTTCTTAACCAAATTCAAAATTCTATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTT-3‘RAD54P_F5' -TGGTACCGGGCCGGCTGCGCTACGGTTCCTGCCGCTC-3'RAD54P_R5' -GTACCCGGGGATCCATGCATCAGTTATAAGGAAATATATATGGTACC-3‘MAG1/Leu2-Fl5 ‘ -TAAGTTATCTATGAATCAATGAGAATTGGCCACTGCCCTCTGATATGACGATGGAAGTGGGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC-3‘MAG1/Leu2-Rl5 ‘ -CCCTACGAGAAGCTGTAAATATGAATTTCTTTAGTAGGCATCACACACAACAATAGGGTGGGTCCGGTTAAACGGATCTCGCATTGATGAGGCAAC实施例3 具有发光和S9代谢活化的Radarscreen试验实施例3a:原理
酵母菌株SKAM4携带RAD54-LacZ报告构建体，该报告构建体对影响其基因组DNA 完整性的制剂敏感。供给在生长培养基中的化合物可以通过确定它们对报告基因表达的影 响而评估其基因毒性。通过向酵母培养物中加入含有β-半乳糖苷酶底物的Beta-Glo 细胞裂解缓冲液而测定报告活性。β-半乳糖苷酶将底物切割成萤光素和半乳糖。萤光素 然后用在萤光素酶反应中以产生光。通过加入后线粒体上清液S9来实现化合物的代谢活 化。实施例北设备和产物设备酶标仪:Multiskan Ascent 型号 354(ThermoLabsystems)微孑L板摇床Titramax 101 (Heidolph Instruments)微量滴定板盖聚苯乙烯、无菌(Greiner =#656161)96孔微孔板聚苯乙烯细胞培养物μ透明白色(Greiner =#655098)酶标仪发光infinite M20(yTecan产物BAP (苯并[A]芘)适当时每孔加入2 μ 1 BAP (500 μ g/ml)
Beta-Glo 检测系统目录编号E4740 (promega) IOOml裂解缓冲液在-20°C下以IOml的份保存后线粒体S9 提取物 Trinova Biochem (Moltox of Notox) (#11-101. 8) 8ml 提取物 在-80°C下以400 μ 1的份保存葡萄糖-6-磷酸Sigma (#G6526)-IgNADP Sigma(#N5755_250MG)KP04Sigma(#P3786_100G)MgCl2 六水合物 VWR (#1. 05833. 0250)酵母生长培养基=SC-URA (液体/固体)将下列组分溶于蒸馏水-0. 77g/l CSM-URA(MP biomedicals#4511_222)-用于生物化学的5g/l 的硫酸铵(Fw 132, 14) (Merck #1. 01211. 1000)-1. 7g/l酵母氮源W/0硫酸铵&氨基酸(Remel =#459932 ；由Oxoid发行)-0. 05g/l 腺嘌呤(6-氨基嘌呤，Fw :135. 1) (MP biomedicals#4060_012)在120°C下高压蒸汽灭菌的溶液20分钟。加入2%D(+)_葡萄糖-一水合物(50ml/ 1来自40%的蒸馏水高压蒸汽灭菌的溶液)(Merck #1. 08342. 2500，Fw :196. 17)。作为另 外一种选择，立即加入D (+)-葡萄糖-一水合物并且采用过滤方法对溶液消毒。将培养基 在室温下存储。在固体培养基的情况下，消毒前在溶液中加入2%琼脂(Oxoid :#LP0011)，并用4M NaOH 将 pH 调至Ij 6. 5。实施例3c 方法从-80°C用SKAM4细胞贮液配制平板培养物。该平板可储存+/_2个月。在100ml锥形瓶(erlenmeyer)中的50ml培养基中接种来自平板培养物的少量细 胞，并在30°C，200rpm下过夜生长，从而制得菌株SKAM4的液体贮液培养物。该培养物可以
18在4°C下储存并可在至少1到2周用于随后的实验。第一天把5、10、20、40、80μ 1贮液培养物接种到50ml培养基中，在30°C，200rpm下过夜 生长。目的是在第二天得到具有约1至3的OD595的至少一种培养物。第二天制备使用和未使用S9的S9-混合物。以下给出一个微量滴定板所需的毫升数
权利要求
1.一种真核细胞，其特征在于-存在重组载体，其中RAM4调节元件可操作地连接于报告蛋白； -有缺陷的碱基切除修复(BER)途径；以及 -受损或降低的输出泵活性。
2.根据权利要求1所述的真核细胞，其中所述重组载体被整合入基因组。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的真核细胞，其中所述输出泵是Snq2、Pdr5和 ^rl。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的真核细胞，其中所述报告蛋白是β-半乳糖苷酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的真核细胞，其中所述重组载体是图1的载体或 其功能衍生物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞，特别 地，所述酵母细胞是SKAM4细胞，所述SKAM4细胞-具有重组载体序列，其中所述RAM4调节元件可操作地连接于报告蛋白； -在BER DNA修复途径中具有由MAGl的失活所引起的缺陷；以及 -具有受损的输出泵Snq2、Pdr5和^rl活性。
7.一种用于制备权利要求1至6中所定义的细胞的方法，其包括以下步骤 -制备RAD54-报告基因重组载体；-将所述RAD54-报告基因重组载体整合入基因组中； -使所述BER途径失活； -删除所述输出泵。
8.一种包括使根据权利要求1至6中任一项的细胞与制剂接触并监测所述报告蛋白的 活性的方法，其中报告基因表达和/或报告蛋白活性的增加表明所述制剂引起或加重DNA 损伤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括以下步骤 -制备指数生长期的酵母细胞；-加入待测制剂； -孵育所述细胞；以及-监测所述报告基因的表达或所述报告蛋白的活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过向细胞培养物中加入含有半乳糖苷酶 底物的裂解缓冲液而测定所述报告蛋白的活性，其中所述底物直接或间接地转化为发光产 物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶底物被β-半乳糖苷酶切 割成萤光素和半乳糖，并且其中所述萤光素然后用在萤火虫萤光素酶反应中以产生光。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含半乳糖苷酶底物和萤 火虫萤光素酶，并且所述细胞的裂解和所述报告蛋白活性的监测在一个步骤中进行。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，进一步的特征在于其包括在使所述细 胞与所述制剂接触之前向细胞培养物中添加S9提取物的步骤。
14.基于原核的基因毒性筛选与根据权利要求7至12中任一项所述的方法的结合。
15. 一种包含权利要求1至6中任一项所定义的细胞的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及用于检测引起或加重DNA损伤的制剂的改进方法，并涉及可有效地用在该等方法中的经遗传转化的细胞。
文档编号C12N5/00GK102124099SQ200980131715
公开日2011年7月13日 申请日期2009年8月13日 优先权日2008年8月14日
发明者A·劳维斯, G·J·格里费恩, H·R·杜哈梅尔, N·梵达梅 申请人:雷敏德股份有限公司