专利名称：能够区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基的制作方法
能够区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基本发明总体上涉及微生物分析领域。更具体地，本发明涉及用于生长、检 测、鉴定和/或计数葡萄球菌的选择性培养基，该培养基允许区分金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)与凝固酶阴性葡萄球菌。葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌或者葡萄球菌是许多医院感染的原因，并 代表了重要的医院难题。这些细菌都是革兰氏阳性球菌(cocci)，其通过引发血浆凝固 的蛋白凝固酶的产生的区别而分为两大类。因此存在凝固酶阴性葡萄球菌与凝固酶阳 性葡萄球菌的区分，凝固酶阴性葡萄球菌的主要代表是表皮葡萄球菌(Staphylococcus 印idermidis)，凝固酶阳性葡萄球菌的主要代表是以致病力著称的金黄色葡萄球菌。葡萄 球菌广泛存在于环境以及人和动物的皮肤和粘膜中。规律地从这些宿主脱落使得它们广泛 分布于自然界中(水、土壤、空气、食品、物体)，医院环境要求严格的卫生措施和隔离病人 来限制表皮菌株的散播。因此，金黄色葡萄球菌代表了 80%至90%临床环境下分离的葡萄 球菌，是引起许多医院环境感染的主要人病原体，这些感染例如著名的医院性肺炎、外科伤 口感染、烧伤感染、异物感染(心脏瓣膜、髋假体、夹具等)以及全身性感染或败血病，它们 通常归咎于使用血管内导管或者其他感染部位的细菌散播。葡萄球菌，尤其是金黄色葡萄球菌在食品领域也形成相当的危害。事实上，金黄色 葡萄球菌的某些菌株能产生肠毒素，消费者摄入之后会导致中毒，引起恶心、腹痛，尤为严 重的是反复呕吐，常伴随腹泻。因此，葡萄球菌食物中毒代表了一种细菌来源的食物中毒的主要形式。通常通过动物和人，无论是病人或健康携带者，通过未消毒奶(乳腺炎)，通过空 气和污染的表面或者接触了食物和健康或感染的携带者的设备来散播。因此，食物中葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌的检测和鉴定构成了主要的公共卫 生挑战。在用于检测、鉴定和计数葡萄球菌属细菌的培养基中，分为非选择性培养基， 如哥伦比亚(Columbia)培养基或胰胨豆胨琼脂；以及选择性培养基如Chapman琼脂、 Baird-Parker琼脂。金黄色葡萄球菌根据其形态特征及其溶血谱也可以在血琼脂中检测， 但是这个方法不是非常灵敏和特异的，即使在在食品工业中有所使用，也使用很少。心脑肉 汤也经常用于葡萄球菌的研究。特异性细菌学培养基促进某些微生物的生长，并限制其他微生物的生长。它们含 有至少一种除靶病原体以外的微生物的抑制剂。抑制剂的效果必须保持限制于所关注的微 生物，因为所述所关注的微生物在它们产生的食品制品可以被破坏。用甘露醇作为底物的 Chapman琼脂相当于普通营养物基质的高盐培养基，通过pH指示剂来检测其发酵。所述pH 指示剂可以是有色指示剂或荧光指示剂。Baird-Parker培养基相当于高营养物基质，其添 加了亚碲酸钾和氯化锂，这是常用于生长金黄色葡萄球菌的选择性试剂。氯化锂是肠球菌 抑制剂。其他化学物质可以与亚碲酸钾和氯化钠或氯化锂组合硫酸铵、山梨酸、甘氨酸、多 粘菌素B。然而，分析食品基质的潜在产毒性葡萄球菌呈现出特别的难题，这限制了为临床实践开发的方法的实际应用。事实上，通常推荐的培养基还允许未被视为食品污染剂的凝 固酶阴性葡萄球菌的生长和根据所要求表型特征的检测。对于Baird-Parker+RPF(兔血浆+牛纤维蛋白原)培养基，其是根据IS06888-1 和6888-2标准的参考培养基，普遍发现存在某些缺陷。首先是难以辨认(lecture)和灵敏度可能出现假阴性，这是由于这样的事实，即 金黄色葡萄球菌的某些菌株不在该培养基上显现，或者呈现出非常弱且延缓的凝固酶，这 提示存在凝固酶阴性葡萄球菌。而且，由于基质的干扰也可能观察到假阴性结果事实上， 为了计数金黄色葡萄球菌的低水平污染，进行样品的最小稀释(1/10)，这由于基质化合物 的存在而导致难以辨认晕圈(例如奶和/或乳制品的样品酪蛋白的白色掩盖揭示凝固酶 的晕圈)。Baird-Parker+RPF培养基需要组合凝血酶的来源和纤维蛋白溶酶原的来源。后者 获得自动物的血液，这导致供给的可靠性问题(质量、数量等)。而且，不可能在肉汤(液体培养基)中辨认晕圈，并且晕圈与培养基之间的对比可 能会减弱。在融合菌落的情况下，难以区分产生晕圈与不产生晕圈的菌落。其次，可能存在特异性问题当存在大量附属菌群(例如芽孢杆菌(Bacillus SPP))时，这种类型的培养基可以出现假阳性结果。以下就是这种情况，例如对于计数以 木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)为发酵剂的某些肉制品(干香肠)和乳制品 (Munster型乳酪)中的金黄色葡萄球菌。因此，Baird Parker+RPF培养基中出现的晕圈所 环绕的黑色菌落，这是金黄色葡萄球菌在该培养基中的正常特征，但事实上是由木糖葡萄 球菌菌株(产生黑色菌落而无晕圈)与产生浑浊的芽孢杆菌(Bacillus)的某些菌株的邻 近生长，这可以鉴定为琼脂上的晕圈。在可选择的方法中，例如显色培养基，由于凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡 萄球菌之间很高的相似性，没有培养基能够非常特异性地区分这两组细菌。事实上，意图区 分凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的这种类型培养基所应用的区分概念(即 或多或少是特异性的底物和/或糖，与抑制系统组合)通常很复杂，且没有提供良好的区分 效果，特别是对于含有不同且大量微生物菌群的食品样品。缺乏用于区分凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌(或者甚至其他菌种) 的特异性的底物或糖意味着使用“攻击性”选择/抑制系统，这可能改变或抑制所涉及的金 黄色葡萄球菌的生长或酶活性，从而可能导致获得假阴性结果。在轻微污染的情况下，由于避免基质相互作用所要求的稀释也可能获得假阴性结 果例如，使用3M Petrifilm 葡萄球菌表达计数板(Staph Express Count Plate)时， 乳制品中存在的高水平磷酸酶所导致的粉红色。相反地，基于底物降解或者糖发酵的培养基对金黄色葡萄球菌的特异性不高，而 且抑制系统的选择性不足，因而导致获得假阳性结果。最后，某些培养基基于使用两种底物来保证最优地区分金黄色葡萄球菌与其他葡 萄球菌及其他菌种。应用这一概念增加了培养基的成本却没有提供足够的特异性，特别是 在获得自食品的样品的情况下。磷脂酶C类的酶存在于大量的微生物中是已知且有文献描述的。在磷脂酶C中，已经纯化和表征了来自金黄色葡萄球菌的磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC) (Phosphatidylinositol-Specifc Phospholipase C from Staphylococcus aureus, METHODS IN ENZYMOLOGY，1981-Vol. 71)。这种酶还已经描述为可能是金黄色葡萄球菌的致病因子(JOURNALOF CLINICAL MICROBIOLOGY, Nov. 1989，p. 2451-2454-Vol. 27，No. Iland INFECTION AND IMMUNITY, Dec. 1993，p. 5078-5089-Vol. 61，No. 12)。而且，还公开了评价允许金黄色葡萄球菌中活性 PIPLC最大产生的条件的体夕卜研究(Marques et al. ；Growth in Acidic Media Increases Production of Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C by Staphylococcus aureus ；CURRENT MICROBIOLOGY Vol. 25(1992)，pp.125-128)。文献EP-O 970 239 Bl描述了允许检测各种微生物所分泌的PIPLC的新显色底 物。一方面，给出的实施例描述了所述的各种底物的制备，另一方面证明了使用该方法的最 优条件(例如底物/酶的浓度、推荐的诱导物等)。然而，该文献没有描述允许检测葡萄球
菌的培养基。文献EP-I 506 309 Bl描述了用于检测能够产生PIPLC的微生物的培养基，所述 培养基含有至少一种荧光化合物和至少一种显色化合物的组合，当它们接触PIPLC时分别 能够产生荧光和颜色。该培养基描述为允许检测各种菌种而不添加抑制剂，例如单核细胞 增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、伊氏利斯特氏菌(Listeria ivanovii)、赌 状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蕈状芽孢 杆菌(Bacillus mycoides)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、金黄色葡萄球菌、侵月市
胃(Legionella pneumophila)、 胃(Clostridium)禾中、IillHlff 胃(Helicobacter pylori)、念珠菌(Candida)种和曲霉菌(Aspergillus)种。然而，该文献中没有描述自身 意图用于检测金黄色葡萄球菌的培养基。唯一描述的培养基涉及单核细胞增生利斯特氏菌 和蜡状芽孢杆菌群(Bacillus group cereus)的检测。而且，看起来葡萄球菌种尤其是金 黄色葡萄球菌在所有描述的培养基中都不生长。文献EP-O 949 266 Bl描述了对细菌活性，尤其是利斯特氏菌(Listeria)属的细 菌活性的指示剂PIPLC特异性的底物。所述底物含有至少一种能够产生颜色或荧光的化合 物。唯一描述的培养基涉及单核细胞增生利斯特氏菌的检测。而且，葡萄球菌种尤其是金 黄色葡萄球菌由于它们的抑制在所有描述的培养基中都不生长。和其他磷脂酶C 一样，磷脂酰胆碱磷脂酶C (PCPLC)也被描述存在于包括金黄色葡 内白勺#禾中(J. G. Songer, Trends in Microbiology, Volume 5, Number 4,
April 1997，pp.156-161(6))。文献EP-I 219 628描述了用于检测和鉴定微生物的新显色底物。这些底物是对 PCPLC具有特异性的底物。然而，该文献没有描述用于检测和鉴定金黄色葡萄球菌的底物， 也没有描述特定的培养基。因此看起来，尽管超过25年前表征了金黄色葡萄球菌的PIPLC，并鉴定了在该菌 种的致病力中的潜在作用，但是还没有描述对金黄色葡萄球菌的检测和/或计数特异性的 培养基，其基于使用至少一种对PIPLC特异性的显色、荧光或发光底物，并允许区分这一物 种与葡萄球菌的其他种，所描述的培养基上金黄色葡萄球菌菌株的抑制使得它们不可能用 于这样的应用。而且，没有文献描述了对PCPLC特异性的显色、荧光或发光底物在用于检测 或计数金黄色葡萄球菌的特异性培养基中的用途，所述底物的用途允许区分这一物种与葡萄球菌的其他种。考虑到上文所述的现有技术状态所面临的问题，本发明的重要目的之一是提供促 进葡萄球菌生长的培养基以用于检测和/或鉴定和/或计数该葡萄球菌，并且允许区分金 黄色葡萄球菌与葡萄球菌的其他种。本发明的另一目的是提供限制假阳性结果，尤其是由于凝固酶阴性葡萄球菌的假 阳性结果产生的培养基。本发明的另一目的是提供通过使用减少的抑制系统而允许更好地覆盖靶细菌的 培养基，尤其在低污染水平的情况下。本发明的另一目的是提供通过使用一种特异性底物而允许简单的辨认和解释的
培养基。本发明的另一目的是提供允许自动辨认的培养基。最后，本发明最后的目的是提供这样的培养基，其由于降低的选择性而促进金黄 色葡萄球菌的生长，从而可以缩短返回结果的时间。本发明所实现的目的首先涉及用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌 的特异性培养基，所述培养基的特征在于其包含至少一种磷脂酶C的显色、荧光或发光底 物。“底物”是指能够直接或间接产生由于微生物的酶活性或代谢活性的可检测信号 的任何分子。值得注意的是，底物可以是酶底物，即可以由酶代谢为允许直接或间接检测微生 物的产物的底物。值得注意的是，该底物包含对要检测的酶活性特异性的第一部分和充当标记物的 第二部分，下文称之为标记物部分。该标记物部分是显色、荧光、发光的。优选地，本发明所 用的底物是荧光的。我们可以提及香豆素衍生物，尤其是7-羟基香豆素、萘酚、试卤灵、荧 光素。对于本发明的意义，该底物可以是磷脂酰肌醇磷脂酶C(PIPLC)的底物。这种情况 下，培养基中PIPLC底物的浓度为0.01至lg/1。优选地，PIPLC的底物取自包含下列化合物的组4-硝基苯基肌醇-1-磷酸酯、 4-甲基伞形酮酰肌醇-I-磷酸酯 0-M6thylumbellif6rylmyo-inositol-l-phosphate)、 3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-乙氧羰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸 酯、3-氰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯。根据一替代选择，底物可以是磷脂酰胆碱磷脂酶C(PCPLC)的底物。这种情况下， 培养基中PCPLC底物的浓度为0. 01至lg/1。优选地，PCPLC的底物取自包含下列化合物的组5-溴_4_氯_3_吲哚氧基 磷酸胆碱、3-吲哚氧基磷酸胆碱、4-甲基伞形酮酰磷酸胆碱G-methylumbel 1 iferyl choline-phosphate)。在优选的实施方案中，本发明的培养基为液体形式。事实上，这种形式尤其适合于 食品中的微生物分析，其可以要求将固体样品混合于培养基中的步骤以允许释放所述样品 中可能存在的微生物。然而，该培养基也可以是固体形式(例如基于琼脂的培养基)。与液体培养基相同，磷脂酶C(PIPLC或PCPLC)的底物可以存在于这些固体培养基中并允许检测、鉴定或甚 至计数金黄色葡萄球菌。或者，本发明的培养基还可以包含使得可以检测靶微生物的不同于磷脂酶C活性 的酶活性或代谢活性的底物，例如酯酶(尤其是脂肪酶或磷酸酶)凝固酶或α-葡糖苷酶 活性。对于直接检测，该底物可以结合充当荧光或显色标记物的部分。对于间接检测，本发 明的培养基还可以包含PH指示剂，该ρΗ指示剂对底物消耗所引起的ρΗ改变敏感，并揭示 靶微生物的生长。所述PH指示剂可以是生色团或荧光团。根据第一实施方案，本发明的选择性培养基用于食品的微生物检查。优选地，其用 于生长和计数乳制品中的金黄色葡萄球菌。根据第二实施方案，本发明的选择性培养基用于环境的微生物监测。“环境”是指 空气样品、水样品或来自表面的样品。在来自表面的样品中，在引起医院感染的凝固酶阳性 葡萄球菌中，本发明的目的可以在医院环境中的金黄色葡萄球菌的检测中发现具体应用。根据最后的实施方案，本发明的选择性培养基用于检测和/或鉴定和/或计数金 黄色葡萄球菌的临床分析。有利地，本发明的选择性培养基还包含抗性的标记物，例如金黄色葡萄球菌菌株 对甲氧西林的抗性的测试在本发明的范围内。本发明的另一目的涉及至少一种磷脂酶C的显色、荧光或发光底物用于区分金黄 色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的用途。所述用途不限于培养基的制备。事实上，完全可以想到制备鉴定试剂，其具有一种 或多种磷脂酶C(PIPLC或PCPLC)的底物且允许鉴定金黄色葡萄球菌。所述试剂可以用于 本申请人所销售的产品，例如VITEK卡、API 或者RAPiDEC 生化测试试剂盒。本发明的另一目的涉及至少一种磷脂酶C的底物用于制备用于生长、检测、鉴定 和/或计数金黄色葡萄球菌的特异性培养基的用途。本发明的另一目的涉及本发明的培养基用于检测和/或鉴定和/或计数复杂样品 中的金黄色葡萄球菌的用途。最后，本发明最后的目的涉及用于检测和/或鉴定金黄色葡萄球菌的方法，所述 方法包括以下步骤(a)用可能含有金黄色葡萄菌的样品接种本发明培养基；(b)测量所述培养基中荧光、发光或颜色的变化，所述变化对应于所述培养基中金 黄色葡萄球菌的生长。有利地，本发明的方法包括中间步骤a’ )由将接种的培养基置于适合允许金黄色 葡萄球菌生长的条件下组成。根据具体的实施方案，本发明的方法可以包括计数靶微生物的补充步骤。所述计 数步骤优选根据最大可能数(MPN)法进行。该方法解释于本申请人的专利EPl 105 457。优选地，生物样品是临床样品、食物样品或环境样品。最后应当指出，本发明目的的应用并不仅限于单一类型的支持物(support)。事 实上，用于体外诊断领域的所有类型的支持物都适合使用微量培养板、微型管、微吸盘 (microcupule)、毛细管等。以下提供的实施例结合
图1的目的是示例本发明，而不意图进行任何形式的限制。它们使得更容易理解本发明。图1显示荧光随时间的测量，这反映了金黄色葡萄球菌的两种菌株的PC-PLC(卵 磷脂酶)酶活性。实施例1 金黄色葡萄球菌中PIPLC活性与凝固酶存在之间的相关性的研 究-TEMPO 系统 /Baird-Parker+RPF (BP+RPF)培养基的比较使用本申请人销售的TEMPC 系统，通过接种Baird-Parker+RPF培养基 (bioMerieux Ref. :44003)和源自Ottaviani Agosti琼脂培养基(OAA)，测试金黄色葡萄 球菌的43种菌株和凝固酶阴性葡萄球菌的20种菌株。源自OAA的培养基所用培养基的组成如下
权利要求
1.用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus)的特异 性培养基，所述培养基特征在于其包含至少一种磷脂酶C的荧光、显色或发光底物。
2.根据权利要求1的培养基，其特征在于所述磷脂酶C的底物是磷脂酰肌醇磷脂酶 C(PIPLC)的底物。
3.根据权利要求2的培养基，其特征在于所述PIPLC的底物的浓度为0.01至lg/1。
4.根据权利要求2或3的培养基，其特征在于所述PIPLC的底物取自包含下列化合物 的组4-硝基苯基肌醇-1-磷酸酯、4-甲基伞形酮酰肌醇-1-磷酸酯、3-氯-7-羟基-4-甲 基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-乙氧羰基-4-甲基香豆素肌醇-1-磷酸酯、3-氰基-4-甲基 香豆素肌醇-1-磷酸酯。
5.根据权利要求1的培养基，其特征在于所述磷脂酶C的底物是磷脂酰胆碱磷脂酶 C(PCPLC)的底物。
6.根据权利要求5的培养基，其特征在于所述PCPLC的底物的浓度为0.01至lg/1。
7.根据权利要求5或6的培养基，其特征在于所述PCPLC的底物取自包含下列化合物 的组5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸胆碱、3-吲哚氧基磷酸胆碱、4-甲基伞形酮酰磷酸胆 碱。
8.至少一种磷脂酶C的底物用于区分金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)与凝 固酶阴性葡萄球菌的用途。
9.至少一种磷脂酶C的显色、荧光或发光底物用于制备用于生长、检测、鉴定和/或计 数金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的特异性培养基的用途。
10.根据权利要求1至7的培养基用于检测和/或鉴定和/或计数复杂样品中的金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的用途。
11.用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus)的方 法，所述方法包括以下步骤(a)用可能含有金黄色葡萄菌的样品接种根据权利要求1至7中任一项的培养基；(b)测量所述培养基中荧光、发光或颜色水平的变化，所述变化对应于所述培养基中金 黄色葡萄球菌的生长。
12.根据前述权利要求的方法，其包括中间步骤a’)由将接种的培养基置于适合允许 所述细菌生长的条件下组成。
13.根据前述权利要求的方法，其包括计数金黄色葡萄球菌的补充步骤。
14.根据权利要求11至13的方法，其特征在于生物样品是临床样品、食物样品或环境 样品。
全文摘要
本发明总体上涉及用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的选择性培养基，所述培养基的特征在于其包含至少一种磷脂酶C的荧光、显色或发光底物。所述培养基允许区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌。
文档编号C12R1/445GK102119221SQ200980131422
公开日2011年7月6日 申请日期2009年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者A·维蒙, D·莫斯蒂科内, M·德丹, S·奥伦加, 郭玉平 申请人:生物梅里埃公司