Cdca1表位肽及包含它的疫苗的制作方法

专利名称：Cdca1表位肽及包含它的疫苗的制作方法
技术领域：
本申请要求2008年6月19日提交的美国临时申请No. 61/074，062和2008年10 月28日提交的美国临时申请No. 61/197，599的权益，通过述及将它们的全部内容收入本文。本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作 为癌症疫苗非常有效的新肽，及用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术：
已经证明了⑶8阳性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可识别主要组织相容性复合物 (MHC) I类分子上发现的由肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。自第 一例TAA——黑素瘤抗原(MAGE)家族发现以来，人们主要通过免疫学手段已经发现了许多 其它 TAA(Boon Τ, Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 ；Boon T & van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725-9)。这些TAA中，有一些当前正在作为免疫治疗靶 接受临床开发。能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类 型癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用(Harris CC, J NatlCancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 ；Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999Jul 1,59(13) 3134-42 ；Vissers JL et al.，Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554-9 ；van der Burg SH et al.，J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14 ；Tanaka F et al.，Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 ；Fujie T et al.，Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72 ；Kikuchi M et al. ,Int J Cancer 1999May 5,81(3) :459-66 ；Oiso Met al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94)。迄今为止，已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽的临床试验 报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到了较低的客观应答率(Belli F et al.，J Clin Oncol 20020ctl5,20 (20) :4169-80 ；Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42 ；Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004Sep,10(9) :909-15).癌细胞增殖和存活不可缺少的TAA是作为免疫疗法的理想靶标，这是因为人们熟 知治疗马区动的免疫选择(therapeutically driven immune selection)会导致TAA的删 除、突变或下调，进而导致癌细胞免疫逃逸，使用这样的TAA可以将由此发生的癌细胞免疫 逃逸的风险降至最低。CDCAl (细胞分裂周期相关的1)被鉴定为与细胞周期基因诸如CDC2、细胞周期蛋 白、拓扑异构酶II等等共表达的一类基因的一个成员(Walker et al. ,Curr Cancer Drug Targets 200IMay ；1 (1) :73-83)。特别发现CDCAl与有丝分裂中的HeLa细胞的着丝粒有 关，因此被认定为酵母Nuf2a的功能同源物(J CellBiol 2001 Jan 22 ； 152 (2) :349-60)。另外，通过使用含有23，040种基因的基因组范围cDNA微阵列进行的基因表达谱 分析(Cancer Res 2006Nov 1 ；66 (21) :10339-48)，还确定了 CDCAl是在这数种癌症中上调 的新分子。事实上，已经证明CDCAl在乳腺癌(W02005/028676)、膀胱癌(W02006/085684)、 食道癌(W02007/013671)、小细胞肺癌(SCLC) (W02007/013665)和非小细胞肺癌(NSCLC)(W02005/089735)中上调，通过述及将这些公开文本的内容收入本文。⑶CAl的表达特别 在SCLC、NSCLC和肿瘤细胞系中上调，尽管在除睾丸外的23种正常组织中没有检测到表 达。另外，siRNA对⑶CAl表达的下调在表达⑶CAl的的肺癌细胞系中引起细胞生长遏制 (W02005/089735)。总之，此数据提示⑶CAl是新的、可能是普遍的癌抗原。因而，⑶CAl衍生的表位 肽可作为癌症免疫治疗剂应用于多种癌症的治疗。发明概述本发明部分地基于可充当免疫疗法靶标的合适表位肽的发现。认识到⑶CAl在 多种类型的癌症，包括乳腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌中上调，本发明 针对这种细胞分裂周期相关的1 (CDCAl) (SEQID NO :35，由GenBank登录号NM_145697 (SEQ ID NO 34)的基因编码)，进行进一步分析。具体而言，选择了含有如下表位肽的CDCAl基 因产物，所述表位肽引发对相应分子特异性的CTL。使用CDCAl衍生的HLA-AM402结合候 选肽刺激获自健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。建立了特异性识别用相应候选肽冲 激的HLA-AM阳性靶细胞的CTL，并鉴定了能诱导针对CDCAl的强而特异性的免疫应答的 HLA-A24限制性表位肽。这些结果证明了 CDCAl具有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫 疗法的有效靶物。因而，本发明的一个目的是提供具有CTL诱导能力并具有选自SEQ IDNO =3,4,11, 14，22和23的氨基酸序列的肽。本发明涵盖经过修饰的肽，它们具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，4，11，14，22或23中替代、掺入、删除或添加一个、两个或更多个氨基酸而得到的氨基 酸序列，只要经过修饰的肽保留原来的CTL诱导能力。当对受试者施用时，本发明的肽呈递在抗原呈递细胞或外来体的表面上，然后诱 导靶向相应肽的CTL。因此，本发明的一个目的是提供呈递任何本发明肽的抗原呈递细胞和 外来体，以及用于诱导抗原呈递细胞的方法。施用本发明的CDCAl多肽或编码所述多肽的多核苷酸以及呈递CDCAl多肽的外来 体和抗原呈递细胞可诱导抗肿瘤免疫应答。因此，本发明的一个目的是提供含有本发明多 肽或编码它们的多核苷酸，以及含有它们的外来体和抗原呈递细胞作为活性组分的药物制 剂。本发明的药物制剂可用作疫苗。本发明的另一个目的是提供治疗和/或预防(即防范)癌症(肿瘤)，和/或预防 其手术后复发的方法，以及用于诱导CTL的方法、用于诱导抗肿瘤免疫的方法，这些方法包 括施用本发明的CDCAl多肽、编码CDCAl多肽的多核苷酸、呈递CDCAl多肽的外来体或抗原 呈递细胞或药物制剂的步骤。另外，本发明的CTL还可用作针对癌症的疫苗。本发明涵盖 的癌症的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌 (NSCLC)。在阅读下面的详细描述连同附图和实施例后，本发明在上文之外的其它目的和特 征会变得更加显而易见。然而应当理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的 实施方案，而非限制本发明或本发明的其它备选实施方案。具体而言，虽然本文中参照多个 具体实施方案描述了本发明，但是应理解所述描述是例示本发明而不构成本发明的限制。 本领域技术人员可想到各种修改和应用，而不偏离如所附权利要求描述的本发明精神和范 围。类似地，根据此概述和下文描述的某些实施方案很容易想到本发明的其它目的、特征、好处和优点，它们对于本领域技术人员会是显而易见的。根据上文连同所附实施例、数据、 图及自它们得出的所有合理推论，单独地或与并入本文的参考文献一起考虑，容易想到这 样的目的、特征、好处和优点。附图简述在考虑本发明的附图简述和后面的详细描述及优选实施方案后，本发明的各方面 和应用对于熟练技术人员会变得显而易见。

图1包括一系列照片，(a)至(g)，显示对用⑶CAl衍生的肽诱导的CTL进行 的 IFN- y ELISP0T 测定的结果。用 CDCA1-A24-10-119 (SEQ ID NO 3)刺激的 8 号孔
(a)、用CDCA1-A24-10-335 (SEQ ID NO 4)刺激的 1 号孔(b)、用 CDCA1-A24-10-48 (SEQ ID NO 11)刺激的 1 号孔(C)、用 CDCA1-A24-10-5 (SEQ ID NO 14)刺激的 4 号孔(d)、 用 CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID NO :22)刺激的 2 号孔(e)和用 CDCA1-AM-9-56 (SEQ ID NO: 23)刺激的2号孔(f)中的CTL分别显示与对照相比强的IFN-Y生成。相反，对用 ⑶CA1-AM-10-74(SEQ IDNO 2)刺激的CTL没有检测到针对经肽冲激的靶细胞的特异性 IFN-Y生成(g)。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立CTL系。在图中，“+"指示针 对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的 IFN-Y生成。图2包括一系列线图，(a)至(g)，呈现对在上文IFN- y ELISA测定 中用 CDCA1-A24-10-119(SEQ ID NO 3) (a)、CDCA1-A24-10-335(SEQ ID NO 4)
(b)、CDCA1-A24-10-48(SEQ ID NO 11) (c)、CDCA1-A24-10-5 (SEQ ID N0:14)(d)、 CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID NO :22) (e)和 CDCA1-A24-9-56 (SEQ IDNO :23) (f)建立的 CTL 系进 行的IFN- y ELISA测定的结果。结果证明通过用所有肽刺激而建立的CTL系均显示与对照 相比强的IFN-Y生成。相反，对用CDCA1-AM-10-74(SEQ ID NO 2)建立的CTL系中没有 检测到针对经肽冲激的靶细胞的特异性IFN-γ生成(g)。在图中，“+〃指示针对经适宜 肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成，而"-"指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-Y生 成。图3是描绘从经SEQ ID NO :23刺激的CTL系通过有限稀释建立的CTL克隆的 IFN-Y生成的线图。结果证明通过用SEQ ID NO :23刺激而建立的CTL克隆与对照相比显示 出强的IFN-Y生成。在图中，“+〃指示针对用SEQ ID NO :23冲激过的靶细胞的IFN-γ 生成，而"-"指示针对未用任何肽冲激过的靶细胞的IFN-γ生成。图4是描绘针对外源表达⑶CAl和HLA_AM402的靶细胞的特异性CTL活性 的线图。用CDCA1-AM-9-56 (SEQ ID NO 23)建立的CTL克隆显示针对用CDCAl和 HLA-A*2402 (菱形)二者转染的C0S7细胞的高特异性CTL活性(菱形)。相反，没有检测 到显著的针对表达HLA-AM402 (三角形)或⑶CAl (圆形)的靶细胞的特异性CTL活性。实施方案的描述下文描述优选的方法、装置、和材料，但在实施或检验本发明的实施方案时可使用 与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方 法之前要理解，本发明不限于特定大小、性状、尺度、材料、方法、方案、等，因为它们可依照 例行实验和优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施 方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。
通过述及明确将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完 整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类 公开文本。I.定义除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技 术人员的普遍理解相同的含义。然而，如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非 另有明确说明。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该 术语不但适用于天然存在的氨基酸聚合物，还适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多 个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在的残基诸如相应天然存在氨基酸的人工化 学模拟物。如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与发挥天然 存在型氨基酸相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在型氨基酸指由遗传密 码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后经过修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y -羧基谷氨 酸、和0-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学 结构(结合有氢、羧基、氨基、和R基团的α碳)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主 链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸 模拟物”指具有与一般氨基酸不同的结构但发挥相似功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以用它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员 会推荐的单字母符号来指称。术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，而且，除非另 有明确说明，通过它们公认的单字母代码来指称。除非另有定义，术语“癌症”指过表达⑶CAl基因的癌症，包括例如乳腺癌、膀胱 癌、食道癌、小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文 中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤细胞、病毒感染 细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。II.肽为了证明⑶CAl衍生的肽作为被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的抗原发挥功 能，对CDCAl (SEQ ID NO :3 衍生的肽进行分析以确定它们是否是受常见的HLA等位基因 HLA-A24 限制的抗原表位(Date Y et al.，TissueAntigens 47 :93-101,1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；KuboRT et al.，J Immunol 152:3913—24,1994)。基 于它们对HLA-AM的结合亲和力来鉴定⑶CAl衍生的HLA-AM结合肽的候选者。用负载有 这些肽的树突细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用每一种下面的肽成功建立了 CTL:CDCA1-A24-10-119(SEQ ID NO 3),CDCA1-A24-10-335(SEQ ID NO 4),CDCA1-A24-10-48 (SEQ ID NO: 11)，CDCA1-A24-10-5(SEQ ID NO :14)，
CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID N0:22)，禾口CDCA1-A24-9-56(SEQ ID NO :23)。这些建立的CTL针对经相应肽冲激的靶细胞显示强的特异性CTL活性。本文中的 这些结果证明⑶CAl是被CTL识别的抗原，而且这些肽是⑶CAl的受HLA-AM限制的表位肽。由于⑶CAl基因在大多数癌组织，包括例如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小细胞肺癌 (SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)中过表达，它是免疫疗法的良好靶标。因此，本发明提供与 CDCAl的CTL识别表位对应的九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸 残基组成的肽)。本发明的九肽和十肽的特别优选例子包括那些由选自SEQ ID NO :3,11, 14,22和23的氨基酸序列组成的肽。一般而言，可使用互联网上现有可用的软件程序，诸如Parker KC et al., JImmunol 1994Jan 1,152(1) 163-75中记载的软件程序，在计算机上(in silico)计算各 种肽与HLA抗原之间的结合亲和力。可以如例如Parker KC et al. , JImmunol 1994Jan 1,152(1) :163-75 ；及 Kuzushima K et al.，Blood 2001,98(6) :1872-81 中所述来测量与 HLA 抗原的结合亲和力。例如 Journal of Immunological Methods，1995，185 181-190 和 Protein kience，2000，9 :1838-1846中记载了用于测定结合亲和力的方法。因此，本发明 涵盖使用此类已知程序鉴定的结合的HLA抗原的⑶CAl肽。本发明的九肽和十肽的侧翼可以任选有额外的氨基酸残基，只要该肽保留其CTL 诱导能力。此类具有CTL诱导能力的肽通常小于约40个氨基酸，常常小于约20个氨基酸， 通常小于约15个氨基酸。由选自SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23的氨基酸序列组成的肽 的侧翼的具体氨基酸序列不受限制，可以由任何种类的氨基酸组成，只要它不削弱原始肽 的CTL诱导能力。因此，本发明还提供具有CTL诱导能力和选自SEQ ID NO :3，4，11，14，22 和23的氨基酸序列的肽。一般而言，蛋白质中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能， 而且在有些情况中甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即 由与原始参照序列相比其中修饰(即替代、添加、删除或插入)一个、两个或数个氨基酸 残基的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland etal. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个 实施方案中，本发明的肽可以既具有CTL诱导能力，又具有在选自SEQ ID NO 3,4,11,14, 22和23的氨基酸序列中插入、添加、删除和/或替代一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到 的氨基酸序列。本领域技术人员认可，对氨基酸序列进行个别的添加或替代而改变单个氨基酸或 小比例的氨基酸，往往会导致原始氨基酸侧链的特性的保留。因此，它们常常称作“保守替 代”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变的结果是获得与原始蛋白质功能相似的修饰蛋白 质。提供功能相似的氨基酸的保守替代表是本领域公知的。氨基酸侧链的特性的例子包括 疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W, Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具 有下面的共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)； 含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有互为保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，而且可包括非 保守修饰，只要经过修饰的肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除 CDCAl的多态变体、种间同源物、和等位基因中的CTL可诱导肽。为了保留必需的CTL诱导能力，可修饰(插入、添加、删除和/或替代)少量(例 如1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。在本文中，术语“数个”意味着5个或更少的氨 基酸，例如3个或更少。要修饰的氨基酸的百分比优选20%或更少，更优选15%或更少，甚 至更优选10%或更少或者1至5%。对本发明的优选肽CDCA1-A24-10-119(SEQ ID NO :3)、CDCA1-A24-10-335 (SEQ ID NO 4), CDCA1-A24-10-48(SEQ ID NO 11)、CDCA1-A24-10-5 (SEQ ID NO: 14)、 CDCA1-A24-9-8 (SEQ ID NO :22)和 CDCA1-A24-9-56 (SEQ ID NO :23)的同源性分析确认了 这些肽与任何其它已知人基因产物衍生的肽不具有显著的同源性。因此，这些肽在用于免 疫疗法时产生未知的或不想要的免疫应答的可能性显著降低。因而，预期这些肽对于在癌 症患者中引发针对CDCAl的免疫力是非常有用的。当在免疫疗法的环境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优 选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择这样的肽，其不仅可诱导CTL，而且拥有对HLA 抗原的高结合亲和力。为此目的，可通过替代、插入、删除和/或添加氨基酸残基来对肽进 行修饰，以产生具有改良结合亲和力的修饰肽。在天然被展示的肽之外，由于通过结合HLA 抗原而被展示的肽的序列的规律是已知的(J Immunol 1994,152 3913 ；Immunogenetics 1995,41 178 J Immunol 1994，155 :4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫 原性肽。例如，可以用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代从N端起第二个氨基酸， 和/或用苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代C端氨基酸，以提高HLA-AM 结合亲和力。因此，本发明涵盖下述肽，其具有选自SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23的氨 基酸序列，其中所述SEQID NO的氨基酸序列的N端起的第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨 酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代，和/或其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列的C端氨基酸被 苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代。不仅可以在肽的末端氨基酸处引 入替代，而且可以在可能的TCR识别位置处引入替代。数项研究证明了肽中的氨基酸替 代可等同或好于原来的，例如CAP1、p53 (264-272)、Her_2/neu(369_377)或 gp 100 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57，4570-4577，1997，Τ. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002)Feb 1 ； 168(3) :1338-47.，S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52 :199-206及 S. 0. Dionne etal. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53,307—314)。
本发明还涵盖对期望肽的N和/或C端添加一个至两个氨基酸。本发明也包括这 样的具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的修饰肽。然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列一部分相同 时，可能诱发副作用，如针对特定物质的自身免疫性病症和/或变应性症状。因此，优选首 先使用可得数据库实施同源性搜索以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的 情况。当根据同源性搜索了解到甚至不存在与目标肽相比有1个或2个氨基酸差异的肽时， 可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任 何此类副作用的危险。虽然预期如上所述对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但是对以高 结合亲和力的存在作为指标而选择得到的候选肽进一步检查CTL诱导能力的存在。在本文 中，短语“CTL诱导能力”指肽在抗原呈递细胞上呈递时诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的 能力。另外，“CTL诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高 CTL IFN-Y生成的能力。CTL诱导能力的确认如下来实现诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如 B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或更具体的说就是人外周血单个核淋巴细胞 衍生的DC，用肽刺激后，与CD8阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的 IFN-γ。作为反应系统，可使用已经生成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000Aug, 61(8) :764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimalepitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice -dependence on HLA classll restricted T (H)response中记载的那些)。例如，可以用51Cr等放射性标记靶细 胞，并且可以根据从靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，可通过测量在携带固定 化肽的抗原呈递细胞(APC)存在下由CTL生成和释放的IFN-Y，并使用抗IFN-γ单克隆抗 体显现培养基上的抑制区，来评估CTL诱导能力。作为如上所述检查肽的CTL诱导能力的结果，发现那些对HLA抗原具有高结合亲 和力的并非必然具有高CTL诱导能力。然而，在那些鉴定和评估的肽中，发现具有选自SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23的氨基酸序列的九肽或十肽不但展现对HLA抗原的高结合亲和 力，还展现特别高的CTL诱导能力。因此，例示这些肽作为本发明的优选实施方案。在上文所述修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的连接的肽 保留原始肽的CTL诱导能力。合适物质的例子包括例如肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然 的和合成的聚合物、等。肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰 不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶定功能和 投递功能)或使多肽稳定化。例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或 非天然氨基酸；此概念也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如， 可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 本发明的肽作为与HLA抗原结合的复合物被呈递在细胞(例如抗原呈递细胞)或 外来体的表面上，然后诱导CTL。因此，本发明还包括在细胞或外来体的表面上与HLA抗原形成复合物的肽。此类外来体可例如使用日本专利申请公表平11-510507和W099/03499 中详述的方法来制备，而且可使用从治疗和/或预防的对象患者获得的APC来制备。呈递 本发明肽的外来体或细胞可作为疫苗用于接种。上文复合物中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的HLA 抗原类型匹配。例如，，HLA-AM (特别是HLA-AM02)在日本人群中占优势，因此对于日本 人群的治疗是适宜的。使用在日本人和白种人中高度表达的AM型有利于获得有效结果， 也可使用AM02等亚型。通常，在临床上，预先调查需要治疗的患者的HLA抗原类型，以便 恰当选择对特定抗原具有高水平结合亲和力，或具有通过抗原呈递的CTL诱导能力的肽。当将AM型HLA抗原用于外来体或细胞时，优选使用具有选自SEQ IDNO =3,4,11, 14，22和23的氨基酸序列的肽。在本文中，本发明的肽还可描述为“⑶CAl肽”或“⑶CAl多肽”。III. CDCAl 肽的制备本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或 化学合成来制备。本发明的肽可个别地合成，或作为更长的、由两个或更多个肽构成的多肽 来合成。然后可以对肽进行分离，即纯化，从而使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋 白质及其片段或任何其它化学物质。本发明的肽可基于选定的氨基酸序列通过化学合成来获得。可适用于合成的常规 肽合成法的例子包括⑴Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；(iii)P印tide Synthesis (日文)，Maruzen Co.，1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( H JC ) Maruzen Co., 1985 ；(ν) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；(vi)W099/67288 ；和(vii)Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, “ Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118。或者，可通过适用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先，制备以可表达形式(例如在 与启动子序列对应的调节序列下游)包含编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转移入合 适宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产 肽。IV.多核苷酸本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括天然存在⑶CAl基因 (GenBank登录号NM_145697 (SEQ ID NO 34))衍生的多核苷酸以及具有它们经过保守修饰 的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本 质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定蛋白质都有很多种功能上相同的核酸来编码。例如，密码子GCA、GCC、GCGjP G⑶都编码氨基酸丙氨酸。因此，在 任何由密码子规定为丙氨酸的位置，该密码子可改变成任何所述的对应密码子，而不改变 所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每 一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到核酸 中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况中是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在 正常情况中是色氨酸的唯一密码子)都可进行修饰以产生功能上相同的分子。因而，每一 种所公开的序列隐含涵盖编码肽的核酸的每一种沉默变异。本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由A、T、C、和G等碱基 合适地构成，而T在RNA中被U替换。本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，它们之间有或无居间氨基酸序列。例如， 居间氨基酸序列可提供多核苷酸或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，在编 码本发明肽的编码序列以外，多核苷酸还可包括任何别的序列。例如，多核苷酸可以是包括 表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质 粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过使用例如聚合酶和内切核酸酶经由常规重组技术 操作多核苷酸来制备。重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转 染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可使用PCR技术或合适宿主 中的表达来扩增多核昔酸(参见例如Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1989)。或者，可使用固相技术来合成 多核苷酸，如 Beaucage SL & IyerRP，Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.， EMBO J 1984,3 :801-5 中记载的。V.抗原呈递细胞(APC)本发明还提供在其表面上呈递HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的抗原呈 递细胞(APC)。通过接触本发明的肽、或通过以可表达形式导入编码本发明肽的核苷酸而获 得的APC可衍生自接受治疗和/或预防的患者，而且可作为疫苗以它们自身或与其它药物 (包括本发明的肽、外来体、或细胞毒性T细胞)组合来施用。APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC) ,Langerhans细胞、巨噬细胞、B细 胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细 胞所识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，可以使用DC作为本发明 的 APC。例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后以体外、离体或体内方式用本发明的 肽接触(刺激)它们来获得APC。当对受试者施用本发明的肽时，受试者的体内诱导出呈 递本发明肽的APC。短语“诱导APC”包括用本发明的肽或编码本发明肽的核苷酸接触(刺 激)细胞，以在细胞的表面上呈递HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。或者，在将本发 明的肽提供给APC以容许APC呈递肽后，可以把这些APC作为疫苗施用于受试者。例如，离 体施用可包括下述步骤a 自第一受试者收集APC ；b 使步骤a的APC接触肽；并c 对第二受试者施用负载有肽的APC。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。或者，依照本发 明，提供本发明的肽在制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物中的用途。另外，本发明提 供一种制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺，其中该方法包括将本发明 的肽与药学可接受载体一起混合或配制的步骤。另外，本发明还提供用于诱导抗原呈递细 胞的本发明肽。通过步骤(b)获得的APC可作为疫苗施用于受试者。依照本发明的一个方面，APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的 CTL诱导能力”中，高水平是相对于不与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水 平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC可通过下述方法来制备，该方法包括 在体外将含有编码本发明肽的多核苷酸的基因转移至APC的步骤。所导入的基因可以是 DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不限于此领域中常规实施的各种 方法，诸如可使用脂转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如Cancer Res 1996， 56 :5672-7 ;J Immunol 1998，161 :5607-13 ;J Exp Med 1996，184 :465-72 ；国际公开文本 No. 2000-509281的已
公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中 经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHC I类或II类加工，并经由呈递途径以呈递 本发明的肽。VI.细胞毒性T细胞被诱导的针对任何本发明肽的细胞毒性T细胞在体内加强靶向癌细胞的免疫应 答，并因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明还提供通过任何本发明肽特 异性诱导或活化的分离的细胞毒性T细胞。此类细胞毒性T细胞可通过下述步骤来获得(1)对受试者施用本发明的肽，自受 试者收集细胞毒性T细胞；或( 在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APCjP CD8阳性细胞、或外周血单个核白细胞，然后分离细胞毒性T细胞。可以从治疗和/或预防的对象患者获得用呈递本发明肽的APC刺激而诱导的细胞 毒性T细胞，而且，可以使用它们本身，或者将它们与其它药物(包括本发明的肽或外来体) 组合来施用以获得调节效果。得到的细胞毒性T细胞特异性针对呈递本发明的肽(例如与 用于诱导的肽相同的肽)的靶细胞起作用。靶细胞可以是内源表达CDCAl的细胞，或者是 经CDCAl基因转染的细胞；而且因本发明肽的刺激而在细胞表面上呈递该肽的细胞也可充 当活化CTL攻击的靶物。VII. T 细胞受体(TCR)本发明还提供一种含有编码能够形成T细胞受体(TCR)亚基的多肽的核酸的组合 物，及使用该组合物的方法。所述TCR亚基具有形成赋予T细胞针对呈递CDCAl的肿瘤细胞 的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知方法，可鉴定用一种或多种本发明肽诱导的 CTL 的 TCR 亚基即 α 和 β 链的核酸(W02007/032255 及 Morgan et al.，J Immunol, 171, 3288(2003)).衍生的TCR在体内和在体外能以高亲合力结合展示CDCAl肽的靶细胞，且任 选介导对呈递CDCAl肽的靶细胞的有效杀伤。可将编码TCR亚基的核酸掺入合适载体，例如逆转录病毒载体。这些载体是本领 域公知的。有用的是，可将核酸或含有它们的载体转移入T细胞，例如来自患者的T细胞。 有利的是，本发明提供一种即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自己的T 细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的经过修饰的T细胞。还有，本发明提供这样的CTL，它是通过用核酸转导而制备的，所述核酸编码在 HLA-AM背景下结合CDCAl肽(例如SEQ ID NO :3，4，11，14，22和23)的TCR亚基多肽。经 过转导的CTL能够在体内归巢至癌细胞，而且能在体外通过公知的培养方法来扩增(例如 Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。本发明的 T 细胞可用于形成在需 要治疗或防护的患者中治疗或预防癌症方面有用的免疫原性组合物(W02006/031221)。预防和防范包括降低源自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可 发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防 和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病 相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范包括旨在减轻特定 病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移，降低血管发生等)的广泛的预防性疗法。治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除 癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及 降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低 其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构 成有效治疗和/或预防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情稳定。VIII.药物制剂或药物组合物由于⑶CAl表达在数种癌症类型(包括乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小细胞肺癌 (SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC))中与正常组织相比特异性升高(Cancer Res 2006Nov 1；66(21) :10339-48, W02005/028676, W02005/089735, W02006/085684, W02007/013665, W02007/013671)，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症或肿 瘤，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/ 或预防它们的手术后复发的药物制剂或药物组合物，其包含一种或多种本发明的肽或编码 所述肽的多核苷酸作为活性组分。或者，可以在任何上述外来体或细胞(诸如APC)的表面 上表达本发明的肽，用它作为药物制剂或药物组合物。另外，上述靶向任何本发明的细胞毒 性T细胞也可用作本发明药物制剂或药物组合物的活性组分。在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗癌症的 药物组合物或药物制剂中的用途(a)本发明的肽，(b)可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明进一步提供用于治疗癌症或肿瘤的选自下组的活性组分(a)本发明的肽，(b)可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物或制剂的方 法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性组分的步骤(a)本发明的肽，(b)可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物 或制剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受载体的 步骤，其中所述活性组分选自下组(a)本发明的肽，(b)可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明的药物组合物或制剂可用于预防癌症或肿瘤和/或预防其手术后复发。本发明的药物制剂或药物组合物可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也 称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。本发明的药物制剂或药物组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺 乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑 猩猩，特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术 后复发。依照本发明，已经发现具有选自SEQ ID NO :3，4，11，14,22和23的氨基酸序列的 多肽是能诱导强且特异性免疫应答的HLA-AM限制性表位肽或者候选者。因此，包括任何 这些具有氨基酸序列SEQ ID N0:3，4，ll，14，22和23的多肽的本发明药物制剂特别适合于 对其HLA抗原为HLA-AM的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些多肽的多核苷酸 的药物制剂或药物组合物。要用本发明的药物制剂或药物组合物治疗的癌症或肿瘤不受限制，包括其中涉及 CDCAl的所有种类的癌症或肿瘤，包括例如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小细胞肺癌(SCLC)和 非小细胞肺癌(NSCLC)。在上述活性组分之外，本发明的药物制剂或药物组合物可含有其它具有诱导针对 癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细 胞、等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例 如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。如果需要，本发明的药物制剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性 组分，只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗 炎剂、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。在药物自身中包括其它治疗性物质之外，本发明的药物还 可以与一种或多种其它药理学作用剂顺序或同时施用。药物和药理学作用剂的量取决于例 如所使用的药理学作用剂的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。应当理解，在本文中具体提及的组分之外，本发明的药物制剂或药物组合物可包 括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它作用剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的药物制剂或药物组合物可包括在制品和试 剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制 品可包括任何本发明药物制剂或药物组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和 试管。容器可以是用多种材料制成的，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药物制剂 用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。在上文描述的容器之外，包括本发明药物制剂或药物组合物的试剂盒可任选进一 步包括第二容器，其中装有药学可接受的稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看可 取的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插 页。如果期望，药物制剂或药物组合物可存在于药包或分配器装置中，该药包或分配 器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂量形式。例如，药包可包括金属或塑料箔， 诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。(1)含有肽作为活性组分的药物制剂或药物组合物本发明的肽可以直接作为药物制剂或药物组合物施用，或者如果必要，通过常规 配制方法加以配制。在后一种情况中，在本发明的肽之外，还可以视需要包括通常用于药物 的载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、 培养液、等等。另外，药物制剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面 活性剂等等。本发明的药物制剂或药物组合物可用于抗癌目的。本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合，以在体内诱导CTL。肽 组合可采取鸡尾酒的形式，或者可通过标准技术彼此缀合。例如，可以将各个肽化学连接起 来，或者表达成单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示 的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以对受试者施用在它们的 细胞表面上展示任何本发明肽的APC，结果在受试者中诱导CTL，而且可提高针对癌细胞的 攻击性；这样的APC可通过用本发明的肽刺激衍生自受试者的APC(例如DC)来获得。包括本发明的肽作为活性组分、用于治疗和/或预防癌症或肿瘤的药物制剂或药 物组合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者，药物制剂或药物组合物可以与 其它活性组分一起施用，或者可以通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的 蛋白质一起(或顺序)施用时可增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐 剂包括文献中记载的(ClinMicrobiol Rev 1994，7 :277-89)。合适佐剂的例子包括但不限 于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、等等。另外，可方便地使用脂质体制剂；其中肽结合于数微米直径的珠子的颗粒制剂； 和其中脂质结合于肽的制剂。在一些实施方案中，本发明的药物制剂或药物组合物可进一步包括引发(prime) CTL的成分。脂质已经被鉴定为能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂。例如，可将 棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的和氨基，然后连接至本发明的肽。然后可以将该 脂化肽在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化后施用。作为引发CTL应答 的脂质的另一个例子，大肠杆菌(E. coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝 氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当共价连接至适宜肽时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al.,Nature 1989,342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至 靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量 可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整，通常是0. OOlmg至 lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数 月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。(2)含有多核苷酸作为活性组分的药物制剂或药物组合物本发明的药物制剂或药物组合物也可含有可表达形式的编码本文中公开的肽的 核酸。在本文中，短语“可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成可诱 导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括 多核苷酸表达所必需的调节元件。可配备多核苷酸，以实现稳定插入靶细胞的基因组(关 于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51:503-12)。 参见例如 Wolff et al. ,Science 1990，247 :1465-8 ；美国专利 No. 5，580，859 ;5，589，466 ； 5，804, 566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；及 WO 98/04720。基于 DNA 的投递技术的例 子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介 导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No. 5，922，687)。本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主， 诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如痘苗病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。 在导入宿主后，重组痘苗病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种 方案的痘苗载体和方法记载于例如美国专利No. 4，722，848。另一种载体是卡介苗(BCG， Bacille Calmette Guerin)。BCG 载体记载于 Stover et al. , Nature 1991,351:456-60。 其它多种可用于治疗性施用或免疫接种的载体是显而易见的，例如腺病毒和腺伴随病毒载 体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此 类。参见例如 Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock et al.，J Leukoc Biol 2000,68 :793-806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。将多核苷酸投递入受试者可以是直接地，其中使受试者直接暴露于携带多核苷酸 的载体，或者是间接地，其中首先在体外用感兴趣的多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入 受试者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 :488-505 ；Wu and Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993,33 :573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-32 ；Morgan & Anderson，Arm Rev Biochem 1993,62 :191-217 ；Trends inBiotechnology 1993,11(5) 155-215。Ausubel 等人编著的 Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993 及 Krieger, Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中记载的重组DNA技术领域公知的方法也可以用于本发明。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局 部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。可以依 据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽 的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量，通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术 人员能恰当选择合适的剂量。IX.使用肽、外来体、APC和CTL的方法本发明的肽和编码此类肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL。本发明的外来体和 APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要 该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，上述任何本发明药物制剂或药物组合物均可 用于诱导CTL，而且在它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论 的。(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法本发明提供了使用本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸来诱导APC的方法。APC 的诱导可以如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述来实施。本发明还提供了用于诱导具有高 水平CTL诱导能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈递细胞”项目下也提到了这种诱导。(2)诱导CTL的方法另外，本发明提供了使用本发明的肽、编码所述肽的多核苷酸、呈递所述肽的外来 体或APC来诱导CTL的方法。本发明还提供一种使用编码如下所述的多肽的多核苷酸来 诱导CTL的方法，所述多肽能够形成可识别本发明的肽与HLA抗原的复合物的T细胞受体 (TCR)亚基。优选的是，用于诱导CTL的方法包括至少一个选自下组的步骤a:使其表面上呈递HLA抗原与本发明肽的复合物的抗原呈递细胞和/或外来体接 触⑶8阳性T细胞，和b:将编码能够形成可识别本发明的肽与HLA抗原的复合物的TCR亚基的多肽的多 核苷酸导入⑶8阳性T细胞。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出CTL，而且靶向癌细胞的 免疫应答的强度增大。或者，肽和编码肽的多核苷酸可用于离体治疗方法，其中在体外使本 发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APC和CD8阳性细胞或外周血单个核白细胞，并在诱 导CTL后，将活化的CTL细胞返还给受试者。例如，该方法可包括下述步骤a:自受试者收集APC;b 使肽接触步骤a的APC ；c 将步骤b的APC与⑶8+T细胞混合，并共培养以诱导CTL ；并d:自步骤c的共培养物收集⑶8+T细胞。或者，依照本发明，提供了本发明的肽在制备用于诱导CTL的药物制剂或药物组 合物中的用途。另外，本发明提供了一种制备用于诱导CTL的药物制剂或药物组合物的方 法或工艺，其中该方法包括将本发明的肽与药学可接受载体一起混合或配制的步骤。另外， 本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。通过步骤d获得的具有细胞毒性活性的⑶8+T细胞可作为疫苗施用于受试者。上 文步骤c中用来与⑶8+T细胞混合的APC也可通过将编码本发明肽的基因转移入APC来制 备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中详述的；但是不限于此。因而，任何可将本发明的肽 有效地呈递给T细胞的APC或外来体均可用于本发明的方法。提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发 明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。实施例材料和方法细胞系通过将Epstein-Bar病毒转化入HLA-AM阳性人B淋巴细胞，建立了 AM淋巴母 细胞样细胞系(AMLCL)细胞。自⑶CAl衍牛的肽的候诜物诜择使用结合预测软件“BIMAS“ (http //www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla bind)预测了⑶CAl衍生的结合HLA-AM402的9聚物和10聚物肽，该算法记载于Parker KC et al.J Immunol 1994,152(1) 163-75 及 Kuzushima K et al. Blood 2001,98(6) 1872-81。由 American Peptide Company Inc. (Sunnyvale, CA)依照标准固相合成法合成 了这些肽，并通过反相高效液相层析(HPLC)进行了纯化。分别通过分析性HPLC和质谱术 分析测定了肽的纯度(> 90% )和身份。将肽以20mg/ml在二甲亚砜(DMSO)中溶解，并保 存于-80°C。体外CTL诱导使用单核细胞衍生树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对人白细 胞抗原(HLA)上呈递的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如别处所述(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112-8)在体外生成 DC。具体而言，将用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_AM402阳性)分离的外周血单个核 细胞(PBMC)通过塑料组织培养皿粘附(BectonDickinson)来加以分离，以富集它们的单 核细胞级分。将富集了单核细胞的群体在含有2%热灭活自体血清(AQ的AIM-V培养基 (Invitrogen)中、于1000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和 1000U/ml白介素(IL)-4(R&D System)存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC 在AIM-V培养基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37°C 冲激3小时。所生成的细胞表现出在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如CD80、CD83、 ⑶86和II类HLA(数据未显示)。然后将这些经肽冲激的DC用丝裂霉素C(MMC)灭活(30 微克/ml，30min)，并以1 20比例与自体CD8+T细胞混合；自体CD8+T细胞是用CD8阳性 分离试剂盒(Dynal)通过正选择获得的。在48孔板(Corning)中设立这些培养物；每个 孔在0. 5mlAIM-V/2% AS培养基中含有1. 5x IO4个经肽冲激的DC、3x IO5个CD8+T细胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后，给这些培养物补充 IL-2 (CHIRON)至终浓度 20IU/ml。 在第7天和第14天，将T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。每次的DC均通过与上文 所述相同的方式来制备。在第21天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的A24LCL细胞的 CTL(Tanaka H et al. ,Br J Cancer2001Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 200IApr 20,84(8) :1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24) 8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2006May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. ,Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。CTL扩增程序使用与Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 19950ct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb,2(2) :216-23)记载的方法相似的方法在培养物中扩增CTL。在40ng/ml抗CD3单克隆抗体(Pharmingen)存在下，将总共切IO4个 CTL与两种经MMC灭活的人B-淋巴母细胞样细胞系一起悬浮在25ml AIM-V/5% AS培养基 中。启动培养后一天，向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天给培养 物补加新鲜的含有 30IU/ml IL-2 的 AIM-V/5% AS 培养基(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 200IJan 5,84(1) 94-9 ；Umano Y et al. , Br J Cancer 2001Apr 20,84(8) :1052-7; Uchida N et al.，ClinCancer Res 2004Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. ,Cancer Sci 2006May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。CTL克降的津立在96孔圆底微量滴定板(Nalge Nunc hternational)中进行稀释以获得0. 3、 1、和3个CTL/孔。在总共150 μ 1/孔含有5% AS的AIM-V培养基中将CTL与IxlO4个细 胞/孔的两种人B-淋巴母细胞样细胞系、30ng/ml的抗⑶3抗体、和125U/ml IL-2 一起温 育。10天后向培养基添加50 μ 1/孔IL-2，以达到终浓度125U/ml IL-2。在第14天测试 CTL活性，并使用与上文所述相同的方法来扩增CTL克隆(Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24) :8577-86 ；SudaT et al. , Cancer Sci 2006May,97(5) :411-9; Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。特异件CTL活件为了检查特异性CTL活性，实施干扰素(IFN)-Y酶联免疫斑点(ELISP0T)测定和 IFN-Y酶联免疫吸附测定(ELISA)。具体而言，制备经肽冲激的A24LCL (lx IO4/孔)作为 刺激细胞。使用48孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商的规程实施IFN-γ ELISP0T 测定和IFN-γ ELISA测定。强迫表达靶基因和/或HLA-A24的细胞的建立通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-AM的可读框的cDNA。将PCR扩增产物克隆 入pCAGGS载体。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推荐的规程将质粒转 染入C0S7，一种无靶基因和HLA-AM的细胞系。自转染起2天后，用Versene(Invitrogen) 收获经过转染的细胞，并用作CTL活性测定的靶细胞(5x IO4个细胞/孔)。MM自⑶CAl衍生的HLA-A24结合肽的预测表1依最高结合亲和力的次序显示⑶CAl的HLA_AM402结合肽。选择并检查了 总共40种具有潜在HLA-AM结合能力的肽以确定表位肽。表1 自CDCAl衍生的HLA-AM结合肽
权利要求
1.一种具有细胞毒性τ淋巴细胞(CTL)诱导能力的分离的肽，其中该肽包含氨基酸序 列SEQ ID NO 35或其片段。
2.权利要求1的分离的肽，其中该肽是九肽或十肽。
3.权利要求1或2的分离的肽，其中该肽包含选自下组的氨基酸序列(a)SEQID NO :3，4，11，14，22 和 23 ；禾口(b)SEQID NO :3，4，11，14，22和23，其中替代、插入、删除或添加了 1，2或数个氨基酸。
4.权利要求1-3的分离的肽，其具有下面的两项特征之一或二者(a)所述SEQID NO的氨基酸序列的N端起第二个氨基酸是选自下组的氨基酸，或被修 饰成选自下组的氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，和(b)所述SEQID NO的氨基酸序列的C端氨基酸是选自下组的氨基酸，或被修饰成选自 下组的氨基酸苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4任一项的肽。
6.一种用于诱导具有高CTL诱导能力的抗原呈递细胞的方法，其使用权利要求1-4中 任一项所述的肽和/或权利要求5中所述的多核苷酸进行。
7.权利要求6的方法，其中所述方法包括下面的两个步骤之一或二者(a)使抗原呈递细胞接触权利要求1-4任一项中所述的肽，和(b)将权利要求5中所述的多核苷酸导入抗原呈递细胞。
8.一种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面上呈递权利要求1-4任一项中所述的肽。
9.权利要求8的抗原呈递细胞，其中所述细胞是通过权利要求6或7的方法诱导的。
10.一种诱导CTL的方法，其是通过使用下述进行的(a)权利要求1-4任一项中所述的肽；(b)权利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈递权利要求1-4任一项中所述的肽的抗原呈递细胞和/或外来体；(d)编码能够形成识别权利要求1-4任一项所述的肽与HLA抗原的复合物的T细胞受 体(TCR)亚基的多肽的多核苷酸；或(e)它们的组合。
11.权利要求10的方法，其中所述方法包括至少一个选自下组的步骤(a)使CD8阳性T细胞接触在其表面上呈递权利要求1-4任一项中所述的肽的抗原呈 递细胞和/或外来体，和(b)将编码能够形成识别权利要求1-4任一项中所述的肽与HLA抗原的复合物的T细 胞受体(TCR)亚基的多肽的多核苷酸导入⑶8阳性T细胞。
12.一种用于诱导CTL的作用剂，其中所述作用剂包含选自下组的活性组分(a)权利要求1-4任一项中所述的肽；(b)权利要求5中列出的多核苷酸；(c)在它的表面上呈递权利要求1-4任一项中所述的肽的抗原呈递细胞和/或外来体；和(d)它们的组合。
13.一种分离的CTL，其靶向权利要求1-4的任一种肽。
14.一种分离的CTL，其是通过权利要求10或11的方法诱导的。
15.一种药物制剂，其包含选自下组的活性组分(a)至少一种权利要求1-4任一项中所述的肽；(b)至少一种权利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈递至少一种权利要求1-4任一项中所述的肽的抗原呈递细胞和/或 外来体；(d)权利要求13或14的CTL；和(e)它们的组合，与药学可接受载体组合，配制用于选自下组的目的 (i)治疗癌症； ( )预防癌症；(iii)预防癌症的手术后复发；和(iv)它们的组合。
16.一种在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施 用下述各项的步骤(a)权利要求1-4任一项中所述的肽；(b)权利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈递权利要求1-4任一项中所述的肽的抗原呈递细胞和/或外来体；(d)权利要求13或14的CTL；或(e)它们的组合。
17.一种用于在受试者中诱导抗肿瘤免疫力的疫苗，所述疫苗包含选自下组的活性组分(a)权利要求1-4任一项中所述的肽；(b)权利要求5中所述的多核苷酸；(c)在其表面上呈递权利要求1-4任一项中所述的肽的抗原呈递细胞和/或外来体；(d)权利要求13或14的CTL；和(e)它们的组合。
18.权利要求15的药物制剂或权利要求17的疫苗，其配制为供施用于HLA抗原为 HLA-A24的受试者。
19.权利要求16的方法，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-AM。
全文摘要
本文中公开了针对癌症的肽疫苗。具体而言，本发明描述了自CDCA1衍生的引发CTL的表位肽。本发明还提供特异性识别经所述肽冲激的HLA-A24阳性靶细胞的建立的CTL。还提供了呈递任何所述肽的抗原呈递细胞和外来体以及用于诱导抗原呈递细胞的方法。本发明进一步提供含有CDCA1多肽或编码它们的多核苷酸以及外来体和抗原呈递细胞作为活性组分的药物制剂。另外，本发明提供了用于治疗和/或预防(即防范)癌症(肿瘤)，和/或预防它们的手术后复发的方法，以及用于诱导CTL的方法、用于诱导抗肿瘤免疫的方法，这些方法使用本发明的CDCA1多肽、编码所述多肽的多核苷酸、呈递所述多肽的外来体或抗原呈递细胞、或药物制剂。要治疗的癌症包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、食道癌、小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。
文档编号C12N5/00GK102119171SQ20098013120
公开日2011年7月6日 申请日期2009年6月18日 优先权日2008年6月19日
发明者吉村祥子, 大泽龙司, 角田卓也 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司