Inhbb表位肽及包含它的疫苗的制作方法

专利名称：Inhbb表位肽及包含它的疫苗的制作方法
技术领域：
本申请要求2008年8月19日提交的美国临时申请No. 61/089，973的权益，通过述及将其全部内容收入本文。
本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗极其有效的新肽，及用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术：
已经证明，⑶8阳性CTL可识别主要组织相容性复合物(MHC) I类分子上出现的肿瘤相关抗原(TAA)衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的第一个例子——黑素瘤抗原(MAG 家族被发现起，人们主要通过免疫学手段(NPL 1 =Boon T, Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 ；NPL 2 =Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1,183(3) 725-9)已经发现了许多其它TAA。人们正在将这些TAA中的一些作为免疫治疗的靶标进行临床开发。
能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类型癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用(NPL 3 =Harris CC, J Natl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 ；NPL 4 =Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul 1， 59(13) :3134-42 ；NPL 5 =Vissers JL et al. , Cancer Resl999Nov 1,59(21) :5554-9 ；NPL 6 :van der Burg SH et al. , J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14 ；NPL 7 :Tanaka F et al.，Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 ；NPL 8 =Fujie T et al.，Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72；NPL 9 =Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) 459-66 ；NPL 10 =Oiso M et al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94)。到此为止， 已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽进行临床试验的报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客观应答率(NPL 11 =Belli F et al. , J Clin 0ncol20020ct 15,20(20) :4169-80；NPL 12 =Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42 ；NPL 13=Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004Sep,10(9) :909-15)。
近来已经开发了用于预测结合I类HLA的肽序列的算法(NPL 14 Journalof Immunological Methods, (1995)，Vol. 185，pp.181-190, NPL 15 J. Immunol.，(1994)， Vol. 152，pp. 163-175，NPL 16 :protein science, (2000)，Vol. 9，pp. 1838-1846)。然而， 难以估计预测的表位肽是否能够在靶细胞中被天然地加工并与HLA分子一起表达在靶细胞表面° 而且，此类算法，例如 BIMAS (bimas. dcrt. nih. gov/cgi_bin/molbio/ken_parker_ comboform)(NPL 17 =Parker KC, et al.，(1994)J Immunol. ；152(1) :163-75. ；NPL18 Kuzushima K, et al.，(2001)Blood. ；98(6) 1872-81.)，可能会提示不太强健的 HLA 分子结合肽(NPL 19 =Bachinsky MM, et. al. , Cancer Immun. 2005Mar 22 ；5 :6.)，因此，TAA 筛选仍然是困难且有挑战性的。
抑制素是由一个α亚单位(INHA)和两种β亚单位之一(β -A或β -B)构成的异二聚体糖蛋白。抑制素β B (INHBB)是抑制素和激活素二者的亚基。抑制素和激活素是两种紧密相关但生物作用相反的糖蛋白。最近通过使用包含23，040种基因的全基因组cDNA微阵列进行表达谱分析，显示INHBB在数种癌症如非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(PTL 1 W02005/019475 ；PTL 2 :W02007/0i;3575)、和食道癌(参见 PTL 3 :W02004/031413, PTL 4 W02005/019475, PTL 5 :W02007/013575，及 PTL 6 :W02007/013671，本文通过提述并入它们的全部内容)中上调。因此，INHBB是癌症免疫疗法的一个令人感兴趣的靶标，自该蛋白衍生的CTL诱导性表位肽是本领域技术人员追求的对象。 引用列表非专利文献 Boon T, Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 Boon T&amp ；van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1,183(3) :725-9 [NPL 3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 [NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul 1,59(13) :3134-42 [NPL 5]Vissers JL et al. ，Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554-9 [NPL 6]van der Burg SH et al. ，J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14 [NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15,57(20) :4465-8 [NPL 8]Fujie T et al. ， Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72 [NPL 9]Kikuchi M et al. ， Int J Cancer 1999May 5,81(3) :459-66 [NPL 10]Oiso M et al. ， Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94 [NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 20020ct 15,20(20) :4169-80 [NPL 12]Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42 [NPL 13]Rosenberg SA et al. ，Nat Med 2004Sep,10(9) :909-15 [NPL 14]Journal ofImmunological Methods, (1995), Vol. 185,pp.181-190 [NPL 15] J. Immunol.，(1994)，Vol. 152，pp. 163—175 [NPL 16]protein science, (2000), Vol. 9,pp.1838-1846 [NPL 17]Parker KC, et al.，(1994)J Immunol. ；152(1) :163-75. [NPL 18]Kuzushima K, et al.，(2001)Blood. ；98(6) :1872-81. [NPL 19]Bachinsky MM,et al.，Cancer Immun. 2005Mar 22 ；5 6. 专利文献 W02005/019475 [PTL 2]W02007/013575 [PTL 3]W02004/031413 [PTL 4]W02005/019475 [PTL 5]W02007/013575 [PTL 6]W02007/013671 发明概述本发明部分基于合适的免疫疗法靶标的发现。由于TAA —般会诱导免疫耐受，因此引发的免疫原性不好，适宜靶标的发现是极其重要的。在认识到INHBB已经被鉴定为在胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCC)和软组织肿瘤的癌症组织中上调的基础上，本发明以由GenBank登录号NM_002193 (SEQ ID NO 15)的基因编码的人抑制素，β B(INHBB)蛋白(SEQ ID NO 16)为对象进行了进一步分析。具体而言，选择了含有可引发对相应分子特异性的CTL的表位肽的INHBB基因产物进行研究。使用 INHBB衍生的HLA-A*0201结合候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。建立了可特异性识别经相应候选肽冲激的HLA-A02阳性靶细胞的CTL，而且鉴定了能诱导针对表达在肿瘤细胞表面上的INHBB的强而特异性的免疫应答的HLA-A02限制表位肽。这些结果证明了 INHBB具有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫疗法的有效靶标。
因而，本发明的一个目的是提供具有选自SEQ ID NO 1_14的氨基酸序列且具有 CTL诱导能力的肽。此外，本发明涵盖经过修饰的肽，其中替代或添加了一个、两个或更多个氨基酸而得到的序列，只要经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。
当对受试者施用时，本发明的肽呈递在抗原表达细胞的表面上，然后诱导靶向相应肽的CTL。因此，本发明的一个目的是提供呈递任何本发明肽的抗原呈递细胞，以及用于诱导抗原呈递细胞的方法。施用本发明的INHBB多肽或编码该多肽的多核苷酸、以及呈递 INHBB多肽的外来体和抗原呈递细胞诱导抗肿瘤免疫应答。因此，本发明的又一个目的是提供含有所述多肽或编码它们的多核苷酸，以及外来体和抗原呈递细胞作为活性组分的药物制剂。本发明的药物制剂可用作疫苗。
此外，本发明的另一个目的是提供治疗和/或预防(即防范)癌症(肿瘤)，和/ 或预防其手术后复发的方法，以及用于诱导CTL的方法、用于诱导针对肿瘤相关内皮的免疫应答及抗肿瘤免疫的方法，这些方法包括施用本发明的INHBB多肽、编码INHBB多肽的多核苷酸、呈递INHBB多肽的外来体或抗原呈递细胞或药物制剂的步骤。另外，本发明的CTL 还可用作针对癌症的疫苗。癌症的例子包括但不限于胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌 (NSCLC)、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCC)和软组织肿瘤。
要理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的实施方案，而非限制本发明或本发明的其它备选实施方案。
附图简述 在考虑本发明的附图简述和后面的详细描述及优选实施方案后，本发明的各方面和应用对于熟练技术人员会变得显而易见。


图1包括一系列照片，(a)-(η)，描绘用INHBB衍生肽诱导的CTL的 IFN-γ ELISP0T 测定的结果。用 INHBB-A02-9-213(SEQ ID NO 1)刺激的 4 号孔(a)、用 INHBB-A02-9-174(SEQ ID NO 2)刺激的 5 号和 7 号孔(b)、用 INHBB-A02-9-257 (SEQ ID NO 3)刺激的 8 号孔(c)、用 INHBB-A02-9-313(SEQ ID NO 4)刺激的 1 号和 8 号孔(d)、 用 INHBB-A02-9-313(SEQ ID NO 4)刺激的 4 号和 8 号孔(e)、用 INHBB-A02-9-8 (SEQ ID NO 6)刺激的 4 号孔(f)、用 INHBB-A02-9-250 (SEQ ID NO 7)刺激的 6 号孔(g)、 用 INHBB-A02-10-179(SEQ ID NO 8)刺激的 5 号孔(h)、用 INHBB-A02-10-237 (SEQ ID NO 9)刺激的 3 号孔⑴、用 INHBB-A02-10-313 (SEQ ID NO 10)刺激的 5 号孔(j)、用 INHBB-A02-10-173(SEQ ID NO :11)刺激的 3 号和 7 号孔(k)、用 INHBB-A02-10-256 (SEQ ID NO 12)刺激的 4 号孔(1)、用 INHBB-A02-10-162 (SEQ ID NO 13)刺激的 7 号孔(m)、和用INHBB-A02-10-85 (SEQ ID NO 14)刺激的7号孔(η)中的CTL分别显示与对照相比强的 IFN-Y生成。在图中，"+"指示孔中的靶细胞用适宜的肽冲激过，而"指示靶细胞没有用任何肽冲激过。
图2所描绘的线图显示用INHBB-A02-9-174(SEQ ID NO 2)刺激的CTL系的建立的IFN-γ ELISA测定结果。所描绘的结果显示，用肽刺激而建立的CTL系显示了与对照相比强的IFN-γ生成。在图中，“+"指示孔中的靶细胞用适宜的肽冲激过，而"指示靶细胞没有用任何肽冲激过。
实施方案的描述 现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于特定大小、性状、尺度、材料、方法、方案等，因为它们可依照例行实验和优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。
通过述及明确将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。
如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅为举例说明而不构成限制。
I.定义 如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非另有明确说明。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基(诸如相应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。
如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及与天然存在型氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在型氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、 和0-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结构(α碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物” 指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。
术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，而且，与氨基酸类似，除非另有明确说明，通过它们普遍接受的单字母代码来指称。
除非另有定义，术语“癌症”指过表达INHBB基因的癌症，其实例包括但不限于胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。
II.肽 为了证明INHBB衍生的肽发挥被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别的抗原的功能，对INHBB(SEQ ID NO 16)衍生的肽进行分析以确定它们是否为HLA-A02 (它是常见的 HLA 等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al.，TissueAntigens 47:93-101,1996; Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；KuboRT et al.，J Immunol 152 :3913-24, 1994)。基于它们对HLA-A02的结合亲和力来鉴定INHBB衍生的HLA-A02结合肽的候选者。 通过加载了这些肽的树突细胞(DC)来体外刺激T细胞后，使用SEQ ID NO :1_14中的每一种肽，尤其是下面的肽，成功建立了 CTL。
NHBB-A02-9-174(SEQ ID NO 2), INHBB-A02-9-257(SEQ ID NO 3), INHBB-A02-9-313(SEQ ID NO 4), INHBB-A02-9-139(SEQ ID NO 5), INHBB-A02-9-8(SEQ ID NO 6), INHBB-A02-9-250(SEQ ID NO 7), INHBB--A02--10-179(SEQIDNO8), INHBB--A02--10-237(SEQIDNO9), INHBB--A02--10-313(SEQIDNO10), INHBB--A02--10-173(SEQIDNO:11)， INHBB--A02--10-256(SEQIDNO12), INHBB--A02--10-162(SEQIDNO13) 和 INHBB-A02-10-85 (SEQ ID NO: 14) 这些建立的CTL显示针对经相应肽冲激的靶细胞的强且特异性的CTL活性。本文中的这些结果证明INHBB是被CTL识别的抗原，而且这些肽可能是受HLA-A02限制的INHBB 表位肽。
由于INHBB基因在大多数癌组织中过表达，例如胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤，它是良好的免疫治疗靶标。因此，本发明提供与INHBB的CTL识别表位对应的九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。本发明的九肽和十肽的特别优选例子包括那些具有选自SEQ ID NO 1-14的氨基酸序列的肽。
一般而言，可使用当前在互联网上可得的软件程序，诸如Parker KC et al. , J Immunol 1994Jan 1，152 (1) :163-75中记载的软件程序，在计算机上(in silico)计算各种肽与HLA抗原之间的结合亲和力。可以如例如Parker KC et al. , JImmunol 1994Jan 1,152(1) :163-75 ；及 Kuzushima K et al.，Blood 2001,98(6) :1872-81 等参考文献中所述来测量与HLA抗原的结合亲和力。例如Journal of Immunological Methods, 1995,185 181-190 ；Protein Science, 2000,9 :1838-1846中记载了用于测定结合亲和力的方法。如此，本发明涵盖结合使用此类已知程序鉴定的HLA抗原的INHBB肽。
本发明的九肽和十肽侧翼可以有额外的氨基酸残基，只要所得的肽保留其CTL诱导能力。此类具有CTL诱导能力的肽通常小于约40个氨基酸，常常小于约20个氨基酸，通常小于约15个氨基酸。本发明九肽和十肽(即由选自SEQ ID NO :1-14的氨基酸序列组成的肽)侧翼的具体氨基酸序列不受限制，而且可以由任何种类的氨基酸组成，只要它不妨碍原始肽的CTL诱导能力。因此，本发明还提供具备CTL诱导能力，且具有选自SEQ ID NO 1-14中的氨基酸序列的肽。
一般而言，蛋白质中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能， 而且在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替代、删除、添加或插入)一个、两个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland etal. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可既具有CTL诱导能力，又具有选自SEQ ID NO :1-14的氨基酸序列中删除、插入、添加和/或替代一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
本领域技术人员认可，向氨基酸序列中添加或替换单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别修饰往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们常规上被称作“保守替代”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似的性质和功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替代表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N, C， E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)； 含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N, E，Q)；含碱侧链(R， K, H)；和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替代的氨基酸 1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)； 5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W)； 7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和 8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。
此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要经过修饰的肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除INHBB 的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。
为了保留必需的CTL诱导能力，可修饰(插入、删除、添加、和/或替代)少量(例如1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。在本文中，术语“数个”意味着5个或更少的氨基酸，例如3个或更少。要修饰的氨基酸的百分比优选20%或更少，更优选15%或更少，甚至更优选10%或更少或者1至5%。
对本发明的优选肽INHBB-A02-9-213(SEQ ID NO :1)、INHBB-A02-9-174 (SEQ ID NO :2)、INHBB-A02-9-257 (SEQ ID NO :3)、INHBB-A02-9-313(SEQ ID NO :4)、 INHBB-A02-9-139(SEQ ID NO :5)、INHBB-A02-9-8(SEQ ID NO :6)、INHBB-A02-9-250(SEQID NO :7)、 INHBB-A02-10-179(SEQ ID NO :8)、 INHBB-A02-10-237(SEQ ID NO: 9)、NHBB-A02-10-313(SEQ ID NO 10)、INHBB-A02-10-173 (SEQ ID NO :11) INHBB-A02-10-256 (SEQ ID NO 12)、INHBB-A02-10-162 (SEQ ID NO 13)禾口 INHBB-A02-10-85 (SEQ ID NO 14)的同源性分析确认了这些肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽不具有显著的同源性。如此，这些肽在用于免疫疗法时产生未知的或不希望的免疫应答的可能性显著降低。因而，预期这些肽对于在肿瘤患者中引发针对癌细胞(诸如胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤)上的 INHBB的免疫力是高度有用的。
当在免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择不仅诱导CTL而且拥有对HLA抗原的高结合亲和力的肽。为此，可通过替代、插入、删除和/或添加氨基酸残基来对肽进行修饰，产生具有改良的结合亲和力的修饰肽。除了天然被展示的肽之外，由于已经知道通过结合 HLA 抗原而被展示的肽的序列规律(J Immunol 1994,152 3913 ；Immunogenetics 1995， 41 178 J Immunol 1994,155 :4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。例如，可以用亮氨酸或甲硫氨酸替代从N端起的第二个氨基酸，和/或用缬氨酸或亮氨酸替代C端氨基酸，以提高HLA-A0201结合。如此，本发明涵盖下述肽，其具有选自SEQ ID NO :1-14中的氨基酸序列，其中上述SEQ ID NO的氨基酸序列的从N端起第二个氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸替代，和/或其中上述SEQID NO的氨基酸序列的C端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸替代。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替代，而且可以在潜在TCR识别位置处引入替代。数项研究证明了肽中的氨基酸替代可等同于或好于原来，例如CAP1、 p53(264_272)、Her-2/neu(369_377)或 gplOOte09_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57,4570-4577, 1997, Τ. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1 ; 168 (3) : 1338-47.，S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52 199-206 及 S. 0. Dionne etal. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004)53,307-314)。
本发明还涵盖向本发明的肽的N和/或C端添加一个至两个氨基酸。本发明也包括此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的经过修饰的肽。
然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症和/或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，首先利用可得的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差1个或2个氨基酸的肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有此类副作用的任何危险。
虽然预期如上所述对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对以高结合亲和力的存在作为指标而选出的候选肽进一步检查CTL诱导能力的存在。在本文中，短语“CTL诱导能力”指肽被呈递在抗原呈递细胞上时诱导细胞毒性淋巴细胞(CTL)的能力。另外，“CTL诱导能力，，包括肽诱导CTL活化和/或CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、 和提高CTL IFN-Y生成的能力。
CTL诱导能力的确认如下来实现，用肽进行刺激来诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或更具体地说衍生自人外周血单核白细胞的DC，与⑶8阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN- γ。 作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamed L， Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000Aug, 61(8) :764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimalepitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice -dependence on HLA classll restricted T (H)response中记载的那些)。例如，可以用51Cr等放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估 测量在携带固定化肽的抗原呈递细胞(APC)存在下由CTL生成和释放的IFN-γ，并使用抗 IFN-Y单克隆抗体显现培养基上的抑制区。
如上所述地检查肽的CTL诱导能力的结果，发现那些对HLA抗原具有高结合亲和力的肽并非必然具有高CTL诱导性。然而，在那些被鉴定和评估的肽中，发现从具有选自 SEQ ID NO :1-14的氨基酸序列的肽中选择的九肽或十肽展现特别高的CTL诱导能力以及对HLA抗原的高结合亲和力。因此，例示这些肽作为本发明的优选实施方案。
在上文所述修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的连接肽保留原始肽的必需的CTL诱导能力。合适物质的例子包括但不限于肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或稳定多肽。
例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如， 可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 此外，本发明的肽可以藉由接头(linker)或间隔物(spacers)与其他的肽相连。所述其他的肽的例子包括但不限于从其他TAA衍生的能诱导CTL的肽。或者，两个或更多个本发明的肽可以藉由接头或间隔物连接起来。由接头或间隔物连接起来的各个肽可以是彼此相同或不同的。接头或间隔物没有特殊限制，但优选的是肽，更优选的是具有一个或多个能够被酶(如肽酶、蛋白酶和蛋白酶体等)切割的切割位点的肽。接头或间隔物的例子包括但不限于AAY(P.M. Daftarian et al.，J Trans Med 2007,5 26), AAA, NKRK (R. P. Μ. Sutmuller et al.，J Immunol. 2000，165 :7308-7315)或一个到数个赖氨酸残基(S. Ota et al. , Can Res. 62,1471-1476, K.S.Kawamura et al. , J Immunol. 2002,168 5709-5715)。本发明的肽涵盖那些肽藉由间隔物或接头与其他的肽相连而成的肽。
本发明的肽可以作为与MHC分子结合而成的复合物存在于携带人MHC抗原的细胞 (例如抗原呈递细胞)或外来体的表面上。然后诱导CTL。所述的细胞和外来体可以依照本领域公知的技术来制备，例如，所述细胞可以通过与本发明的肽接触来制备，而外来体可以通过从与本发明的肽接触过的细胞收集含有外来体的级分来制备(参见例如日本专利申请特表平11-510507和W099/03499)。本发明的肽涵盖那些作为与MHC分子结合而成的复合体存在于细胞或外来体表面的肽。
本文中，本发明的肽也可以称为“ INHBB肽”或“ INHBB多肽”。
III. INHBB 肽的制备 本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。可个别地合成本发明的肽，或作为由两个或更多个肽构成的较长多肽来合成本发明的肽。然后可以分离，即纯化所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。
可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括但不限于 (i)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ； (ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ； (iii)P印tide Synthesis (日文)，Maruzen Co.，1975 ； (iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( H JC ) Maruzen Co., 1985 ； (ν)Development of Pharmaceuticals(second volume) (in Japanese), Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ； (vi)W099/67^8 ；禾口 (vii) Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, “ Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118。
或者，可借助任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss&Curtiss, Methodsin Enzymology (eds. Wu et al. )1983,101 :347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转移入合适宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产肽。
IV.多核苷酸 本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括由天然存在型INHBB 基因(GenBank登录号NM_002193 (SEQ ID NO :15))衍生的多核苷酸以及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。 因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由碱基诸如A、T、C、和 G合适地构成，而T在RNA中被U替换。
本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中它们之间有或无居间氨基酸序列存在。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrooket al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York, 1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.，EMBO J 1984,3 :801-5 中记载的。
含有本发明的多核苷酸的载体以及携带所述载体的宿主细胞也包含在本发明之内。
V.夕卜来体(exosomes) 本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和W099/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防针对的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型匹配。例如，在日本人和白人中，HLA-A02型是常见的。因此在这些人群中使用A02型对获得有效的结果是有利的，而且亚型如A0201等也是有用的。通常，在临床上，预先对需要治疗的患者的HLA抗原类型进行检查，这样就能够合适地选择对特定抗原具有高水平的结合亲和性，或藉由抗原呈递具有CTL诱导能力的肽。而且，为了获得具备高的结合亲和性和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在型INHBB的部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、 2个或数个氨基酸的替代、插入和/或添加。
当将A02型HLA抗原用于本发明的外来体时，具有选自SEQ ID NO :1_14的序列的肽是有用的。
VI.抗原呈递细胞(APC) 本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离的APC。通过接触本发明的肽或导入处于可表达形式的编码本发明肽的核苷酸而获得的 APC可衍生自要进行治疗和/或预防的患者，而且可作为疫苗以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或细胞毒性T细胞)组合来施用。
APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，DC可用作本发明的APC。
例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。短语“诱导APC”包括用本发明的肽或编码本发明肽的核苷酸接触(刺激)细胞，以在细胞的表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。或者，在将本发明的肽给予APC以容许APC呈递该肽后，可以将这些APC作为疫苗施用给受试者。例如，
13离体施用可包括下述步骤 a 自第一受试者收集APC ； b 用肽接触步骤a的APC ；并 c 对第二受试者施用加载了所述肽的APC。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。或者，依照本发明，提供本发明的肽在制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物中的用途。另外，本发明提供一种制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学可接受的载体混合或配制的步骤。另外，本发明还提供用于诱导抗原呈递细胞的本发明肽。通过步骤b获得的APC可作为疫苗施用于受试者。
依照本发明的一个方面，本发明的APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC可通过下述方法来制备，该方法包括在体外将含有编码本发明肽的多核苷酸的基因转移至APC的步骤。所导入的基因可以是DNA 或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如CancerRes 1996， 56 :5672-7 J Immunol 1998，161 :5607-13 ;J Exp Med 1996，184 :465-72 ；国际公开文本 No. 2000-509281的已
公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHC I类或II类加工，并经由呈递途径呈递给本发明的肽。
VII.细胞毒性T细胞(CTL) 被诱导的针对任何本发明肽的细胞毒性T细胞在体内加强靶向肿瘤相关内皮的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导或活化的、分离的细胞毒性T细胞。
此类细胞毒性T细胞可通过下述步骤来获得(1)对受试者施用本发明的肽然后从该受试者收集细胞毒性T细胞，或( 在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的 APC和CD8阳性细胞、或外周血单核白细胞，然后分离细胞毒性T细胞。
用呈递本发明肽的APC的刺激诱导的细胞毒性T细胞可衍生自要进行治疗和/或预防的患者，而且可以单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以调节效果。所得到的细胞毒性T细胞特异性针对呈递本发明的肽或例如与用于诱导的肽相同的肽的靶细胞起作用。换言之，细胞毒性T细胞可以通过T细胞受体来识别(即结合) 靶细胞表面上的HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物，然后攻击该靶细胞以诱导该靶细胞死亡。靶细胞可以是内源表达INHBB的细胞，或被INHBB基因转染的细胞；而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。
VIII. T 细胞受体(TCR) 本发明还提供包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸序列的组合物，及使用该组合物的方法。所述TCR亚单位具有形成赋予T细胞针对呈递INHBB的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出用一种或多种本发明的肽诱导的CTL中表达的TCR的α和β链的核酸序列(W02007/032255及Morgan et al. , J Immunol, 171,3288(2003)) 0衍生的TCR在体内和体外能以高亲合力结合展示在靶细胞上的INHBB肽，且任选介导对呈递INHBB肽的靶细胞的有效杀伤。
可将编码TCR亚单位的核酸序列掺入合适载体，例如逆转录病毒载体。这些载体是本领域公知的。有用的是，可将核酸或含有它们的载体转移入T细胞，例如来自患者的T 细胞。有利的是，本发明提供一种即配即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。
还有，本发明提供通过用这样的核酸转导而制备的CTL，该核酸编码在HLA-A02背景下结合INHBB肽(例如SEQ ID NO 1-14)的TCR亚单位多肽。经过转导的CTL能够在体内归巢(homing)至癌细胞，而且能在体外通过公知培养方法来扩增(例如Kawakami et al. , J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。本发明的T细胞可用于形成在需要治疗或防护的患者中治疗或预防癌症方面有用的免疫原性组合物(W02006/031221)。
IX.药物制剂或药物组合物 预防和防范包括降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响的活动，这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。或者，预防和防范包括广泛的预防疗法，它们旨在减轻特定病症的严重性，例如降低肿瘤的增殖和转移。
治疗和/或用于预防癌症或肿瘤和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术清除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、 肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，及减轻伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情稳定。
由于INHBB表达在数种癌症中与正常组织相比上调，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症，和/或预防它们的手术后复发的药物制剂或组合物，其包括一种或多种本发明肽或编码所述肽的多核苷酸作为活性组分。或者，可以在任何上述外来体或细胞诸如APC的表面上表达本发明的肽，以用作药物制剂或组合物。另外，上述靶向任何本发明的肽的细胞毒性T细胞也可用作本发明药物制剂或组合物的活性组分。在本发明的语境中，短语“靶向某个肽”是指通过T细胞受体识别(即结合)靶细胞上的HLA抗原与肽之间形成的复合物，然后攻击该靶细胞以诱导该靶细胞的死亡。
在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗癌症的药物组合物或药物制剂中的用途 (a)本发明的肽， (b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸， (C)本发明的 APCJP (d)本发明的细胞毒性T细胞。
或者，本发明进一步提供用于治疗癌症的选自下组的活性组分 (a)本发明的肽， (b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸， (c)本发明的 APCJP (d)本发明的细胞毒性T细胞。
或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗癌症的药物组合物或制剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性组分作为活性组分的步骤 (a)本发明的肽， (b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸， (C)本发明的 APCJP (d)本发明的细胞毒性T细胞。
在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗癌症的药物组合物或制剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受载体的步骤， 其中所述活性组分选自下组 (a)本发明的肽， (b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸， (C)本发明的 APCJP (d)本发明的细胞毒性T细胞。
或者，本发明的药物组合物或制剂可用于防范癌症和/或预防其手术后复发。
本发明的药物制剂或组合物可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。
本发明的药物制剂或组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩， 特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发。
依照本发明，已经发现具有选自SEQ ID NO :1_14的氨基酸序列的多肽或具有选自 SEQ ID NO :1-14的氨基酸序列的多肽分别是能诱导强且特异性免疫应答的HLA-A02限制表位肽或候选者。因此，包括任何这些具有选自SEQID NO :1-14的氨基酸序列的多肽的本发明药物制剂或组合物特别适合于对其HLA抗原为HLA-A02的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些多肽的多核苷酸的药物制剂或组合物。
要用本发明的药物制剂或组合物治疗的癌症不受限制，包括其中涉及INHBB的所有种类的癌症，包括例如胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌 (SCLC)和软组织肿瘤。
除上述活性组分之外，本发明的药物制剂或组合物还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。
如果需要，本发明的药物制剂或组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组分，只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎剂或组合物、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂或组合物顺序或同时施用。药物和药理学作用剂或组合物的量取决于例如所使用的药理学作用剂或组合物的类型、所治疗的疾病、 及施用的时序安排和路径。
应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药物制剂或组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂或组合物。
在本发明的一个实施方案中，本发明的药物制剂或组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药物制剂或组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。 容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂或组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。
除上文描述的容器之外，包括本发明药物制剂或组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。
如果期望的话，药物组合物可存在于药包或分配器装置中，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。
(1)含有肽作为活性组分的药物制剂或组合物 本发明的肽可以作为药物制剂或组合物直接施用，或者如果必要，通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、等等。另外，药物制剂或组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药物制剂或组合物可用于抗癌目的。
本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将各个肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以给受试者施用这样的APC 它们在其细胞表面上展示任何本发明的肽，可以通过用本发明的肽刺激来源于受试者的APC(如DC)而获得； 结果在受试者中诱导CTL，从而可提高针对癌细胞，诸如胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌 (NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤的攻击性。
包括本发明的肽作为活性组分、用于治疗和/或预防癌症的药物制剂或组合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者，它们可以与其它活性组分一起施用，而且它们可以通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或顺序)施用时增强针对蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7 :277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、 霍乱毒素、沙门氏菌毒素、诸如此类，但不限于此。
另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制剂、和其中脂质结合至肽的配制剂。
在一些实施方案中，本发明的药物制剂或组合物可进一步包括引发(Prime)CTL 的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂或组合物。例如，
17可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E. coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al. ,Nature 1989,342 :561-4)。
施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，通常是0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。
(2)含有多核苷酸作为活性组分的药物制剂或组合物 本发明的药物制剂或组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51 503-12)。参见例如 Wolff et al.，Science 1990，247 1465-8 ；美国专利 No. 5，580，859 ； 5，589，466 ；5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；及 WO 98/04720。基于 DNA 的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No. 5，922，687)。
本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主， 诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如痘苗病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。 在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No. 4，722，848。另一种载体的例子包括卡介苗(BCG，Bacille CalmetteGuerin)。BCG 载体记载于 Mover et al.，Nature 1991,351 456-60。有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如 Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock et al.，J Leukoc Biol 2000,68 :793-806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。
将多核苷酸投递入受试者可以是直接的，其中受试者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，其中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入受试者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 :488-505 ；Wu and Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993,33:573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-32 ；Morgan & Anderson，Arm Rev Biochem 1993,62 :191-217 ；Trends inBiotechnology 1993,11(5) 155-215。重组DNA技术领域普遍知道的也可用于本发明的方法记载于eds. Ausubel et al. ,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons,NY, 1993 ^Krieger, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY,1990。
施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。合适载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、 患者的年龄、重量、施用的方法等等来恰当地调整，通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法 本发明的肽和编码此类肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL。本发明的外来体和 APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何前文所述的本发明药物制剂或组合物均可用于诱导CTL，而且除它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论的。
(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法 本发明提供了使用本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸来诱导APC的方法。诱导 APC可以如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述来实施。本发明还提供了用于诱导具有高水平CTL诱导能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈递细胞”项目下也提到了其诱导。
优选的是，诱导APC的方法包括选自下组的至少一个步骤 a 使APC与本发明的肽接触，和 b 将本发明的肽以可表达的形式导入APC。
这样的APC诱导方法优选地以体外或离体的方式实施。当以体外或离体方式实施所述方法时，要诱导的APC可以从待治疗的受试者或者与受试者的HLA抗原相同的其他个体获得。
(2)诱导CTL的方法 另外，本发明提供了使用本发明的肽、编码所述肽的多核苷酸、或呈递所述肽的外来体或APC来诱导CTL的方法。
本发明还提供了使用编码能形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述TCR亚单位识别(即结合)细胞表面上的本发明的肽与HLA抗原之间形成的复合物。优选地，所述诱导CTL的方法包括选自下组的至少一个步骤 a 使⑶8-阳性T细胞与抗原呈递细胞和/或外来体接触，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物；和 b 向⑶8-阳性T细胞中导入编码能够形成TCR亚单位的多肽的多核苷酸，所述 TCR亚单位可识别HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物。
当本发明的肽被施用给受试者后，受试者的身体中诱导出CTL，而且靶向肿瘤相关内皮的免疫应答的强度增强。或者，肽和编码肽的多核苷酸可用于离体治疗方法，其中在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APC和CD8阳性细胞或外周血单核白细胞，并在诱导CTL后，将活化的CTL细胞返还给受试者。例如，该方法可包括下述步骤 a:自受试者收集APC; b 用肽接触步骤a的APC ； c 将步骤b的APC与OT8+T细胞混合，并共培养以诱导CTL ；并 d 自步骤c的共培养物收集OT8+T细胞。
或者，依照本发明，提供了本发明的肽在制备诱导CTL的药物组合物中的用途。另外，本发明提供了一种制备诱导CTL的药物制剂或药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学可接受的载体混合或配制的步骤。另外，本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。
通过步骤d获得的具有细胞毒性活性的OT8+T细胞可作为疫苗施用于受试者。上文步骤c中要与CD8+T细胞混合的APC也可通过将编码本发明肽的基因转移入APC来制备， 如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中详述的；但是不限于此，任何将本发明的肽有效呈递给T 细胞的APC或外来体可用于本发明的方法。
提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例 材料和方法 细胞系 H2 (HLA-A2)、人B-淋巴母细胞样细胞系和C0S7均购自ATCC。
INHBB衍牛的肽的候诜者的诜择 使用结合预测软件〃BIMAS" (www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind)预测了 INHBB衍生的结合HLA-A*0201分子的9聚物和10聚物肽，该算法已由Parker KC等人 (J Immunol 1994,152(1) :163-75)及 Kuzushima K 等人(Blood2001,98 (6) :1872-81)描述。由Sigma(札幌，日本)或Biosynthesis Inc. (Lewisville，TX)依照标准固相合成法合成了这些肽，并通过反相高效液相层析(HPLC)进行了纯化。分别通过分析性HPLC和质谱术分析测定了肽的纯度(> 90% )和身份。将肽以20mg/ml在二甲亚砜(DMSO)中溶解， 并保存于-80°C。
体外CTL诱导 使用单核细胞衍生树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如别处(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112-8)所述在体外生成 DC。具体而言，将用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_A*0201阳性)分离的外周血单个核细胞(PBMC)通过粘附至塑料组织培养皿(Becton Dickinson)来加以分离，以将它们作为单核细胞级分富集。在含有2%热灭活自体血清(AS)的AIM-V培养基(Invitrogen)中在1000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和1000U/ml白介素 (IL)-4(R&D System)存在下培养富集了单核细胞的群体。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在;3mcg/ml β 2-微球蛋白存在下用20mcg/ml每一种合成肽于37 °C 冲激3小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如⑶80、⑶83、 ⑶86和HLA II类(数据未显示)。然后将这些经肽冲激的DC用丝裂霉素C(MMC)灭活 (30mCg/ml，30min)，并以1 20比例与用CD8阳性分离试剂盒(Dynal)通过正选择获得的自体⑶8+T细胞混合。在48孔板(Corning)中设立这些培养物；每个孔在0. 5mlAIM-V/2% AS培养基中含有1. 5x IO4个经肽冲激的DC、3x IO5个CD8+T细胞和10ng/ml IL-7 (R&DSystem)。3天后，给这些培养物补充IL-2 (CHIRON)至终浓度20IU/ml。在第7天和第14 天，将T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。每次通过与上文所述相同的方式来制备 DC。在第21天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的T2细胞的CTL (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 200IApr 20,84(8) 1052-7 ；Uchida Net al. , Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al.,Cancer Sci2006May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. ,Cancer Sci 2005Aug,96(8) 498-506)。
CTI扩增规稈 使用与Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 19950ct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb,2(2) :216-23)记载的方法相似的方法在培养中扩增CTL。将总共切IO4个CTL在25ml AIM_V/5% AS培养基中悬浮，其中有在40ng/ ml抗CD3单克隆抗体(Pharmingen)存在下经MMC灭活的两种人B-淋巴母细胞样细胞系。启动培养后一天，向培养物添加120IU/mlIL-2。在第5天、第8天和第11天给培养物补加新鲜的含有30IU/ml IL-2 的AIM-V/5% AS培养基(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 200IJan 5， 84(1) 94-9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 200IApr 20,84(8) :1052-7 ；Uchida N et al.， ClinCancer Res 2004Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci 2006May, 97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。
特异件CTL活件 为了检查特异性CTL活性，实施了干扰素(IFN)-Y酶联免疫斑点(ELISP0T)测定法和IFN-γ酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体而言，制备经肽冲激的T2(lx IO4/孔)作为刺激细胞。使用48孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商的规程实施IFN-γ ELISP0T 测定法和IFN- y ELISA测定法。
结果 癌症中INHBB表达增强 INHBB表达在下列癌症中相比于相应的正常组织有效上升21例胆管细胞癌中的 10例、12例食道癌中的12例、13例NSCLC中的10例、24例肾癌中的22例、14例SCLC中的 8例、和49例软组织肿瘤中的45例。
使用来自INHBB的预测的HLA-A0201限制型肽刺激T细胞和经INHBB衍生肽刺激的CTL系的建立 依照上文“材料和方法” 一节中描述的方案产生了针对那些INHBB衍生的肽的 CTL0所得到的具有可检测的特异性CTL活性(如IFN-γ ELISP0T测定法测得的)的CTL 示于图1。
IFN-γ ELISP0T 测定法测得 ΙΝΗΒΒ-Α02-9-213 (SEQ ID NO 1), ΙΝΗΒΒ-Α02-9-174 (SEQ ID NO 2)，I NHBB-AO2-9-257 (SEQ ID NO 3), INHBB-A02-9-313(SEQ ID NO 4), INHBB-A02-9-139(SEQ ID NO 5), INHBB-A02-9-8(SEQ ID NO 6), INHBB-A02-9-250 (SEQ ID NO 7)，INHBB-A02-10-179 (SEQ ID NO: 8)，INHBB-A02-10-237 (SEQ ID NO :9)，INHBB-A02-10-313(SEQ ID NO 10), INHBB-A02-10-173 (SEQ ID NO 11)，INHBB-A02-10-256 (SEQ ID NO 12), INHBB-A02-10-162 (SEQ ID NO: 13)和 INHBB-A02-10-85 (SEQ ID NO :14)相比于对照显示
21出强有力的IFN-Y生成。此外，对用SEQ ID NO :2刺激的7号阳性孔中的细胞进行了扩增并建立了 CTL系。通过IFN- y ELISA测定了针对经过肽冲激的靶物的特异性CTL活性高于针对未经肽冲激的靶物的活性的CTL系。
这里的结果显示，相比于未经肽冲激的靶细胞，所述CTL系针对经相应肽冲激的靶细胞显示出强有力的IFN-Y生成。在本发明的语境下，选择了可以建立CTL系的肽作为强CTL刺激肽。
总之，鉴定了从INHBB衍生的新型HLA-A02表位肽，并证明了它们可应用于癌症免疫疗法。
工业实用性 本发明描述了新的TAA，特别是那些INHBB衍生的，它们诱导强有力且特异性的抗肿瘤免疫应答，而且可以应用于极其多种癌症类型。此类TAA保证了进一步开发针对与 INHBB有关的疾病的肽疫苗，所述疾病例如胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
虽然本文中参照具体实施方案详细地描述了本发明，但是要理解，上面的描述本质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。
权利要求
1.一种衍生自SEQ ID NO 16的分离的肽，其中所述肽包含选自下组的氨基酸序列(a)SEQ ID NO :1-14 ；和(b)SEQID而1-14，其中替代、插入、缺失和/或添加了 1个、2个或几个氨基酸， 并且具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力。
2.如权利要求1所述的肽，其中所述肽由少于15个氨基酸残基组成。
3.如权利要求2所述的肽，其中所述肽是九肽或者十肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的肽，其中所述肽包含选自SEQID NO :1-14中的氨基酸序列，且具有下面的一项或两项特征(a)N端起的第二个氨基酸选自亮氨酸或甲硫氨酸，和(b)C端氨基酸选自缬氨酸或亮氨酸。
5.分离的多核苷酸，其编码一种或多种如权利要求1-4中任一项所述的肽。
6.一种药物制剂，其包含选自下列的活性成分(a)一种或多种如权利要求1-4中任一项所述的肽；(b)一种或多种编码所述肽的多核苷酸；(c)一种或多种抗原呈递细胞和/或外来体，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物；(d)一种或多种针对如权利要求1-4中任一项的肽的经诱导的CTL ；和(e)上述的组合，与药理学可接受的载体组合，配制为用于选自下组的目的 (i)治疗癌症， ( )预防癌症，(iii)防止癌症手术后复发，和(iv)上述的组合。
7.如权利要求6所述的药物制剂，其配制为供施用给其HLA抗原为HLA-A02的受试者。
8.如权利要求6所述的药物制剂，其中所述癌症选自胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
9.如权利要求6所述的药物制剂，其中所述制剂配制成疫苗。
10.一种诱导具有高的CTL诱导能力的抗原呈递细胞的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤(a)使抗原呈递细胞与如权利要求1-4中任一项所述的肽接触；和(b)将处于可表达形式的编码所述肽的多核苷酸导入抗原呈递细胞。
11.一种诱导CTL的方法，其中所述方法包括选自下组的步骤(a)使CD8-阳性T细胞与抗原呈递细胞和/或外来体接触，所述抗原呈递细胞和外来体呈递HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物；和(b)向CD8-阳性T细胞中导入编码能够形成TCR亚单位的多肽的多核苷酸，所述TCR 亚单位可识别HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物。
12.—种分离的CTL，其靶向任何权利要求1-4所述的肽。
13.一种分离的CTL，其是由如权利要求1-4中任一项所述的肽诱导的。
14.如权利要求12或13所述的CTL，其中所述CTL能够识别细胞表面上HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物。
15.如权利要求12-14所述的CTL，其是通过如权利要求11的方法诱导的。
16.一种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面上呈递HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物。
17.如权利要求16所述的抗原呈递细胞，其是通过如权利要求10的方法诱导的。
18.如权利要求16或17所述的抗原呈递细胞，其中所述HLA抗原是HLA-A02。
19.一种用于诱导受试者中抗癌症免疫应答的作用剂，其中所述作用剂包含选自下组的活性成分(a)一种或多种如权利要求1-4中任一项所述的肽；(b)一种或多种处于可表达形式的编码所述肽的多核苷酸；(c)一种或多种抗原呈递细胞和/或外来体，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物；(d)一种或多种针对如权利要求1-4中任一项的肽的经诱导的CTL ；和(e)上述的组合。
20.一种诱导受试者中抗癌症免疫应答的方法，其中所述方法包括对所述受试者施用包含选自下组的活性成分以及药理学可接受的载体的作用剂的步骤(a)一种或多种如权利要求1-4中任一项所述的肽；(b)一种或多种处于可表达形式的编码所述肽的多核苷酸；(c)一种或多种抗原呈递细胞和/或外来体，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与如权利要求1-4中任一项所述的肽之间形成的复合物；(d)一种或多种针对如权利要求1-6中任一项的肽的经诱导的CTL ；和(e)上述的组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症选自胆管细胞癌、食道癌、非小细胞肺癌 (NSCLC)、肾癌、小细胞肺癌(SCLC)和软组织肿瘤。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述受试者具有HLA-A02。
23.一种诱导CTL的作用剂，其中所述作用剂包含一种或多种权利要求1-4中任一项的肽、编码所述肽的多核苷酸、或权利要求16-18中任一项的分离的抗原呈递细胞。
全文摘要
本发明描述了抗癌肽疫苗。具体地说，本发明描述了衍生自INHBB的可引发CTL的表位肽。本发明还提供了建立的CTL，它们特异性识别用所述肽冲激过的HLA-A02阳性靶细胞。还提供了呈递任何所述肽的抗原呈递细胞和外来体，以及用于诱导抗原呈递细胞的方法。本发明进一步提供了含有所述INHBB多肽或编码它的多核苷酸，以及外来体和抗原呈递细胞作为活性成分的药物组合物。此外，本发明提供使用本发明的INHBB多肽、编码所述多肽的多核苷酸、呈递所述多肽的抗原呈递细胞或外来体、或药物制剂的治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，以及诱导CTL的方法，诱导抗肿瘤免疫的方法。
文档编号A61P35/00GK102186977SQ20098014134
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月14日 优先权日2008年8月19日
发明者角田卓也, 大泽龙司, 吉村祥子 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司