专利名称：包含热敏性转基因的疫苗的制作方法
技术领域：
该技术涉及来源于嗜冷细菌的基因，用于热敏性疫苗的开发。在一个实例中，所述技术涉及含有冷红科尔韦尔氏菌(Colwellia psychrerythraea)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)和冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)的热敏性基因IigA以及冷红科尔韦尔氏菌的基因ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、murG、fmt和dnaK的重组病原体。
背景技术：
抗细菌和病毒疾病的疫苗在减少人的传染病中已经起到了重要作用；然而，仍然存在对用于减少目前全世界的传染病负担的新型疫苗的需要。适冷病毒已被用作抗人病毒疾病的疫苗达数十年。这类疫苗的最广为人知的实例是Sabin脊髓灰质炎病毒疫苗。另一实例是名为FIulVIist* (Medimmune LLC, Gaithersburg, MD, USA)的适冷流感疫苗,其在2003年引入美国,,F丨uMist 已被证明在某些人口统计组中比实施使用灭活病毒来刺激免疫反应的更常见免疫接种策略的流感疫苗有效得多。通常，已经通过在低温下将病毒在卵中或细胞培养物中反复传代然后测试其后代能否在高于约37°C (通常被认为“正常”人体温度)下生长而开发出适冷的或“温度敏感性”(TS)病毒株。“正常”人体温度的概念考虑解剖学位点、个体差异、性别、生理条件和环境温度。尽管存在若干变量，然而人体仅可在一个非常窄的温度范围内发挥功能，其通常为约36° C-39° C。如果人体内部温度下降到约35°C，那么必须使身体暖和，否则会造成死亡。不管环境温度和穿着衣物如何，皮肤温度总是低于身体体核(body core)的温度。在适宜温度下(例如21°C)，皮肤的温度为约32° C-35° C。本领域技术人员认为，细菌通常具有一组约100到150个对维持细菌生活力绝对必需的基因，称为“必需基因”。由于必需基因的性质，鉴定必需基因是困难的，因为敲除这些基因会导致生物体的死亡。必需基因编码蛋白，所述蛋白由在几乎全部细菌种属之间高度保守的氨基酸序列构成。这种保守性很可能反映了在不同种间这些蛋白的共同功能和结构。选定数量的必需基因已被证明能够置换另一细菌种中的同源物，在某些情况下这些置换来自关系较远的细菌种。氨基酸序列的保守性在细菌中广泛存在，嗜冷生物和嗜热生物的必需基因的推定氨基酸序列显示出与其嗜温对应物的高度同一性。微生物学家通常使用条件致死突变(例如TS突变)来鉴定必需基因。许多细菌种在传染病的全世界负担中起到重要作用。然而，结核病的致病因素可能是由细菌传染病引起的人发病率和致死率的最显著因素。尽管几十年来一直使用卡介苗(BCG)来预防结核病，然而其低的效能已不能将结核病的发生率降低至可接受的水平。
发明内容
本公开提供了用于改造、生产和使用热敏性宿主微生物细胞的方法。在一个实例中，重组病原体含有例如使用同源重组插入的热敏性必需基因。“嗜冷生物”是适用于这样的生物的术语，即所述生物在低温例如<20°C下机能最佳。在冰冷海水特别是北极和南极海域中生活的细菌是嗜冷细菌的实例。嗜冷细菌中的酶和其他蛋白在冰冷环境中的机能好于其在嗜温细菌中的同源对应物。许多来自嗜冷细菌的酶易于变性的温度比影响所述酶的嗜温对应物的温度低得多。据推测，嗜冷酶的温度敏感模式可扩展至必需基因的产物。本发明提供了鉴定和操作具有所需TS特性的嗜冷必需基因的方法。可使用体外和体内重组技术。土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)是动物传染病土拉菌病的病原体。其可通过多种途径感染多种动物，并通常感染网状内皮组织系统器官中的来源于单核细胞的细胞并在其中生长。一种密切相关的细菌一新凶手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)——具有土拉弗朗西斯菌的许多特性，并且，除此之外，还非常适于许多遗传操 作包括基因置换。新凶手弗朗西斯菌的病理生理学和遗传特性使其适合研究基因置换对病原菌的作用。新凶手弗朗西斯菌是最大生长温度为约45°C的嗜温生物。本公开内容还提供了用于确定两种细菌株的最大生长温度及其在限制温度下的生长特性的方法。所测试的重组细菌株会在低于所述限制温度的温度下生长，但不会在高于所述限制温度的温度下生长。当将编码必需基因的嗜冷必需等位基因插入到温度低于人体体核温度的哺乳动物身体区域(例如皮肤)中后，所述重组病原细菌将具有快速生长从而诱发免疫反应的能力。当所述病原性重组细菌迁移到温度更高的人体体核的器官中时，它们会死亡并且不能伤害宿主。本公开内容提供了从嗜冷细菌分离的温度敏感性必需核酸分子，所述核酸分子与示于 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、22、23 或 24 中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。在某些实例中，所述嗜冷细菌在约-10°C到约30°C的温度下是能行使功能(operable)的，但是在高于约30°C的温度下是不能行使功能(operable)的。本公开内容还提供了包含这类来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子的载体和重组宿主细胞(例如重组细菌宿主细胞)。还公开了包含这类重组宿主细菌(例如活细胞或被杀死的细胞)的免疫原性组合物。本公开内容还提供了由所公开的分离的温度敏感性必需核酸分子编码的分离蛋白，例如与示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、27或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的蛋白。本公开内容提供了制备温度敏感性微生物宿主细胞(例如重组宿主细胞)的方法。在一个实例中，所述方法包括将核酸构建体引入嗜温细菌株的基因组中(例如通过插入、置换或替换)，其中所述核酸构建体包含来自嗜冷细菌株的温度敏感性必需核酸分子以及与所述温度敏感性必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列，其中由所引入的温度敏感性必需核酸分子编码的温度敏感性必需肽在低于约30°C的温度下是能行使功能的(例如有功能的)，在高于约30°C的温度下是不能行使功能的(例如无功能的)。在某些实例中，所述方法还包括在其中所述温度敏感性必需肽能行使功能的温度下培养所述温度敏感性微生物宿主细胞,藉此所述微生物宿主细胞产生多种肽；将培养温度升高至所述温度敏感性肽不能行使功能的温度；维持所述培养一段足够长的时间以杀死所述温度敏感性微生物宿主细胞；以及收获所述被杀死的温度敏感性微生物宿主细胞。本公开内容提供了用于使用所公开的核酸分子、蛋白和重组宿主细胞在受试者中产生对细菌的免疫反应的方法。在一个实例中，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌表达来自嗜冷细菌株的温度敏感性必需核酸分子，藉此诱发对所述细菌的免疫反应。所述方法可用于预防或治疗细菌感染(例如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、沙门氏菌(Salmonella)或弗朗西斯菌(Francisella)感染)。根据以下参照附图进行的对几个实施方案的详细描述，本公开内容的上述和其他特征会变得更加明了。
图Ia是流程图，示出了使用聚合酶链式反应(PCR)的示例性方法；图Ib是示意图，示出了显示导致基因置换的DNA整合-切除事件的示例性方法。图2a是示意图，示出了野生型(wt)新凶手弗朗西斯菌IigA基因的正常存在于染色体中的序列；图2b是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的IigAep基因置换；图2c是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的IigAsf基因置换；图2d是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的IigAph基因置换；图2e是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的IigAph2基因置换。图3a的曲线图示出了在30° C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用冷红科尔韦尔氏菌IigAcp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图313的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到33° C时，用冷红科尔韦尔氏菌IigAep基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3c的曲线图示出了 3. 5小时后温度从30°C转换到34° C时，用冷红科尔韦尔氏菌IigAcp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3d的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到35° C时，用冷红科尔韦尔氏菌IigAcp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3e的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到37° C时，用冷红科尔韦尔氏菌IigAcp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。图4a的曲线图示出了在30° C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用冷海希瓦氏菌IigAsf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图仙的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到33° C时，用冷海希瓦氏菌IigASf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图4c的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到35° C时，用冷海希瓦氏菌IigASf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图4d的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到37° C时，用冷海希瓦氏菌IigASf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。
图5a的曲线图示出了在30° C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用河豚毒素假交替单胞菌IigAph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图5匕的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到33° C时，用河豚毒素假交替单胞菌IigAph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图5c的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到35° C时，用河豚毒素假交替单胞菌IigAph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图5d的曲线图示出了 2小时后温度从30°C转换到37° C时，用河豚毒素假交替单胞菌IigAph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。图6a的曲线图示出了在21° C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用河豚毒素假交替单胞菌IigAph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图6匕的曲线图示出了 2小时后温度从21°C转换到26° C时，用河豚毒素假交替单胞菌IigAph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图6c的曲线图示出了 2小时后温度从21°C转换到28° C时，用河豚毒素假交替单胞菌 IigAph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图6d的曲线图示出了 2小时后温度从21°C转换到30° C时，用河豚毒素假交替单胞菌IigAph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。图7的曲线图示出了在33°C下生长至对数生长后期后，在37°C下野生型新凶手弗朗西斯菌和新凶手弗朗西斯菌-IigAep培养物的生活力下降。图8是数字图像,示出了鼠伤寒沙门氏菌(S. ser. Typhimurium)-ligACP在30°C下生长以及在37°C下不能生长。图9a的曲线图不出了在30°C下wt耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和耻垢分枝杆菌-IigAcp的生长曲线，图9b的曲线图示出了在4小时后温度从30°C转换到35° C时，耻垢分枝杆菌-IigAep和wt耻垢分枝杆菌的生长曲线，图9c的曲线图示出了在4小时后温度从30°C转换到37° C时，耻垢分枝杆菌-IigAep和wt耻垢分枝杆菌的生长曲线。图IOa-IOd是一系列曲线图，显示了由TS新凶手弗朗西斯菌株诱发的保护性免疫。图11A-11L显示了本文公开的序列，其中加下划线的部分是新凶手弗朗西斯菌序列。序列表所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码表示的。每个核酸序列只显示一条链，但是应理解对所示链的任何提及包括其互补链。SEQ ID NO: I是IigAep杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO:2是推定的IigAcp杂合蛋白的689氨基酸序列。SEQ ID NO: 3是IigAph杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO:4是推定的IigAph杂合蛋白的673氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是IigAph2杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO:6是推定的IigAph2杂合蛋白的673氨基酸序列。SEQ ID NO:7是IigAsf杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO:8是推定的IigAsf杂合蛋白的670氨基酸序列。SEQ ID NO:9是PyrGcp杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO: 10是推定的PyrGcp杂合蛋白的545氨基酸序列。SEQ ID NO: 11是IiemCcp杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO: 12是推定的HemCcp杂合蛋白的317氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13是Antep杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO: 14是推定的Fmtcp杂合蛋白的327氨基酸序列。SEQ ID NO: 15是HiurGcp杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO: 16是推定的MurGcp杂合蛋白的387氨基酸序列。SEQ ID NO: 17是对结核分枝杆菌优化的密码子优化的IigAep的全长核酸编码序列。SEQ ID NO: 18是推定的密码子优化的LigAep杂合蛋白的689氨基酸编码序列，其中前4个密码子变为结核分枝杆菌形式。SEQ ID NO: 19是(InaKep杂合基因的全长核酸编码序列。SEQ ID NO:20是推定的DnaKep杂合蛋白的638氨基酸序列。SEQ ID NO: 21和22分别是来自冷红科尔韦尔氏菌的必需基因tyrS的全长核酸编码序列(正常字体，大写)以及相应的氨基酸序列。SEQ ID NO:23和24分别是来自冷红科尔韦尔氏菌的必需基因cmk的全长核酸编码序列(正常字体，大写)以及相应的氨基酸序列。如图IlJ所示，新凶手弗朗西斯菌序列加下划线示出。在核酸和氨基酸序列中加下划线的部分均对应新凶手弗朗西斯菌序列。“未加下划线的”是冷红科尔韦尔氏菌序列。在氨基酸序列中，在末端没有加下划线的氨基酸，因为新凶手弗朗西斯菌序列起始自终止密码子。SEQ ID NO: 25和26分别是来自冷海希瓦氏菌的必需基因dnaKsf的全长核酸编码序列(正常字体，大写)以及相应的氨基酸序列。如图IlK所示，新凶手弗朗西斯菌序列加下划线示出。在核苷酸和氨基酸序列中加下划线的部分均对应新凶手弗朗西斯菌序列。“未加下划线的”显示了冷海希瓦氏菌序列。希瓦氏菌和弗朗西斯菌的起始处的氨基酸序列(MGK)是相同的，因此加双下划线示出。氨基酸序列末端处的单下划线对应新凶手弗朗西斯菌序列。SEQ ID NO:27和28分别是来自冷红科尔韦尔氏菌的必需基因ftsZ的全长核酸编码序列(正常字体，大写)以及相应的氨基酸序列。如图IlL所示，新凶手弗朗西斯菌序列加下划线示出。在核苷酸和氨基酸序列中加下划线的部分均对应新凶手弗朗西斯菌序列。“未加下划线的”部分是冷红科尔韦尔氏菌序列。5’ -末端(N-末端)处有延伸的新凶手弗朗西斯菌区。
具体实施例方式提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开内容。除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”均指一个或多于一个。例如，术语“包含核酸分子”包括单个或多个核酸分子并被认为等同于短语“包含至少一个核酸分子”。除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”是指所称可替代要素的单个要素或者两个或多个要素的组合。本文所用的“包括”是指“包含”。因此，“包括A或B”是指“包含A、B或者A和B”，而不排除额外的要素。下面描述用于实施和/或测试本公开内容的实施方案的合适的方法和材料。所述方法和材料仅为示例而非意图进行限制。可使用与本文所述的那些类似或等同的其他方法和材料。例如，所公开的发明所属领域中公知的常规方法记载于多篇一般性和更具体的参考文献中，包括例如 Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Sambrook et al.，MolecularCloning: A Laboratory Manual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Press,2001 ；Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates,1992 (and Supplements to 2000) ；Ausubel et al., Short Protocols inMolecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, 4th ed. , Wiley &Sons,1999 ；Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990 ；以及 Harlow and Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999。本文引用的参考文献以引用的方式纳入本文。为方便对本公开内容的各个实施方案的阅读，提供了以下对具体术语的解释。除非另外指出，否则技术术语依照本领域技术人员的常规用法使用。佐剂用于增强抗原性——例如含有本文公开的TS必需嗜冷细菌序列的重组宿主细菌的抗原性——的溶剂(vehicle)。佐剂包括上面吸附有抗原的矿物质(例如茂、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或抗原溶液在矿物油中被乳化的油包水乳液(弗氏不完全佐齐U);有些时候还包含被杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬细胞的流入)。免疫刺激寡核苷酸(例如包含CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如参见美国专利 No. 6，194，388 ；No. 6，207，646 ；No. 6，214，806 ；No. 6，218，371 ；No. 6，239，116 ；No. 6，339，068 ；No. 6，406，705 和 No. 6，429，199)。佐剂包括生物分子(“生物佐剂”)，例如共刺激分子。示例性佐剂包括IL-2、RANTES, GM-CSF, TNF- a、IFN- y、G-CSF,LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 4IBBL。给药通过所选途径将组合物(例如免疫原性组合物)引入受试者(例如哺乳动物，例如人)。给药的示例性途径包括但不限于局部、注射(如皮下、肌肉、真皮内、腹膜内、肿瘤内和静脉注射)、口服、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。缓解疾病和病理状态(例如细菌感染)由于所述治疗的作用的改善。有益效果可由例如以下表现证明在疑似受试者中的疾病临床症状的延迟发作，所述疾病的某些或全部临床症状的严重程度的减轻，所述疾病发展的减慢，受试者的整体健康或康乐的改善，或者对具体疾病特异性的本领域技术人员公知的其他参数。动物一类包括哺乳动物和鸟类的活的多细胞脊椎动物生物。术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和畜受试者(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马和牛)。
抗体包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，所述可变区特异性地识别并结合抗原表位。抗体由重链和轻链构成，各自均具有可变区，称为重链可变区(Vh)和轻链可变区(\)。所述VHg和八区一起负责结合被抗体识别的抗原。抗体包括完整的免疫球蛋白，以及本领域中公知的抗体的变体和部分,例如Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中,所述链已被变异以引入二硫键来稳定所述链的缔合。通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L )链。存在两种类型的轻链，lambda ( A )和kappa ( k )。决定抗体分子功能活性的重链主要有5类(或同种型)IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。“特异性结合”是指个体的抗体——相对于与无关蛋白(例如非细菌蛋白)的结合——与抗原(例如细菌抗原)发生特异性免疫反应的能力。所述结合是抗体分子与T细胞表面分子的抗原决定簇之间的非随机结合反应。所需的结合特异性通常是由所述抗体差别结合T细胞表面分子和无关抗原并因此区分两种不同的抗原(特别是当所述两种抗原具有独特的表位时)的能力的参考点决定。特异性结合具体表位的抗体称为“特异性抗体”。在某些实例中，抗体与标靶(例如细菌蛋白)以较对样本或受试者中其他分子的结合常数大至少IO3M-1UO4M-1或IO5M4的结合常数特异性结合。在某些实例中，抗体或其片段具有InM或更小的平衡常数(Kd)。例如，抗体与靶标(例如细菌蛋白)以至少约0. Ix1(T8M、至少约 0. 3x 1(T8M、至少约 0. 5x 1(T8M、至少约 0. 75x 1(T8M、至少约 I. Ox 1(T8M、至少约1.3x 10_8M、至少约1.5x IO-8M或至少约2. Ox KT8M的结合亲和力结合。Kd值可例如通过竞争性ELISA (酶联免疫吸附测定)或使用表面等离子共振装置例如Biacore TlOO (其可从 Biacore, Inc. , Piscataway, NJ 获得)确定。抗原可刺激动物中的抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射到或吸附到动物中的组合物。抗原可与特异性体液或细胞免疫的产物(包括由异种免疫原诱发的那些)反应。术语“抗原”包括全部有关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其产生响应的位点。在一个实施方案中，当表位以与MHC分子连接的形式存在时，T细胞对所述表位产生响应。表位由连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠并置的非连续氨基酸构成。通常，T细胞识别连续氨基酸的表位。由连续氨基酸构成的表位通常在暴露于变性溶剂后得以保留，而由三级折叠构成的表位通常会在用变性溶剂处理后丧失。表位通常包括以独特的空间构象存在的至少3个，更通常至少5个，约9个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线结晶学和2维核磁共振。抗原的实例包括但不限于肽、脂质、多糖和含有抗原决定簇的核酸，例如为免疫细胞识别的那些。抗原可为组织特异性抗原，或者疾病特异性抗原。这些术语不是排他性的，因为组织特异性抗原也可为疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限数量的组织例如单一组织中表达。组织特异性抗原可由一种以上相关类型的组织(例如肺泡和支气管组织)表达。疾病特异性抗原伴随疾病过程同时表达。疾病特异性抗原的特异性非限制实例是其表达与细菌感染相关或预示细菌感染(例如结核病)的抗原。疾病特异性抗原可被T细胞或B细胞识别。⑶4 :分化因子4的簇，一种T细胞表面蛋白，其介导与MHC II类分子的相互作用。⑶4还作为HIV感染过程中T细胞上的HIV主要受体位点。表达⑶4的细胞通常是辅助T细胞。⑶8 :分化因子8的簇，一种T细胞表面蛋白，介导与MHC I类分子的相互作用。表达⑶8的细胞通常是细胞毒性T细胞。“⑶8+T细胞介导的免疫性”是通过将抗原呈递至⑶8+T细胞而实现的免疫反应。接触在另一种试剂存在的情况下孵育一种试剂的过程。因此，当细胞与试剂(例如免疫原性组合物)接触时，用所述试剂将细胞孵育一段足以使所述试剂与细胞相互作用的时间。身体的温度较低部位人和其他哺乳动物身体的部位，所述部位的温度通常比身体其他部位低。正常人(或其他哺乳动)体温的概念因解剖学位点、性别、生理和环境温度而变动。尽管有很多变量，但人(或其他哺乳动)身体仅可在一个非常窄的温度范围内发挥 功能，因此，例如人体体核维持在约36°C -39°C。身体的温度较低部位包括皮肤、嘴和直肠。例如，皮肤温度为约32° C-35°C。因此，在某些实例中，身体的温度较低部位比身体其他部位(例如体核)低至少1°C、低至少2°C、低至少3°C、低至少4°C、低至少4°C或低至少6°C，例如低 1°C -8°C、低 1°C -6°C、低 2°C _6°C或低 2°C _4°C。细胞因子由细胞产生的影响其他细胞(如淋巴细胞)行为的蛋白。在一个实施方案中，细胞因子是趋化因子，一种影响细胞运输的分子。细胞因子的具体的非限制性实例包括白细胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21 等)和 IFN- y。简并变体编码TS必需嗜冷细菌蛋白的TS必需嗜冷细菌核酸序列，包括因遗传密码造成的简并核酸序列。存在20种天然氨基酸，其大部分由多于一种密码子指定。因此，本公开内容中包括所有简并核苷酸序列，只要由所述核苷酸编码的TS必需嗜冷细菌肽的氨基酸序列不变。EmS红霉素抗性。必需基因在所有培养条件下对生物(例如嗜温细菌)的生长均必需的基因。表达控制序列调控与之可操作地连接的异源核酸序列表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调控核酸序列的转录以及(在适当的情况下)核酸序列的翻译时，所述表达控制序列就与所述核酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子(即ATG)、内含子剪接信号、维持该基因的正确阅读框以使mRNA可正确翻译以及终止密码子。术语“控制序列”在最小意义上意图包括其存在可影响表达的组件，并还可包括其存在有利的额外组件，例如前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。启动子是足以指导转录的最小序列。还包括那些足以使启动子依赖的基因表达可受细胞类型特异性、组织特异性的外部信号或试剂控制或者可由外部信号或试剂诱导的启动子元件；这些元件可位于所述基因的5’或3’区。包括组成型和诱导型的启动子(参见例如Bitter et al. , Methods in Enzymology 153:516-544，1987)。例如，当克隆到细菌系统中时，可使用诱导型启动子，例如曬菌体lambda的pL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac杂合启动子)等。在一个实施方案中，当克隆到哺乳动物细胞系统中时，可使用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7. 5K启动子)。由重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供所述核酸序列的转录。在一个实施方案中，所述启动子是巨细胞病毒启动子。热敏感性在高于约28°C的温度下不能行使必需的生物功能。类似地，术语“热敏感性蛋白或多肽”是指由热诱导的灭活导致的无功能成熟蛋白。这种蛋白的一个实例是在高于约28°C的温度下不足以有效催化其已知反应以支持所述生物的生长、发育或生命的酶。热敏感等位基因包含编码热敏感性蛋白的基因的等位基因。类似地，术语“热敏感性基因”是指由编码热敏感性蛋白的基因。宿主细胞已引入异源核酸分子的细胞。例如，这些细胞可包括可增殖并且其DNA可被表达的核酸载体。所述细胞可为原核细胞或真核细胞。所述细胞可为原核细胞，例如细菌细胞。该术语还包括目的宿主细胞的任何后代。应理解所有细胞均可不同于亲代细胞，因为在复制过程中可能存在突变。然而，当使用“宿主细胞”时，包括这些后代。 免疫反应免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激物的反应。在一个实施方案中，所述反应对特定抗原或特定TS重组微生物细胞(例如含有本文提供的嗜冷必需核酸分子的嗜温细菌)是特异性的。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，所述反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生。给予含有嗜冷TS必需核酸分子的嗜温细菌后，免疫反应的形成可使用本领域中已知的常规方法测量，例如通过测量作为保护性免疫反应指征的细胞因子产生。免疫原性组合物包含含有嗜冷TS必需核酸分子的重组嗜温细菌的组合物,所述嗜冷TS必需核酸分子诱发可测量的对重组嗜温细菌蛋白的CTL反应，或者诱发可测量的对重组嗜温细菌蛋白的B细胞反应(例如产生特异性结合重组嗜温细菌-特异性蛋白的抗体)。例如，所述免疫原性多肽或编码所述免疫原性多肽的核酸可存在于使用本文提供的方法产生的热敏性嗜温细菌中，其中所述细菌是免疫组合物的一部分，所述免疫组合物还可包含可药用的载体和/或其他治疗剂。免疫原性组合物可任选地包括佐剂、PD-I拮抗剂、共刺激分子或编码共刺激分子的核酸。通过本领域中公认的测定法可容易地测试免疫原性组合物诱发CTL的能力。免疫原性肽包含等位基因-特异性基序或其他序列的肽，所述基序或序列使得所述肽结合MHC分子并诱发对来源自所述免疫原性肽的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应或者B细胞反应(例如抗体产生)。免疫原性肽还可在存在MHC蛋白的情况下通过测量其与特异性MHC蛋白的结合以及由其刺激CD4和/或CD8的能力来鉴定。通常，免疫原性多肽可用于诱发受试者中的免疫反应，例如B细胞反应或T细胞反应。在一个实施例中，免疫原性多肽在结合于MHCI类分子时活化抗所述多肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。使用合成肽诱发CTL以及CTL细胞毒性测定是本领域中已知的，参见美国专利5，662，907。在一个实例中，免疫原性肽包含等位基因-特异性基序或其他序列，从而使得所述肽结合MHC分子并诱发抗从其中产生所述免疫原性肽的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应。免疫原性反应条件允许对特定表位特异的抗体结合于所述表位的条件，所述结合的程度比与基本上所有其他表位的结合更大，并且/或者基本排除与基本上所有其他表位的结合。这些条件依赖于所述抗体结合反应的形式，通常是那些用于免疫测定方案的条件或者那些体内存在的条件。用于所公开方法的免疫原性反应条件是这样的“生理条件”，即所述条件包括活的哺乳动物或哺乳动物细胞内部常见的条件(例如温度、克分子渗透压浓度、pH)。尽管知晓某些器官处于极端条件下，然而器官内和细胞内环境通常为约pH7(例如pH 6. O到pH8. O或pH 6. 5到pH 7. 5，例如pH 7. 2)，含有水作为主要溶剂，并处于高于(TC且低于50°C的温度下。克分子渗透压浓度处于可支持细胞生活力和繁殖的范围内。这些条件为这些领域的技术人员所公知。干扰素Y (IFN-Y) =IFN-Y是具有146个氨基酸的亚基的二聚体蛋白。所述蛋白在两个位点上被糖基化，并且Pl为8. 3-8. 5。IFN- y以包含23个氨基酸的分泌信号序列的166个氨基酸的前体蛋白的形式合成。已公开了 20和25kDa的两种分子形式的生物活性蛋白。所述两种形式在第25位上均被糖基化。25kDa形式还在第97位上被糖基化。天然IFN-Y在分子量和电荷方面中观测到的不同是由于不同的糖基化模式。在非变性条件下观察到的 40-60kDa形式是IFN-Y的二聚体和四聚体。人的该基因具有约6kb的长度。其含有4个外显子，并作谱于染色体12q24. I。 IFN-Y可通过灵敏的免疫测定法检测，例如可检测产生IFN-Y的个体细胞的ELISP0T测试。微量的IFN-Y可通过测量IFN诱导的蛋白(例如Mx蛋白)而间接检测。对IP-10的合成的诱导也已用于测量IFN-Y浓度。此外，可使用生物测定法来检测IFN-Y，例如利用诱导2D9细胞中吲哚胺2，3- 二氧化酶活性的测定法。IFN- y的产生可用于评估T细胞活化，例如细菌抗原对T细胞的活化。分离的生物组分(例如核酸分子、蛋白或细胞器)，其已被从其天然所在的生物体细胞中的其他生物组分(例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器)中基本分离或纯化。已“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。在另一实施方案中，“分离的”是指通过宿主细胞中的重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学方法合成的核酸。IigA :在嗜温细菌(例如新凶手弗朗西斯菌、耻垢分枝杆菌或大肠杆菌)中发现的编码MD-依赖的DNA连接酶的基因的wt等位基因。此外，带有下标的IigA (例如ligACp、IigAsf或IigAph)是指在嗜冷细菌中发现的编码MD-依赖的DNA连接酶的基因的wt等位基因。例如，IigAcp是指在最大生长温度低于18°C的北极细菌冷红科尔韦尔氏菌株34H中发现的IigA的wt等位基因。可将嗜冷细菌的IigA序列引入嗜温细菌中，以赋予所述嗜温细菌温度敏感性。嗜温生物在约20° C到50°C的温度下的环境中天然存在的生物。嗜温细菌是指通常与哺乳动物有关并因此通常在约32°C到45°C的温度下发挥功能的细菌。嗜冷细菌在永久低于20°C，经常永久低于10°C并有时低于0°C的环境中天然存在的生物。所述永久低温的环境包括大多数海洋环境、永冻土、北级和南极环境。这些领域的技术人员会理解“嗜冷生物”和“嗜冷性”通常用于描述在低温环境中生长的细菌。嗜冷的嗜冷生物的特征。例如，“嗜冷酶”是从嗜冷生物中分离的酶。肽修饰可用于本文提供的方法和组合物的蛋白的类似物(非肽有机分子)、衍生物(用所公开的肽序列起始获得的化学上有功能的肽分子)和变体(同源物)。肽由氨基酸构成，所述氨基酸可为天然以及非天然的L-和/或D-氨基酸。所述肽可通过多种化学技术进行修饰以产生具有与未修饰的蛋白基本相同的活性并任选地具有其他所需特性的衍生物。修饰为这些领域的技术人员所公知。可药用载体可用于本公开内容的可药用载体(溶剂)是常规的。E. ff. Martin, MackPublishing Co. , Easton, PA, 19th Edition (1995)的 Remington’s PharmaceuticalSciences描述了适于一种或多种治疗组合物(例如免疫原性组合物)的药物递送的组合物和制剂。所公开的纯化的活性组合物可单独给药或者与可用载体结合给药。制剂可含有一种类型的治疗分子，或可由数种类型的治疗分子的组合构成。所述载体的性质取决于所用的具体给药模式。通常，载体的性质取决于所用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为载体，所述可注射流体包括药学和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡的盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中 性的载体以外，待给予的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和PH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。预防或治疗疾病“预防”疾病是指抑制疾病的完全形成，例如在已知具有被结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌(M. leprae)感染的风险的人中。已知易患病的人的实例是与被诊断患有结核病的人一起生活的人、职业医护人员或者其他已知已暴露于结核分枝杆菌的人。“治疗”是指在疾病或病理状态(例如结核病)已经开始形成后改善其体征或症状的治疗介入。纯化的术语纯化的不要求绝对纯净；而是作为一个相对术语。因此，例如，纯化的蛋白制剂是这样的蛋白即所述蛋白较细胞内其来源环境的蛋白更纯。蛋白制剂通常进行纯化，从而使得所述蛋白占所述制剂的总蛋白含量的至少50%。然而，某些应用可能需要更高度纯化的制剂。例如，对于这些应用，可使用其中所述蛋白占总蛋白含量的至少75%或至少90%的制剂。重组具有非天然存在的序列或通过人工组合序列的两个天然分离的片段形成的序列的核酸分子。这种人工组合通常通过化学合成，通过对分离的核酸片段的人工操作或者通过遗传工程技术来实现。也指已引入非天然核酸分子的细胞。抗感染的与无抗性动物相比，感染症状出现减轻的动物(例如哺乳动物)。对感染的抗性的表现可为例如致死率下降，暴露于感染原后测得的寿命延长，强烈生理症状减少或减轻(例如损伤减少)，或者所述感染原的细胞或组织浓度降低。在一个实施方案中，对感染的抗性被免疫反应的增强所证实。限制温度生物不能生长的最低温度。例如，表I中的“限制温度”具体是指整合有嗜冷基因的新凶手弗朗西斯菌株不能在琼脂糖培养基上形成分离的菌落的最低温度。由于培养箱温度的差异，这些温度解释为约±l°c。sacB盒编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)的果聚糖鹿糖酶的模块DNA序列。此基因的表达在蔗糖存在的情况下对许多细菌来说是致死性的，并可因此用作帮助选择基因序列丢失的反向选择剂。选择性杂交在排除无关核苷酸序列的中度或高度严格的条件下的杂交，所述杂交的技术为这些领域的技术人员已知。
序列同一性两个或多个核酸序列之间的同一性/相似性，或两个或多个氨基酸序列之间的同一性/类似性,表示为所述序列之间的同一性或类似性。序列同一性可以以同一性百分比的形式度量；百分比越高，所述序列同一性越高。序列相似性可以以相似性百分比(其考虑了保守性氨基酸置换)的形式度量；百分比越高，所述序列相似性越高。用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法记载于Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2 : 482, 1981; Needleman & ffunsch, J. Mol.Biol. 48 : 443，1970 ; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444, 1988 ；Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988 ；Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-3,1989 ；Corpet et al. , Nuc. Acids Res. 16:10881-90，1988;Huang et al. Computer Appls. inthe Biosciences 8,155-65，1992 ;以及Pearson et al.，Meth. Mol. Bio. 24:307-31，1994。Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-10，1990给出了对序列比对方法和同源性计算的详细注意点。NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)可从数个来源获得，包括 National Center forBiological Information(NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room8N805, Bethesda, MD 20894)和互联网，连同序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。其他信息可见NCBI网站。BLASTN可用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。如果所述两个比较序列享有同源性，那么指定的输出文件会将那些同源性区域显示为对齐的序列。如果所述两个比较序列不享有同源性，那么指定的输出文件不会显示对齐的序列。一旦比对上，就通过对这样的位置的数目计数来确定匹配的数目，即在所述位置上两个序列中存在相同的核苷酸或氨基酸残基。序列同一性百分比通过以下方法确定用匹配的数目除以识别序列中给出的序列的长度或除以联结的长度(articulated length)(例如识别序列中给出的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将所得结果乘以100。例如，当与具有1154个核苷酸的测试序列比对时具有1166个匹配的核酸序列与所述测试序列具有75. 0%的同一性(1166 + 1554*100=75. 0)。所述序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分位。例如，75. 11,75. 12,75. 13和75. 14向下近似为75. 1，而75. 15、75. 16,75. 17,75. 18和75. 19向上近似为75. 2。所述长度值总是为整数。在另一个实例中，与下文中识别序列的20个连续核苷酸比对的含有15个核苷酸区域的靶序列含有与该识别序列享有75%序列同一性(S卩15 + 20*100=75)的区域。为比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用设定为缺省参数(空位存在分值为11，每个残基空位分值为I)的缺省BL0SUM62矩阵应用Blast 2 sequence的功能。同源物通常特征在于，使用NCBI Basic Blast 2. 0, gapped blastp (使用例如nr或swisspro数据库的数据库)，对于与氨基酸序列的全长比对计算出具有至少30%或更高的序列同一性。以 blastn 程序搜索的查询用 DUST 过滤(Hancock and Armstrong, 1994, Comput. Appl.Biosci. 10:67-70)。其他程序使用SEG。此外，也可进行人工比对。当通过此方法测定时，具有甚至更大相似性的蛋白会显示更高的同一性百分比，例如与本文公开的蛋白的至少约75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。因此，在一个实例中，可用于所公开的方法和组合物中的蛋白与SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性，并且保留
赋予嗜温细菌TS (例如热敏感性)的能力。两个核酸分子密切相关的一个指征是两个核酸分子在严格条件下相互杂交，如上所述。然而，由于遗传密码的简并性，未显示高度同一性的核酸序列也可编码相同或相似的(保守性的)氨基酸序列。可使用这种简并性改变核酸序列以产生均编码基本相同蛋白的多个核酸分子。用此方法测定时，所述同源性核酸序列可例如与所公开的核酸序列具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。因此，在一个实例中，可用于所公开的方法和组合物的核酸序列与SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性，并且保留编码能够赋予嗜温细菌TS (例如热敏感性)的蛋白的能力。两个核酸序列基本相同的另一个(且不必须是累加的)指征是第一个核酸编码的肽可与第二个核酸编码的肽发生免疫交叉反应
“温度敏感性(TS)”或“热敏感性(HS)”:在最高约30°C时有活性且在通常见于人体的温度(例如高于约30°C)下失活的细菌组分(例如蛋白)或细菌。测试菌株容易进行基因替换以使嗜冷必需置换测试菌株中天然存在的同源物的嗜温细菌。治疗有效量单独给予或者与其他治疗剂一起给予的组合物的量，所述量足以在被所述药剂治疗的受试者或细胞中实现所需效果。所述药剂(例如本文提供的免疫原性组合物)的有效量可取决于数个因素，包括但不限于要治疗的受试者或细胞、特定治疗剂以及所述治疗组合物的给药方式。在一个实例中，治疗有效量或浓度是足以预防疾病发展、推迟疾病进展或导致疾病消退的量，或者能够减轻由所述疾病(例如细菌感染(例如结核病))引起的症状的量。在一个实例中，所需的反应是减轻或抑制与细菌感染有关的一种或多种症状。所述组合物起作用并不表示必须完全消除一种或多种症状。被给予人或脊椎动物受试者的包括所公开的免疫组合物之一的药剂的有效量会根据与所述受试者有关的若干因素(例如所述受试者的总体健康)而变化。药剂的有效量可通过改变所述产品的剂量并测量引起的治疗反应(例如预防细菌感染)来确定。有效量还可通过多种体外、体内或原位免疫测定法来确定。所公开的药剂可根据获得所需反应的需要以单剂量或以多剂量给药。在具体实例中，免疫原性组合物的治疗有效剂量包括至少IO2菌落形成单位(CFU)，例如至少103、至少104、至少105、至少106、至少IO7或至少IO8CFU,例如IO2-IO8CFU0在一个实例中，以真皮内或鼻内途径给予IO2-IO8CFU的活细菌。然而，本领域技术人员会认识到，也可例如根据具体免疫原性组合物使用更高或更低的剂量。在具体实例中，这些每日剂量以一个或多个分开的剂量(例如2、3或4剂)或以单个制剂给药。所公开的免疫原性组合物可单独给药，在可药用载体存在的情况下给药或者在其他治疗药剂存在的情况下给药。治疗在疾病或病理状态形成后改善其体征或症状的治疗介入。在一个实例中，本文公开的免疫原性组合物在给予哺乳动物后减轻细菌感染的一种或多种体征。载体被引入宿主细胞从而产生转导或转化的宿主细胞——在本文中称为重组细胞一的核酸分子。载体可包含使得其可在宿主细胞中复制的核酸分子序列，例如复制起点。载体还可包含一个或多个可选择的标志基因以及本领域中已知的其他遗传元件。载体包括质粒载体，包括用于在格兰氏阴性和格兰氏阳性细菌细胞中表达的质粒。示例性载体包括在大肠杆菌和沙门氏菌中表达的载体。载体还包括病毒载体例如但不限于逆转录病毒、正痘病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒(fowlpox)、羊痘病毒、猪痘病毒、腺病毒、疱疫病毒、a病毒、杆状病毒、辛德毕斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒载体。来自嗜冷细菌的温度敏感性必需基因本文公开了，数种核酸分子及其对应的肽可被引入细菌以赋予所述宿主细菌温度敏感性(TS)，例如热敏感性。所得到的细菌可用于诱导对温度敏感性细菌的免疫反应例如T细胞反应。本文提供了具有所需温度敏感性的示例性嗜冷必需基因及其对应的肽。例如，可用一个或多个嗜冷TS必需核酸分子转化宿主嗜温细菌，从而赋予所述嗜温细菌TS。所得到的重组嗜温细菌可制剂为免疫原性组合物，以治疗或预防由嗜温细菌引起的感染。例如，含有一个或多个嗜冷TS必需核酸分子的重组嗜温结核分枝杆菌可用于治疗或预防结核病。相同的方法可用于制备引起炭疽、布氏菌病(brucellosis)、类鼻疽、脑膜炎、牛结核病、伤寒、痢疾、多种类型的医院内感染、肺炎和鼠疫的TS形式的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。这样,可使用这些TS细菌来治疗或预防这些病症。本文提供了来自嗜冷细菌的温度敏感性必需蛋白，例如来自科尔韦尔氏菌属种(Colwellia sp.)、假交替单胞菌属种(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)的所述蛋白。不例性蛋白包括 ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、murG、fmt 和dnaK。示例性序列以示于 SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28 中的氨基酸序列的形式提供。然而，本领域技术人员会理解也可使用变体序列。例如，序列与SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28 之一所示的氨基酸序列具有至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的肽为本公开内容所涵盖，并可用于本文提供的方法。变体序列保留了嗜冷细菌的天然温度敏感性必需蛋白的生物活性，例如赋予形成细菌TS (例如热敏感性)的能力——例如在-10°C至约30°C (例如(TC -30°C)的温度下能行使功能，但在高于约30°C (例如4°C -30°C)例如高于35°C的温度下不能行使功能。示例性序列可使用互联网上容易获得的计算机程序和本文示出的氨基酸序列获得。在一个实例中，所述变体肽保留天然蛋白的功能，例如赋予细菌温度敏感性的能力。变体蛋白的具体的非限制性实例为天然蛋白(例如SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28)的保守性变体。示于 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26和28中的氨基酸序列的置换可基于此表进行，只要所述病原嗜温细菌被赋予TS并能够引发对其病原性抗原的免疫反应。例如，蛋白序列可被改变而不改变其生物学性质，例如通过引入一个或多个保守性氨基酸置换。因此，SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的任一个均可通过进行1-20个、1-15个、1-12个、1-10个或1-5个保守性氨基酸置换(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 50个保守性氨基酸置换)而被修饰，同时保留赋予嗜温细菌温度敏感性(TS)的能力。保守性置换的实例如下
权利要求
1.一种来自嗜冷细菌的分离的温度敏感性必需核酸分子，所述核酸分子包含与示于SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25 或 27 中的核苷酸序列具有至少 80%、至少90%或至少95%的序列同一性。
2.权利要求I的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷细菌在约-10°C到约30°C的温度下能行使功能。
3.权利要求I的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷细菌在高于约30°C的温度下不能行使功能。
4.权利要求I的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述核酸分子包含示于SEQIDNO:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25 或 27 中的核苷酸序列。
5.权利要求I的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷细菌为科尔韦尔氏菌属种(Colwellia sp.)、假交替单胞菌属种(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)。
6.权利要求I的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中由所述必需核酸分子编码的蛋白在高于约30°C的温度下不能行使功能。
7.权利要求6的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中由所述必需核酸分子编码的蛋白在选自约4°C到约30°C的温度下能行使功能。
8.—种核酸构建体，包含权利要求1-7中任一项的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述必需核酸分子与一个或多个控制序列可操作地连接。
9.一种载体,包含权利要求1-8中任一项的分离的核酸分子。
10.权利要求9的载体，其中所述载体包含至少两种选自SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25或 27 中的核酸序列。
11.一种重组宿主细胞，包含权利要求1-8中任一项的核酸构建体或权利要求9或10的载体。
12.权利要求11的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为嗜温细菌。
13.权利要求12的重组宿主细胞，其中所述嗜温细菌在约10°C到约50°C的温度下能行使功能。
14.权利要求11-13中任一项的重组宿主细胞，其中所述嗜温细菌在高于约30°C的温度下失活。
15.一种分离的蛋白，由权利要求1-8中任一项的分离的温度敏感性必需核酸分子编码。
16.权利要求15的分离的蛋白，其中所述蛋白包含与示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的氨基酸序列。
17.权利要求15的分离的蛋白，其中所述蛋白包含示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列。
18.一种免疫原性组合物，包含权利要求11-14中任一项的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞大约在由所述温度敏感性核酸分子编码的蛋白不能行使功能的温度下被杀死。
19.权利要求18的免疫原性组合物，其中由所述温度敏感性必需核酸分子编码的蛋白在高于约30°C的温度下失活。
20.权利要求18或19的免疫原性组合物，其中所述重组宿主细胞是弗朗西斯菌属种(Francisella sp.)、沙门氏菌属种(Salmonella sp.)或分枝杆菌属种(Mycobacteriumsp.)。
21.一种制备重组的温度敏感性(TS)细菌的方法，包括 将核酸构建体导入嗜温细菌的基因组中以制备重组TS细菌，所述核酸构建体包含来自嗜冷细菌的TS必需核酸分子以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列，其中由所述TS必需多核苷酸编码的蛋白在低于约30°C的温度下能行使功能，并且在高于约30°C的温度下不能行使功能。
22.权利要求21的方法，还包括从所述嗜冷细菌的基因组中分离所述TS必需核酸分子。
23.权利要求21或22的方法，还包括构建包含所述TS必需核酸分子以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列的核酸构建体。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述嗜冷细菌在约-10°C到约30°C的温度下能行使功能。
25.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述嗜冷细菌在高于约30°C的温度下不能行使功能。
26.权利要求21 - 2 5中任一项的方法，其中所述嗜冷细菌为科尔韦尔氏菌属种(Colwellia sp.)、假交替单胞菌属种(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)。
27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述嗜温细菌在选自约10°C到约50°C的温度下能行使功能。
28.权利要求21-27中任一项的方法，其中所述嗜温细菌是发酵微生物菌株或生物治疗菌株。
29.权利要求21-28中任一项的方法，其中所述TS必需核酸分子包含与示于SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25或27中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的核苷酸序列。
30.权利要求21-29中任一项的方法，其中在培养所述TS微生物宿主细胞的过程中所述TS必需核酸分子表达肽。
31.权利要求30的方法，其中所述肽包含与示于SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的氨基酸序列。
32.权利要求21-31中任一项的方法，还包括 在由所述TS多核苷酸编码的蛋白能行使功能的温度下培养所述重组TS细菌，藉此所述重组TS细菌产生多种肽； 将所述培养温度增加至由所述TS核酸分子编码的蛋白不能行使功能的温度； 将所述培养维持一段足以杀死所述重组TS细菌的时间；并且 收集被杀死的重组TS细菌。
33.一种制备包含必需肽的重组TS细菌的方法，包括 筛选嗜冷微生物基因组以检测其中的编码在高于约30°C的温度下失活的蛋白的TS必需多核苷酸； 分离所述TS必需多核苷酸； 构建核酸构建体，所述核酸构建体包含所述TS必需多核苷酸以及与所述TS多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列； 将所述核酸构建体插入到所选择的嗜温细菌宿主细胞的基因组中，从而在功能上置换在所述宿主细胞中所述TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS多核苷酸编码蛋白，所述蛋白在低于约30°C的温度下能行使功能并在高于约30°C的温度下不能行使功能并且可模拟原指定宿主细菌的温度敏感性； 在低于约30°C的温度下培养包含所述TS多核苷酸的嗜温细菌宿主细胞，以确认所述嗜温细菌宿主细胞的生存力； 在高于约30°C的温度下再培养包含所述TS多核苷酸的嗜温细菌宿主细胞，以确定所述嗜温细菌宿主细胞是否被杀死；以及 如果所述嗜温细菌宿主细胞被杀死，那么将所述核酸构建体插入到所选择的目的嗜温细菌宿主细胞的基因组中，从而在功能上置换所述宿主细胞中所述TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS多核苷酸编码在低于约30°C的温度下能行使功能并且在高于约30°C的温度下不能行使功能并且可模拟原测试宿主细菌的温度敏感性的蛋白，从而产生重组TS细菌。
34.权利要求33的方法，其中所述嗜温细菌宿主细胞为新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)细胞。
35.权利要求33或34的方法，其中所述目的嗜温细菌宿主细胞为沙门氏菌属种或结核杆菌属种(Mycobacterium sp.)。
36.一种组合物，包含由权利要求21-35中任一项的方法制备的温度敏感性细菌宿主细胞。
37.权利要求36的组合物，其中所述组合物是免疫原性组合物或治疗性组合物。
38.权利要求36或37的组合物用于在哺乳动物中激发免疫反应的用途。
39.一种用于在受试者体内产生对细菌的免疫反应的方法，包括 给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌表达权利要求14-17中任一项的分离的蛋白，藉此诱发对所述细菌的免疫反应。
40.一种用于在受试者体内产生对细菌的免疫反应的方法，包括 给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌包含权利要求1-8中任一项的分离的核酸或者权利要求9-10任一项的载体,从而诱发对所述细菌的免疫反应。
41.一种用于在受试者体内产生对细菌的免疫反应的方法，包括 给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌包含权利要求11-14中任一项的重组宿主细胞，从而诱发对所述细菌的免疫反应。
42.权利要求39-41中任一项的方法，还包括给予治疗有效量的佐剂。
43.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述免疫反应是保护性免疫反应。
44.权利要求39-41中任一项的方法，其中所述受试者患有细菌感染。
45.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述受试者处于受到细菌感染的风险中。
46.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述受试者患有潜伏性细菌感染。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其中所述细菌感染为结核分枝杆菌、沙门氏菌或弗朗西斯菌感染。
全文摘要
本公开内容提供了来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子、由所述核酸分子编码的蛋白以及其中已引入这类核酸分子的重组细胞。所公开的含有来自嗜冷细菌的一个或多个必需核酸分子的重组细胞从而变为温度敏感性的，并且可被给予哺乳动物以在所述哺乳动物中诱导免疫反应。
文档编号C12N15/61GK102782138SQ201080055571
公开日2012年11月14日 申请日期2010年10月7日 优先权日2009年10月7日
发明者F·E·纳诺 申请人:Uvic工业合伙公司