专利名称：融合基因肿瘤疫苗及构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及融合基因肿瘤疫苗及构建方法。
背景技术：
目前，针对肿瘤的治疗，广泛采用的是手术、化疗及放疗，虽然用手术、化疗及放射治疗等常规一线治疗可以清除大部分肿瘤细胞并能使多数癌症患者的病情得到缓解，但这些治疗方法很难达到完全根除癌细胞的效果，因此在大多数病人中肿瘤的复发是不可避免的。作为机体防御疾病的一个重要机制，免疫系统具有高效性、高特异性和持久性(免疫记忆)的特点，因此，利用主动免疫的手段激发病人自身免疫力来治疗肿瘤具有很大的临床应用潜能。
免疫系统由先天免疫系统和适应性免疫系统两大部分组成，免疫应答是一个复杂并受到精密调控的过程。病毒、细菌等病原体在结构上多具有它们所特有的并且相对保守的分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns，简称PAMP)，当感染发生时，病原体通过PAMP与宿主细胞所表达的相应受体的作用而首先激活先天免疫系统，表现为炎性细胞因子、趋化因子等的产生、释放。这些因子不但对病原体具有直接的杀伤和抑制作用，而且还吸引和激活在抗原递呈中起关键作用的DC。随后，被激活并捕获抗原的DC迁移至淋巴结等周围淋巴器官并在此激活适应性免疫系统，表现为具有高度特异性和记忆特性的B细胞和T细胞的活化。这种先天免疫系统与获得性免疫系统的密切配合既保证了机体能够对外来病原体的侵害产生迅速的反应和持久的监控，也同时避免了激发对自体产生免疫反应的危险。在这一系列过程中，DC构成了先天免疫系统与获得性免疫系统有机联结中的关键一环，CD4+T辅助细胞(CD4+Th)则通过释放细胞因子和直接细胞接触传导信号的方式对B细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，简称CTL)的激活、扩张和免疫记忆的建立过程中起到了极为重要的作用。大多数肿瘤细胞表达肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，简称TAA)，并且在肿瘤发生的病理过程中，由于组织损伤和细胞坏死等原因会导致一些炎性细胞因子、热休克蛋白的释放。因此，像对待微生物病原体感染一样，免疫系统应监测到肿瘤快速生长时释放的这种“危险”信号并做出相应的反应以抑制肿瘤生长。大量的动物实验和临床数据也证实免疫系统确能对肿瘤的发生做出自发的免疫反应，一些临床试验更进一步显示主动免疫(疫苗治疗)能在某些病人中获得一定的治疗效果。然而，与抗微生物疫苗在预防传染性疾病方面所获得的成功相比，目前大多数癌症疫苗的有效性还远未达到令人满意的程度，其主要原因是这些疫苗不能有效地激活免疫系统对“自身性”肿瘤抗原的免疫反应。因此，如何克服免疫系统对自身性肿瘤抗原的免疫耐受性是肿瘤疫苗能否在临床上取得满意疗效所需要解决的一个关键问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能克服免疫系统对肿瘤抗原的耐受性、增强抗肿瘤效力的融合基因肿瘤疫苗。
本发明的另一目的是提供一种融合基因肿瘤疫苗的构建方法。
本发明的技术方案概述如下一种融合基因肿瘤疫苗，用下列步骤构建用重组DNA的方法将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因与肿瘤抗原基因连接，即制成一种融合基因肿瘤疫苗，所述大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因简称EtxB。
所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列为模板，扩增，获得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性内切酶消化，得到320bp DNA片段，与用NotI和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB，再以序列表SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5为PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列为模板，扩增，获得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性内切酶消化，得到796bp DNA片段，与用HindIII和NotI限制性内切酶消化的所述pEtxB载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pBCL1-EtxB。
所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.2为PCR引物，用PCR的方法将编码tPA信号肽的DNA片段与所述的EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到429 bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB质粒DNA为模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11为引物把编码CT26肿瘤CD8+细胞毒性T淋巴细胞抗原表位的DNA片段AH1与tPA-EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到456bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB-AH1。
一种融合基因肿瘤疫苗构建方法，是由下述步骤组成用重组DNA的方法将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因与肿瘤抗原基因连接，即制成一种融合基因肿瘤疫苗，所述大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因简称EtxB。
所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列为模板，扩增，获得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性内切酶消化，得到320bp DNA片段，与用NotI和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB，再以序列表SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5为PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列为模板，扩增，获得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性内切酶消化，得到796bp DNA片段，与用HindIII和NotI限制性内切酶消化的所述pEtxB载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pBCL1-EtxB。
所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.2为PCR引物，用PCR的方法将编码tPA信号肽的DNA片段与所述的EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到429bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB质粒DNA为模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11为引物把编码CT26肿瘤CD8+细胞毒性T淋巴细胞抗原表位的DNA片段AH1与tPA-EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到456bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB-AH1。
本发明采用把弱免疫原性的肿瘤抗原与强免疫原性的细菌抗原(EtxB)相联结的DNA疫苗设计。此融合疫苗设计的要旨在于免疫系统对细菌抗原会产生很强的免疫应答反应，而在反应中被激活的针对细菌抗原的CD4+Th细胞可通过链接辅助(Linked Help)的免疫学原理激活针对肿瘤抗原的体液免疫反应和细胞免疫反应，本发明的一种融合基因肿瘤疫苗技术是克服免疫系统对肿瘤抗原免疫耐受性的有效手段，适用于高效增强肿瘤疫苗的效力。
图1为载体质粒pEtxB的构建策略。
图2为融合基因肿瘤疫苗pBCL1-EtxB的构建策略。
图3为载体质粒ptPA-EtxB的构建策略。
图4为融合基因肿瘤疫苗pEtxB-AH1的构建策略。
图5.融合基因肿瘤疫苗pBCL1-EtxB能诱导小鼠产生抗BCL1免疫球蛋白抗体并显著延长小鼠接种肿瘤细胞后的存活率。
图6.融合基因肿瘤疫苗pEtxB-AH1能诱导小鼠产生AH1特异性T细胞反应并显著延长小鼠接种肿瘤细胞后的存活率。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1融合基因肿瘤疫苗pBCL1-EtxB的构建以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列为模板，扩增并引入NotI和XbaI酶切位点，PCR反应的体积为50μl含0.1μgSEQ IDNo.3所述的EtxB DNA模版，20pmol SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶(德国Qiagen公司)及5μl 10×PCR缓冲液，PCR反应条件为94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环5轮；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃45sec.，循环25轮获得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性内切酶消化，得到320bp DNA片段，与用NotI和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3(Invitrogen公司)载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB，构建策略见图1，(图中ID 1即为SEQ ID No.1，ID 2即为SEQ ID No.2，其它以此类推)；再以序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5为PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFvDNA序列为模板，扩增引入HindIII和NotI酶切位点，PCR反应的体积为50μl含0.1μgBCL1 scFv DNA模版，20pmol SEQ ID No.4和SEQ ID No.5 PCR引物，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶及5μl 10×PCR缓冲液，PCR反应条件为94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环5轮；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环25轮，获得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性内切酶消化，得到796 bp DNA片段，与用HindIII和NotI限制性内切酶消化的所述pEtxB载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pBCL1-EtxB，构建策略见图2。
实施例2融合基因肿瘤疫苗pEtxB-AH1的构建以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和ID No.2为PCR引物，用PCR的方法将编码tPA信号肽的DNA片段与所述的EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到429bp DNA片段，PCR反应的体积为50μl含0.1μg EtxB DNA模版，20pmol SEQ ID No.7、2pmol SEQ ID No.8、2pmol SEQ ID No.9、2pmol SEQ ID No.10和20pmol SEQ ID No.2引物，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶及5μl 10×PCR缓冲液，PCR反应条件为94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环5轮；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环25轮，扩增获得的EtxB片段用HindIII和XbaI限制性内切酶消化，与用相同限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒(Invitrogen公司)用T4 DNA连接酶进行连接反应，连结获得ptPA-EtxB，构建策略见图3；再用PCR的方法用ptPA-EtxB质粒DNA为模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11为引物把编码CT26肿瘤CD8+细胞毒性T淋巴细胞抗原表位的DNA片段AH1与tPA-EtxB融合，PCR反应的体积为50μl含0.1μg ptPA-EtxB DNA，20pmol SEQ ID No.7和SEQ IDNo.11PCR引物，5μl 250mMol dNTPs，2.5U Taq DNA聚合酶及5μl 10×PCR缓冲液，PCR反应条件为94℃ 5min.；94℃ 30sec.，50℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环5轮；94℃ 30sec.，60℃ 30sec.，72℃ 45sec.，循环25轮，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到456bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒(Invitrogen公司)，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB-AH1，构建策略见图4。
影响癌症疫苗有效性的因素很多，而如何打破免疫系统对肿瘤抗原的耐受性则是最为关键的一个环节。这是因为大多数TAA是源于自身的抗原而不是外源抗原，所以在T细胞的整体构成中能识别这种自我性的TAA的T细胞(简称TAA-T细胞)的数量和它们对TAA的亲和力都是非常有限的，这首先是因为在中央免疫耐受机制的调控下那些对TAA有较强亲和力的T细胞在胸腺中就被除掉了。此外，那些由于亲和力较低而未被中央免疫耐受机制所清除的TAA-T细胞在进入外周系统后也会在外周免疫耐受机制的作用下或者被清除或者失去对TAA的反应能力。同样，B细胞的整体构成也受类似的免疫耐受机制的调控。由于CD4+Th在B细胞和CD8+CTL免疫反应(激活、扩张和记忆)建立过程中的决定性作用，如何克服CD4+Th系统对肿瘤抗原的耐受性是肿瘤疫苗研究中所必须解决的一个关键问题。对此，我们采用了把肿瘤抗原与具有强免疫原性的大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位(EtxB)融合的疫苗设计。这种融合疫苗的要旨在于免疫系统对EtxB这种外源抗原没有耐受性，因此会对它产生很强的免疫应答反应，而在反应中被激活的针对细菌抗原的CD4+Th细胞可通过链接辅助(Linked help)的免疫学原理高效激活针对肿瘤抗原的体液免疫反应和细胞免疫反应。此外，EtxB除能起到提供链接辅助的作用外，它本身还有直接激活T、B和DC细胞的作用。还有，与绝大多数蛋白质抗原不同，EtxB能够以受体介导的胞吞方式进入细胞并通过MHC-I(Major Histocompatibility Class I)途径来激活CD8+CTL反应，这对通过交叉递呈机制(Cross Priming)激活CD8+CTL具有重要促进作用。
材料1)菌株和细胞系大肠杆菌宿主菌JM103来自Promega公司。
BCL1为小鼠B细胞白血病/淋巴癌细胞系并表达IgM/λ，293T细胞系为人胚胎肾上皮细胞，CT26为小鼠肠癌细胞系，以上三种细胞系均来自ATCC细胞保藏中心。
2)EtxB基因和BCL1 scFv基因EtxB基因根据文献1报道的核酸序列化学合成。BCL1 scFv基因片段按文献2报道的核酸序列和文献3报道的方法构建。
文献1 Leong，J.，Vinal，A.C.and Dallas，W.S(1985).Nucleotide sequence comparison betweenheat-labile toxin B-subunit cistrons from Escherichia coli of human and porcine origin.Infect.Immun.48(1)，73-77.
文献2 Schreurs，M.W.J.，van den Berk，P.C.M.，van Oers，M.H.J.and Kersten，M.J(2000).MurineBCL1 lymphoma-derived single chain antibody(scFv)sequence.GeneBank accession numberAF239196.
文献3 Hawkins RE，Zhu D，Ovecka M，Winter G，Hamblin TJ，Long A，Stevenson FK(1994).Idiotypic vaccination against human B-cell lymphoma.Rescue of variable region gene sequencesfrom biopsy material for assembly as single-chain Fv personal vaccines.Blood 833279-88.
3)基因工程用工具酶和其他化学试剂限制内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶以及分子生物学和细胞培养所需化学品和培养基等购自Promega、Invitrogen、New England Biolabs及Sigma等公司。
方法除以下详细描述的实验方法外，分子克隆及其它DNA遗传操作均为实验室常规技术，参见Sambrook J，Fristsh EF，Maniatis T.Molecular CloningA Laboratory Manual 2nded.NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
实施例3融合基因肿瘤疫苗pBCL1-EtxB诱导抗肿瘤免疫反应的研究ELISA检测小鼠对pBCL1-EtxB抗肿瘤疫苗的抗体反应选用4-6周龄的BALB/c小鼠，pBCL1-EtxB实验组、pBCL1、pEtxB载体对照组和生理盐水阴性对照组各8只。用无菌生理盐水将DNA疫苗质粒载体溶解至0.5mg/ml，然后在小鼠的两只后肢四头肌处分别注射50μl DNA疫苗。以后每隔3周以同样方法进行共两次加强免疫注射。在每次疫苗接种前从小鼠尾部取血，经凝血、离心后获得血清用于ELISA抗体检测。结果显示接受pBCL1-EtxB和pEtxB免疫接种的小鼠都产生了抗EtxB抗体反应，而pBCL1和生理盐水实验组则没有抗EtxB抗体反应。接受pBCL1-EtxB接种的小鼠产生了抗BCL1 IgM抗体反应，而接受pEtxB和pBCL1接种以及生理盐水对照组的小鼠则无抗BCL1 IgM抗体反应。
肿瘤接种实验检测pBCL1-EtxB抗肿瘤疫苗对小鼠的保护作用在第3次接种3周后，通过静脉注射给小鼠输入2.5×105BCL1肿瘤细胞，此后每天观察肿瘤在小鼠内的生长情况。观察发现，只有pBCL1-EtxB接种才能有效地抑制BCL1肿瘤在小鼠体内的生长、显著提高小鼠的存活率(图5)。
以上结果表明仅表达BCL1scFv的DNA疫苗不能有效激活B细胞反应，但pBCL1-EtxB融合疫苗则能非常有效地诱导抗肿瘤B细胞免疫反应。
实施例4融合基因肿瘤疫苗pEtxB-AH1诱导抗肿瘤免疫反应的研究ELISA检测小鼠对pEtxB-AH1抗肿瘤疫苗的抗体反应选用4-6周龄的BALB/c小鼠，pEtxB-AH1实验组、pEtxB空载体对照组和生理盐水阴性对照组各8只。用无菌生理盐水将DNA疫苗质粒载体溶解至0.5mg/ml，然后在小鼠的两只后肢四头肌处分别注射50μlDNA疫苗。以后隔3周以同样方法进行1次加强免疫注射。在每次疫苗接种前从小鼠尾部取血，经凝血、离心后获得血清用于ELISA抗体检测。结果显示接受pEtxB-AH1和pEtxB免疫接种的小鼠都产生了抗EtxB抗体反应，但生理盐水实验组则没有抗EtxB抗体反应。
肿瘤接种实验检测pEtxB-AH1抗肿瘤疫苗对小鼠的保护作用在第2次接种3周后，通过静脉注射给小鼠输入1×105CT26肿瘤细胞，此后每天观察肿瘤在小鼠内的生长情况。观察发现，只有pBCL1-EtxB接种才能有效地抑制CT26肿瘤在小鼠体内的生长、显著提高小鼠的存活率(图6)。
序列表<110>天津昂赛细胞基因工程有限公司<120>融合基因肿瘤疫苗及构建方法<160>11<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<22 1>misc_difference<222>(1)…(31)<400>1tatagcggcc gctgctcctc agtctattac a 31<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(30)<400>2tatatctaga ctagttttcc atactgattg 30<210>3<211>312<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(312)<400>3gctcctcagtctattacagaactatgttcggaatatcacaacacacaaatatatacgataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggcaaaagagaaatggttatcattacatttaagagcggcgcaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagactcccaaaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgagaccaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatcagtatggaaaactag<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<221>misc_difference<222>(1)…(34)<400>4tataaagcttgccaccatgggttggagctgtatc
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权利要求
1.一种融合基因肿瘤疫苗，其特征用下列步骤构建用重组DNA的方法将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因与肿瘤抗原基因连接，即制成一种融合基因肿瘤疫苗，所述大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因简称EtxB。
2.根据权利要求1所述的一种融合基因肿瘤疫苗，其特征是所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxBDNA序列为模板，扩增，获得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性内切酶消化，得到320bp DNA片段，与用NotI和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB，再以序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5为PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列为模板，扩增，获得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性内切酶消化，得到796bp DNA片段，与用HindIII和NotI限制性内切酶消化的所述pEtxB载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pBCL1-EtxB。
3.根据权利要求1所述的一种融合基因肿瘤疫苗，其特征是所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.2为PCR引物，用PCR的方法将编码tPA信号肽的DNA片段与所述的EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到429bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB质粒DNA为模板、SEQ ID No.7和SEQ ID No.11为引物把编码CT26肿瘤CD8+细胞毒性T淋巴细胞抗原表位的DNA片段AH1与tPA-EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到456bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB-AH1。
4.一种融合基因肿瘤疫苗构建方法，其特征是由下述步骤组成用重组DNA的方法将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因与肿瘤抗原基因连接，即制成一种融合基因肿瘤疫苗，所述大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因简称EtxB。
5.根据权利要求4所述的一种融合基因肿瘤疫苗构建方法，其特征是所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以SEQ ID No.3所述的EtxB DNA序列为模板，扩增，获得的EtxB片段用NotI和XbaI限制性内切酶消化，得到320bp DNA片段，与用NotI和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB，再以序列表SEQ ID No.4、SEQ ID No.5为PCR引物，以SEQ ID No.6所述的BCL1 scFv DNA序列为模板，扩增，获得的BCL1 scFv片段用HindIII和NotI限制性内切酶消化，得到796bp DNA片段，与用HindIII和NotI限制性内切酶消化的所述pEtxB载体质粒，用T4 DNA连接酶进行连接反应，制成pBCL1-EtxB。
6.根据权利要求4所述的一种融合基因肿瘤疫苗构建方法，其特征是所述EtxB与肿瘤抗原基因的连接方法是以序列表SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.2为PCR引物，用PCR的方法将编码tPA信号肽的DNA片段与所述的EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到429bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4DNA连接酶进行连接反应，制成ptPA-EtxB，再用PCR的方法用所述ptPA-EtxB质粒DNA为模板、SEQ ID No.7和SEQ IDNo.11为引物把编码CT26肿瘤CD8+细胞毒性T淋巴细胞抗原表位的DNA片段AH1与tPA-EtxB融合，所获得的PCR产物经HindIII和XbaI限制性内切酶消化，得到456bp DNA片段，与用HindIII和XbaI限制性内切酶消化的pcDNA3载体质粒，用T4DNA连接酶进行连接反应，制成pEtxB-AH1。
全文摘要
本发明公开了一种融合基因肿瘤疫苗及构建方法，构建步骤是用重组DNA的方法将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因与肿瘤抗原基因连接，制成一种融合基因肿瘤疫苗，所述大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因简称EtxB，本发明采用把弱免疫原性的肿瘤抗原与强免疫原性的细菌抗原EtxB相联结的DNA疫苗设计，此融合基因肿瘤疫苗设计的要旨在于免疫系统对细菌抗原会产生很强的免疫应答反应，而在反应中被激活的针对细菌抗原的CD文档编号C12N15/09GK1966083SQ200610129599
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月27日 优先权日2006年11月27日
发明者朱德琳 申请人:天津昂赛细胞基因工程有限公司