专利名称：自体角膜上皮的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种自体角膜上皮的制备方法。
背景技术：
烧伤、化学烧伤、眼表皮肿瘤、过敏性或放射性损伤、遗传性眼病、眼表面化脓和其他眼综合症可以导致眼角膜上皮细胞脱落，并使眼结膜覆盖于眼角膜表面，产生角膜大量新生血管增生、复发性翼状胬肉甚至失明等角膜性疾病。对于这类眼科疾病的治疗，一般需要进行手术切除，但是切除后仍然会复发和增生。因而，要从根本上治疗此类疾病，必须构建眼角膜的组织结构且补充角膜缘的干细胞。
为了解决此类问题，人们发明了生物工程角膜，它是通过将从胚胎角膜缘组织或者另一侧眼睛的角膜缘获得的角膜干细胞在体外培养至第三、四代时，构建在一个生物支架上而形成。它可用于治疗由于各种原因导致的角膜损伤或角膜脱落病人的角膜移植。
但是，胚胎角膜缘组织生物工程角膜上皮存在着许多不足第一，由于胚胎角膜缘组织来源于异体，由其制备的角膜上皮会与患者角膜缘中的免疫细胞发生免疫排斥反应，从而增加了患者的痛苦和手术失败的可能性。第二，由于制备角膜采用的生物支架为胶原蛋白、隐形眼镜或羊膜，使得角膜干细胞和上皮细胞在其表面难以均匀生长，手术后降解速度缓慢，因而限制了临床应用。第三，角膜缘细胞的生长采用的鼠源性滋养层细胞，具有潜在的非人类来源的传染；而且采用的胎牛血清培养基，也易于传染牛的传染病等，这些潜在的感染源对于患者是一个威胁。
申请号为03150375.6的中国专利申请公开了一种自体角膜上皮及其制备方法，该角膜上皮是将来源于患者自体的角膜上皮干细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养构建而成。该组织工程角膜克服了上述缺点，但是当双侧眼角膜部位都出现问题时，自体角膜缘干细胞来源就缺失了。
因而，需要这样一种新的组织工程自体角膜上皮，它能克服上述非自体角膜的缺点，同时它源于非眼角膜组织，以便在双侧角膜组织都无法获得时，仍然能构建出可用于移植的自体角膜上皮。另外，最好能有这样一种组织工程自体角膜上皮的制备方法，该方法既能采用非自体角膜细胞，也可以用自体角膜缘细胞来制备角膜上皮，以使该方法能具有通用性，便于掌握和操作。
发明内容
本发明一个目的是提供一种组织工程自体角膜上皮的制备方法，该方法可以采用自体的口腔粘膜细胞制备角膜上皮，从而排除了当双侧眼睛都出现问题时对眼角膜缘细胞来源的限制，同时该方法还能用自体的角膜缘细胞制备角膜上皮。
本发明所提供的组织工程自体角膜上皮的制备方法，包括如下步骤(a)原代培养患者自体的口腔粘膜组织或角膜缘组织的细胞3-15天；(b)对所得细胞进行传代扩增培养7-30天；以及(c)以纤维蛋白原为支架材料，与传代培养的细胞一起构建成组织工程角膜上皮。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，将所得到的组织工程角膜上皮在37℃，5％CO2下，继续培养5-45分钟，优选10-30分钟，更优选20分钟，再加入1ml DMEM后用于移植。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，用角膜培养液进行细胞的原代培养和传代培养，所述角膜培养液选自DMEM(Dulbecco改良的最低基础培养液)或Epilife(购自美国CascadeBiologics公司)，优选为Epilife；可选地再添加以角膜培养液总量计的下列物质0.1-0.5％(质量百分数)的脑垂体提取液、0.1-5ng/ml的上皮生长因子、0.05-0.5μg/ml的氢化可的松、1-20μg/ml的转铁蛋白以及1-20μg/ml的胰岛素，其中各物质的进一步优选加量为脑垂体提取液0.3％、上皮生长因子3ng/ml、氢化可的松0.2μg/ml、转铁蛋白10μg/ml以及胰岛素10μg/ml。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，所述培养容器为培养皿、六孔板等，更优选为35mm的细胞培养皿。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，步骤(a)所述自体口腔粘膜组织为取自患者自体舌下、面颊内侧或舌面等口腔粘膜部位的1-3平方毫米的口腔粘膜组织块；角膜缘组织为取自患者正常眼角膜缘的1-2平方毫米大小的组织块。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，在步骤(a)之前，用庆大霉素消毒所述口腔粘膜组织或者所述角膜缘组织，其浓度为50-200mg/ml，优选为100mg/ml，再用0.05％的胰酶/EDTA液消化20分钟后，用DMEM冲洗组织2次，以去除表面的消化酶。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，在步骤(a)中，将组织块剪碎并均匀分布于培养容器的内部表面，加入角膜培养液进行原代培养，每2-3天更换一次培养液，优选每3天更换一次培养液，培养时间为4天-12天，优选5天-10天，更优选7天。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，在步骤(b)中，用角膜培养液在37℃，5％CO2下，每2-3天更换一次培养液，在细胞达到50％-90％汇集后传代，优选在细胞达到70％汇集后传代，共培养9天-25天，优选12天-20天，再优选13天-16天，更优选14天。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，在步骤(c)中，以培养容器中待构建的体系的总体积为准，先将加量为1-8mg/ml的纤维蛋白原平铺于培养皿底面，然后再将加量为1-5单位(unit)/ml的人凝血因子、加量为1-5μmol/ml的钙离子和约20000-80000个已传代的细胞，在室温下与铺好的纤维蛋白原混合均匀，使混合液体在培养容器中的厚度为0.5mm-1.5mm。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮制备方法的一个优选方案，在步骤(c)中，以培养容器中待构建的体系的总体积为准，先将加量为5mg/ml的人纤维蛋白原平铺于培养皿底面，然后再将加量为2单位/ml的人凝血因子、加量为2.5μmol/ml的CaCl2和约40000个已传代的细胞，在20-25℃下与铺好的人纤维蛋白原混合均匀，使混合液体在培养容器中的厚度为1mm。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮的制备方法的一个优选方案，所述纤维蛋白原为人的纤维蛋白原或冻干人纤维蛋白原；所述凝血因子从人或动物血液提取，优选为人凝血因子，可选自凝血因子II-XII的任何一种或多种，从动物提取的凝血因子是指非人重组的动物自身的凝血因子，所述动物可以是猪、牛等，优选猪。
按照本发明的组织工程自体角膜上皮的制备方法的一个优选方案，所述人的纤维蛋白原按下述方法制备取200ml人血浆，在4℃、3500转/min的条件下离心30分钟，弃上清液，加10ml注射用水，制成悬浊液，保存备用。
按照本发明所述方法制备的组织工程自体角膜上皮，可作为角膜移植用的生物材料，可移植到病人损伤角膜表面，从而修复和恢复角膜功能。
本发明组织工程自体角膜上皮的制备方法以口腔粘膜作为角膜上皮细胞来源，在克服了现有技术的免疫排斥反应、非人类来源的传染和其生物支架不适于细胞均匀生长、降解慢等缺陷的同时，使得自体角膜的制备不受双侧角膜上皮缺损的限制，使患者在任何情况下都能得到适合的角膜。此外，该方法也能应用角膜缘细胞来制备角膜上皮，而且其效果比现有的方法更佳。这样，就可以选择使用角膜缘细胞/口腔粘膜细胞，使操作更加灵活。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明。
图1A为本发明以口腔粘膜为细胞来源的成品外观图，图1B为本发明以角膜缘为细胞来源的成品外观图；
图2A为培养成功的以口腔粘膜为细胞来源的角膜上皮细胞在100倍光学显微镜下的形态学照片，图2B为培养成功的以角膜缘为细胞来源的角膜上皮细胞在100倍光学显微镜下的形态学照片；图3A、4A、5A、6A和7A是当采用口腔粘膜作为细胞来源时，患者术前的眼角膜情况图；图3B、4B、5B、6B和7B是当采用口腔粘膜作为细胞来源时，患者术后的眼角膜情况图；图8A、9A、10A、11A是当采用眼角膜缘作为细胞来源时，患者术前的眼角膜情况图；图8B、9B、10B、11B是当采用眼角膜缘作为细胞来源时，患者术后的眼角膜情况图。
具体实施例方式
从正常人的眼角膜或口腔粘膜中分离出干细胞，进行体外培养、增殖和分化，在二到三周内使这些细胞增殖数百万倍，然后将这些带有干细胞的上皮细胞种在一种生物膜上，从而长成生物工程角膜，将其移植到角膜损伤病人的病变部位，进行修复，使病人症状减轻、视力恢复。
在确定取角膜或口腔粘膜组织之前，由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因，争得患者或家属同意，角膜上皮的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定，并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验，包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的口腔粘膜立即由专业人员放入无菌容器内，并立即冷藏(10℃以下)，然后按规定的标准操作程序处理。
实施例1口腔粘膜为细胞来源的组织工程自体角膜上皮的制备一、口腔粘膜组织健康细胞的提取和原代培养1.手术室取材(百级空气净化)由专业医生从患者的舌下口腔粘膜取1mm×3mm大小的组织块。
2.所取组织的保存在送达实验室运输过程中，可以将组织块放入含有保存液的15ml保存管中保存(4℃)，所述保存液含DMEM和10％血清。
3.在超净工作台中消毒、清洗，修剪组织取新鲜的组织或者经过保存的组织，用含100mg/ml庆大霉素的PBS(磷酸缓冲液)冲洗3次，修剪多余的脂肪和皮下结缔组织。
4.组织消化(Thermo CO2培养箱)将上述组织块放置于35mm培养皿中，加入浓度为0.05％的胰酶/EDTA液，消化20分钟，并将组织块用镊子提起放入DMEM中冲洗2次，去除表面的消化酶。
5.细胞分离将消化后的组织块剪碎并均匀分布于35mm的培养皿内部表面，加入0.5ml角膜培养液培养，每三天更换培养液一次，培养5天后收获细胞。
6.细胞鉴定1)形态学采用倒置光学显微镜观察。细胞多呈多角型，角为钝角，细胞呈圆性。细胞外观透明，细胞紧密联结成单层或多层。为典型正常的口腔粘膜上皮细胞。
2)细胞表型采用Keratin角质蛋白3的抗体(美国ICN公司)进行细胞免疫抗原结合反应，鉴定为典型正常的口腔粘膜上皮细胞。
3)致癌性采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点)》，结果无致癌性。
4)无菌检测按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
5)细胞存活率采用台盼蓝(trypan blue)染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。
细胞存活率＝[(总细胞数-死细胞数)/总细胞数]×100％经测定，细胞存活率超过80％。
二、细胞培养传代在细胞中加入Epilife(美国Cascade Biologics公司，编目码M-EPI-500-CA)，接种入35mm培养皿，在Thermo CO2培养箱，37℃，5％CO2下进行培养，每3天换液1次，在上皮细胞达到70％汇集细胞后传代，培养14天。
三、构建组织工程自体角膜上皮1.制备人纤维蛋白原用200ml血浆在4℃离心，3500转/min，离心30分钟，弃上清液，加10ml注射用水，制成悬浊液，保存备用。
2.构建角膜上皮采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为5mg/ml，加入2unit/ml人的凝血因子(购于Sigma公司)和2.5μmol/ml CaCl2，同时加入约40000个左右传代至第三代的细胞，室温下混合，立刻倒入35mm的培养皿中，形成0.8mm厚的液体层。将培养皿放入37℃，5％CO2培养箱中20分钟后，加入1ml DMEM培养液即可。
四、使用方法和效果使用前，用不含血清的培养液冲洗三次。在角膜的移植前，需要眼外科医生对病人进行360度的环状的病变部位切除，将本发明组织工程自体角膜做四针缝合于环状切割部位，用隐形镜片压迫，将眼睑采用两针缝合，一周后拆除缝线，有新生的角膜上皮形成，角膜的功能和视力得到改善。
产品的储存和运输应在2℃-10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的环境中进行。
本发明主要应用于烧伤，化学烧伤，眼表皮肿瘤，过敏性、放射性损伤，遗传性眼病，眼表面化脓和其他眼综合症导致的眼角膜上皮细胞脱落，结膜覆盖于眼角膜表面而致的失明。
实施例2角膜缘为细胞来源的组织工程自体角膜上皮的制备一、角膜缘组织健康细胞的提取和原代培养1.手术室取材(百级空气净化)由专业医生从患者的另一侧正常眼角膜缘取1mm×1mm大小组织块。
2.所取组织的保存在送达实验室运输过程中，可以将组织块放入含有保存液的15ml保存管中保存(4℃)，所述保存液含有DMEM和10％血清。
3.在超净工作台中消毒、清洗，修剪组织取新鲜的组织或者经过保存的组织，用含100mg/ml庆大霉素的PBS冲洗3次，修剪多余的脂肪和皮下结缔组织。
4.组织消化(Thermo CO2培养箱)将上述组织块放置于35mm培养皿中，加入浓度为0.05％的胰酶/EDTA液，消化20分钟，并将组织块用镊子提起放入DMEM中冲洗2次，去除表面的消化酶。
5.细胞分离将消化后的组织块剪碎并均匀分布于35mm的培养皿内部表面，加入0.5ml角膜培养液培养，每三天更换培养液一次，培养14天后收获细胞。
6.细胞鉴定1)形态学采用倒置光学显微镜观察。细胞多呈多角型，角为钝角，细胞呈圆性。细胞外观透明，细胞紧密联结成单层或多层。为典型正常的角膜上皮细胞。
2)细胞表型采用Keratin角质蛋白3的抗体(美国ICN公司)进行细胞免疫抗原结合反应，鉴定为典型正常的角膜上皮细胞。
3)致癌性采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》，结果无致癌性。
4)无菌检测按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
5)细胞存活率采用台盼蓝染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。
细胞存活率＝[(总细胞数-死细胞数)/总细胞数]×100％经测定，细胞存活率超过80％。
二、细胞培养传代细胞培养在细胞中加入Epilife，接种入35mm培养皿，在ThermoCO2培养箱，37℃，5％CO2下进行培养，每3天换液1次，在上皮细胞达到70％汇集细胞后传代，培养14天。
三、构建组织工程自体角膜上皮1.制备人纤维蛋白原用200ml血浆在4℃离心，3500转/min，离心30分钟，弃上清液，加10ml注射用水，制成悬浊液，保存备用。
2.构建角膜上皮采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为5mg/ml，加入2unit/ml人的凝血因子(购于Sigma公司)和2.5μmol/ml CaCl2，同时加入约40000个左右传代至第三代的细胞，室内温下混合，立刻倒入35mm的培养皿中，形成1mm厚的液体层。将培养皿放入37℃，5％CO2培养箱中20分钟后，加入1ml DMEM培养液即可。
四、使用方法和效果使用前，用不含血清的培养液冲洗三次。在角膜的移植前，需要眼外科医生对病人进行360度的环状的病变部位切除，将本发明组织工程自体角膜做四针缝合于环状切割部位，用隐形镜片压迫，将眼睑采用两针缝合，一周后拆除缝线，有新生的角膜上皮形成，角膜的功能和视力得到改善。
产品的储存和运输应在2℃-10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的环境中进行。
本发明主要应用于烧伤，化学烧伤，眼表皮肿瘤，过敏性、放射性损伤，遗传性眼病，眼表面化脓和其他眼综合症导致的眼角膜上皮细胞脱落，结膜覆盖于眼角膜表面而致的失明。
组织工程自体角膜上皮的临床报告一、诊断标准角膜缘干细胞缺乏诊断标准角膜缘新生血管生长或角膜上皮结膜化大于或等于一个象限。
角膜上皮长期缺损诊断标准角膜上皮缺损时间7天以上。
病因诊断1.酸、碱等化学烧伤及热烧伤；2.药物过敏；3.各种原因所致的角膜缘大量浅层新生血管；4.复发性翼状胬肉。
二、纳入病例标准1.符合角膜缘干细胞缺乏或角膜上皮长期缺损诊断标准。
2.患者年龄≥12岁，可配合各项检查。
3.单眼患病，对侧眼无明显眼病史。
4.签署知情同意书者。
5.基础泪液分泌试验≥5mm(滤纸统一规格)。
6.裂隙灯检查角膜及结膜无明显感染及免疫性炎症表现。
角膜新生血管位于上皮下及基质浅层(≤1/4角膜厚度)。
睑球粘连≤2个象限。
睑裂闭合完全。无眼睑内翻倒睫。
三、取材术前检查血、尿常规，肝、肾功能，澳抗，爱滋病抗体。
取材应在正规手术室内进行。
取材部位舌下口腔粘膜取1mm×1mm大小的组织块。另一侧正常眼角膜缘取1mm×1mm大小组织块。
四、实验室体外培养标本取材后立即置于保存液中，放在2℃-10℃的保温箱中运输及保存，于6小时内进行培养，以生物组织工程技术培养自体口腔粘膜/眼角膜缘干细胞，并符合其组织工程自体角膜上皮注册产品标准。
五、剔除病例标准口腔粘膜/眼角膜缘干细胞培养失败，培养所得的产品不符合产品标准者。
六、移植手术1.术前点用抗生素眼药水3天，4次/天。
2.手术应在正规手术室显微镜下进行。
3.角膜上皮刮除范围应大于病变2mm2。
4.移植片与植床应贴合紧密，不应有积血或积液残留。
5.以8-0可吸收线间断缝合固定植片。
6.如有睑球粘连，应将结膜与角膜组织彻底分离，充分止血并将结膜后退。
7.术毕，术眼涂点必舒眼膏并包扎。
七、术后处理1.连续包扎2天，第三天打开点药。
2.口服抗生素3天，打开包扎后点用点必舒液1周，4次/天。可同时点用人工泪液，但禁用上皮生长因子。
八、疗效评定标准(一)显效1.角膜新生血管减少在二级(含二级)以上或消失。
2.角膜上皮缺损修复在二级(含二级)以上或消失。
3.眼部自觉刺激症状减轻在二级(含二级)以上或消失。
(二)有效1.角膜新生血管减少在一级或以上。
2.角膜上皮缺损修复在一级或以上。
3.眼部自觉刺激症状减轻在一级或以上。
(三)无效各项指标未达到上述标准者。
显效、有效的判定标准至少满足第(1)条加第(2)或第(3)条。九、数据管理和统计1.数据收集所有入选病例均必须完成病例观察表，研究者将观察、检查结果及时、准确、完整、规范、真实地记录于病历及病例观察表中。
全部数据录入数据库并校对后，将数据库交统计分析人员进行统计分析，并提供统计报告，交临床试验的主要研究者写出临床总结报告。
2.统计分析根据数据性质，对基础资料数据、疗效分析(各指标分析)及安全性分析、分别进行统计描述。
计量数据统计方法观察组内前后变化情况采用配对样本t检验。
计数数据统计方法采用确切概率法。
等级型数据统计方法观察组内前后变化情况采用符号秩和检验。
3.统计软件所有的统计均利用SAS JMP5.0软件进行统计学分析，采用双侧检验，以P≤0.05作为有统计学意义。
十、结论本产品在北京市两家三甲医院进行了临床研究，共入选16例口腔粘膜为细胞来源的患者和18例角膜缘为细胞来源的患者，经六个月观察后评价其对于角膜上皮长期缺损和角膜缘干细胞缺乏患者的角膜刺激症、角膜上皮缺损、角膜新生血管以及视力的改善情况，各主要观察指标的疗效如下(一)口腔粘膜为细胞来源1.角膜刺激症状明显改善8例，改善6例，无改善2例，改善率87.5％；2.角膜上皮缺损明显改善8例，改善4例，无改善4例，改善率75％；3.角膜新生血管明显改善6例，改善5例，无改善5例，改善率68.75％；4.视力明显改善2例，改善2例，无改善12例，改善率25％。
总体评价显效(3)明显改善+(2)或(1)明显改善共计6例；有效(3)改善+(2)或(1)明显改善或改善共计4例；即总体有效10例，总有效率62.5％。
本说明书附图中3A-7A和3B-7B分别例举了口腔粘膜为细胞来源的患者术前和术后的眼角膜情况图以作说明，其中图3A和图3B来源于患者李××，女，32岁，诊断热烧伤，病程40天；图4A和图4B来源于患者闫××，女，38岁，诊断病毒性角膜炎致角膜上皮糜烂，病程34月；图5A和图5B来源于患者张××，男，28岁，复发性翼状胬肉，病程6月；图6A和图6B来源于患者常××，男，26岁，过氧乙酸烧伤，病程30天；图7A和图7B来源于患者张××，男，40岁，翼状胬肉，病程6月。
从图中可以看出在手术移植本发明的组织工程自体角膜后，患者的病情得到了改善。
(二)角膜缘为细胞来源1.角膜刺激症状明显改善8例，改善7例，无改善3例，改善率83.3％；
2.角膜上皮缺损明显改善8例，改善6例，无改善4例，改善率77.8％；3.角膜新生血管明显改善6例，改善7例，无改善5例，改善率72.2％；4.视力明显改善2例，改善3例，无改善13例，改善率27.8％。
总体评价显效(3)明显改善+(2)或(1)明显改善共计6例；有效(3)改善+(2)或(1)明显改善或改善共计7例；即总体有效13例，总有效率72.2％。
本说明书附图中8A-11A和8B-11B分别例举了角膜缘为细胞来源的患者术前和术后的眼角膜情况图以作说明，其中图8A和图8B来源于患者史××，男，40岁，诊断血管增生，病程3月；图9A和图9B来源于患者马××，女，28岁，诊断复发性翼状胬肉、血管增生，病程5个月；图10A和图10B来源于患者梅××，男，35岁，铁水烧伤，病程20天；图11A和图11B来源于患者尹××，男，46岁，碱烧伤，病程30个月。
从图中可以看出在手术移植本发明的组织工程自体角膜后，患者的病情得到了改善。
权利要求
1.一种自体角膜上皮的制备方法，包括如下步骤(a)原代培养患者自体的口腔粘膜组织或角膜缘组织的细胞3-15天；(b)对所得细胞进行传代扩增培养7-30天；以及(c)以纤维蛋白原为支架材料，与传代培养的细胞一起构建成组织工程角膜上皮。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所得到的组织工程角膜上皮在37℃，5％CO2下，继续培养5-45分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述自体口腔粘膜组织为取自患者自体舌下、面颊内侧或舌面的1-3平方毫米的组织块；角膜缘组织为取自患者正常眼角膜缘的1-2平方毫米大小的组织块。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用角膜培养液进行细胞的原代培养和传代培养，所述角膜培养液为DMEM或Epilife，或者是添加有以角膜培养液总量计的质量百分数为0.1-0.5％的脑垂体提取液、0.1-5ng/ml的上皮生长因子、0.05-0.5μg/ml的氢化可的松、1-20μg/ml的转铁蛋白以及1-20μg/ml的胰岛素的DMEM或Epilife。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述角膜培养液为添加有以角膜培养液总量计的质量百分数为0.3％的脑垂体提取液、3ng/ml的上皮生长因子、0.2μg/ml的氢化可的松、10μg/ml的转铁蛋白以及10μg/ml的胰岛素的DMEM或Epilife。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前，用庆大霉素消毒所述口腔粘膜组织或者所述角膜缘组织，其浓度为50-200mg/ml，再用0.05％的胰酶/EDTA液消化20分钟后，用DMEM冲洗组织2次。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，将组织块剪碎并均匀分布于培养容器的内部表面，加入角膜培养液进行原代培养，每2-3天更换一次培养液，培养时间为5-10天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，用角膜培养液在37℃，5％CO2下，每2-3天更换一次培养液，在细胞达到50％-90％汇集后传代，培养12-20天。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，以培养容器中待构建的体系的总体积为准，先将加量为1-8mg/ml的纤维蛋白原平铺于培养皿底面，然后再将加量为1-5单位/ml的人凝血因子、加量为1-5μmol/ml的钙离子和20000-80000个已传代的细胞，在室温下与铺好的纤维蛋白原混合均匀，使所得到的混合液体在培养容器中的厚度为0.5mm-1.5mm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，先将加量为5mg/ml的人纤维蛋白原平铺于培养皿底面，然后再将加量为2单位/ml的人凝血因子、加量为2.5μmol/ml的CaCl2和40000个已传代的细胞，在20-25℃下与铺好的人纤维蛋白原混合均匀，使混合液体在培养容器中的厚度为1mm。
全文摘要
本发明公开了一种自体角膜上皮的制备方法，包括如下步骤(a)原代培养患者自体的口腔粘膜组织或角膜缘组织的细胞3－15天；(b)对所得细胞进行传代扩增培养7－30天；(c)以纤维蛋白原为支架材料，与传代培养的细胞一起构建成组织工程角膜上皮。本发明方法在克服了现有技术的免疫排斥反应、非人类来源的传染和其生物支架不适于细胞均匀生长、降解慢等缺陷的同时，使得自体角膜的制备不受双侧角膜上皮缺损的限制，使患者在任何情况下都能得到适合的角膜。
文档编号C12N5/08GK1916166SQ200610128698
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年9月8日
发明者韩斌 申请人:北京赛尔泰和生物医药科技有限公司